一种血清氯检测试剂球及血清氯检测芯片

技术领域

本发明涉及血清氯检测技术领域，特别是涉及一种血清氯检测试剂球及血清氯检测芯片。

背景技术

血清氯是指血清中氯离子浓度。氯离子是人体细胞外液中主要的阴离子。血清氯的正常值范围为96.00～106.00mmol/L。血清氯升高常见于泌尿道阻塞或肾功能不良导致的氯化物排出减少、氯化物摄入过多或由换气过度引起的呼吸碱中毒而导致红细胞内的氯离子大量转出等。血清氯降低可见于严重呕吐、腹泻、急性肾炎或药物引起的稀释性低氯血症等。

氯离子与钠离子所产生的渗透压占细胞外液总渗透压的90％左右，在维持体内电解质平衡、酸碱平衡与渗透压平衡中起重要的作用，因此测定氯离子的含量具有重要的临床意义。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术中，酶法检测血清氯的技术在近年来发展迅速，并以其特异性高、稳定性好、检测速度快及结果准确等优点成为人们研究的方向。然而，酶法检测血清氯的成本较高。

发明内容

为了降低测定血清氯的检测成本，本发明实施例提供一种血清氯检测试剂球及血清氯检测芯片，能够以2-氯-4-硝基苯酚麦芽二糖苷作为反应底物，并通过使用单一的α-淀粉酶实现血清氯的检测，以减少试剂的使用，从而节约检测成本。

为了解决上述技术问题，本发明实施例提供以下技术方案：

第一方面，本发明实施例提供一种血清氯检测试剂球，所述血清氯测试剂球包括由第一试剂制备而成的第一试剂球和由第二试剂制备而成的第二试剂球；

所述第一试剂包括以下组分：

第一缓冲液 20-100mmol/L；

α-淀粉酶 10-50KU/L；

第一赋形剂 100-200g/L；

所述第二试剂包括以下组分：

第二缓冲液 20-100mmol/L；

2-氯-4-硝基苯酚麦芽二糖苷 10-50g/L；

第二赋形剂 100-200g/L。

可选的，所述第一试剂还包括10-50g/L的第一稳定剂，所述第二试剂还包括10-50g/L的第二稳定剂。

可选的，所述第二试剂还包括钙盐。

可选的，所述钙盐在所述第二试剂中的含量为1-10g/L。

可选的，所述第一试剂和/或所述第二试剂的PH值为6.0-11.0。

可选的，所述第一试剂球和所述第二试剂球为冻干试剂球。

可选的，所述第一缓冲液或所述第二缓冲液为磷酸盐缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的至少一种。

可选的，所述第一稳定剂或所述第二稳定剂包括乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、乙二胺四乙酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖和麦芽糖中的至少一种。

可选的，所述第一赋形剂或所述第二赋形剂包括甘露醇、海藻糖、葡聚糖一万、葡聚糖四万和聚乙二醇中的至少一种。

第二方面，本发明实施例还提供一种血清氯检测芯片，所述血清氯检测芯片包括芯片本体和设置与所述芯片本体的如第一方面所述的血清氯检测试剂球。

本发明实施方式的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明实施例提供了一种血清氯检测试剂球及血清氯检测芯片，由于血清氯检测试剂球包括α-淀粉酶和2-氯-4-硝基苯酚麦芽二糖苷，在进行血清氯检测的过程中，检测样本中的氯离子能够激活α-淀粉酶；在激活后的α-淀粉酶的催化下，2-氯-4-硝基苯酚麦芽二糖苷解离生成2-氯-4-硝基酚(CNP)和麦芽二糖(G2)，由于CNP的吸收峰在405nm处，故连续监测405nm吸光度的变化可直接反映CNP的生成量，进而计算出检测样本中氯离子的浓度。本发明有效地简化了用于检测血清氯的检测试剂和反应过程，降低检测成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的一个实施例提供血清氯检测芯片的临床相关性分析图；

图2是本发明的一个实施例提供的血清氯检测芯片的线性范围分析图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

需要说明的是，如果不冲突，本发明实施例中的各个特征可以相互组合，均在本发明的保护范围之内。另外，虽然在装置示意图中进行了功能模块的划分，在流程图中示出了逻辑顺序，但是在某些情况下，可以以不同于装置示意图中的模块划分，或流程图中的顺序执行所示出或描述的步骤。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

目前血清氯的测定方法主要有放射性核素稀释法、电量分析法、分光光度法、离子选择电极法(ISE法)、硝酸汞滴定法、硫氰酸汞比色法和酶法。

电量分析法属于物理学方法，该方法是在恒定电流下，通过放置于检测样本中的银电极释放的银离子与氯离子反应，生成氯化银沉淀。当氯离子反应完毕后，溶液中出现游离的银离子，使溶液的电导明显增加，从而指示反应终止。该方法存在离子特异性较差的缺点，易受卤族元素的干扰。

离子选择电极法是目前临床广为使用的方法，可与钠、钾离子电极配套使用，但电极普遍存在寿命较短的问题，需要经常更换，成本较高。

硝酸汞滴定法的原理是汞离子先与检测样本中的氯离子结合，生成氯化汞；此时，硝酸汞不与二苯胺脲结合。滴定达到终点时，过量硝酸汞与二苯胺脲结合生成淡蓝色的二苯胺脲汞。该方法需要操作人员熟练操作、难以判断滴定终点，且检测结果会受到胆红素、血红蛋白和血脂的干扰。

酶法检测技术在近年来发展迅速，该方法具有特异性高、稳定性好、检测速度快和检测精度高等优点。然而现有的酶法检测技术使用的酶的种类繁多且反应复杂，导致测定成本较高且各试剂间容易交叉影响影响检测结果的精确度。基于此，本发明实施例提供一种血清氯检测试剂球及血清氯检测芯片，能够以2-氯-4-硝基苯酚麦芽二糖苷作为反应底物并通过使用单一的α-淀粉酶实现血清氯的检测，从而简化血清氯检测涉及的检测试剂和化学反应，降低检测成本。为了便于读者理解本发明，下面结合具体的实施例进行说明。

本发明实施例提供一种血清氯检测试剂球，该血清氯检测试剂球包括第一试剂球和第二试剂球，其中，第一试剂球由第一试剂制得，第二试剂球由第二试剂制得。第一试剂包括以下组分：20-100mmol/L的第一缓冲液，10-50KU/L的α-淀粉酶和100-200g/L的第一赋形剂；其中，α-淀粉酶处于未激活状态。第二试剂包括以下组分：20-100mmol/L的第二缓冲液、10-50g/L的2-氯-4-硝基苯酚麦芽二糖苷和100-200g/L的第二赋形剂。

本发明实施例提供的血清氯检测试剂球的检测原理如下：在进行血清氯检测的过程中，检测样本中的氯离子能够使α-淀粉酶从未激活状态转变为激活状态；在激活后的α-淀粉酶的催化下，2-氯-4-硝基苯酚麦芽二糖苷解离生成2-氯-4-硝基酚(CNP)和麦芽二糖(G2)，由于CNP的吸收峰在405nm处，故连续监测405nm吸光度的变化可直接反映CNP的生成量，进而计算出检测样本中氯离子的浓度。

本发明实施例采用分子量小的2-氯-4-硝基苯酚麦芽二糖苷作为底物，不需使用除α-淀粉酶之外的其他酶，例如，无需使用葡萄糖苷酶，检测方法经济有效。同时，也避免了由于酶的种类繁多而导致的血清检测试剂稳定性较差的问题。另外，本发明实施例提供的血清氯检测试剂球还可放置于检测芯片(微流控芯片)内，通过即时检验(POCT)仪器即可帮助患者实现快速诊断，测试时间短且操作简便。不需依赖大型全自动生化分析仪即可实现血清氯快速准确的诊断。

在一些实施例中，血清氯检测试剂球中还包括第一稳定剂和/或第二稳定剂，稳定剂可以有效地提高血清氯检测试剂球的稳定性。本发明实施例中的第一稳定剂和第二稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、乙二胺四乙酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽中、乳糖和麦芽糖中的一种或两种。可选的，第一稳定剂和第二稳定剂的含量具体可以是10-50g/L。

在一些实施例中，第二试剂中还包括钙盐，钙盐与氯离子同为α-淀粉酶的激动剂，用于增强α-淀粉酶的活性。例如，钙盐为可溶性钙盐，例如，醋酸钙或乳酸钙等。第二试剂中钙盐的含量具体可以是1-10g/L。

缓冲液是指由弱酸及其盐或弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消或减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的PH值的相对稳定。本发明实施例中的第一缓冲液和第二缓冲液为磷酸盐缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的至少一种。

赋形剂能够赋予冻干试剂球良好的外观，使冻干试剂球疏松多孔，易于复溶。赋形剂主要包括多元醇类、糖类、氨基酸类、无机盐类以及蛋白质和肽类赋形剂。多元醇类赋形剂包括甘油、山梨醇、甘露醇、肌醇、侧金盏花醇、乙二醇和聚乙二醇等。糖类赋形剂包括单糖类赋形剂、二糖类赋形剂和多糖类赋形剂；其中，单糖类赋形剂包括葡萄糖；二糖类赋形剂包括蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖等；多糖类赋形剂包括水溶性淀粉、麦芽糊精和葡聚糖等，葡聚糖可以是葡聚糖1万、葡聚糖2万、葡聚糖4万或葡聚糖7万中的一种或多种。氨基酸类赋形剂包括：谷氨酸钠、脯氨酸、赖氨酸和丙氨酸等；无机盐类赋形剂包括：磷酸盐、碳酸钙、硫酸锰、胆酸钠和乙酸钠等；蛋白质和肽类赋形剂包括粘多糖蛋白、酪蛋白或牛血清蛋白等。

本发明实施例中，相对于其他种类的赋形剂而言，当第一赋形剂或第二赋形剂为甘露醇、海藻糖、葡聚糖一万、葡聚糖四万或聚乙二醇中的至少一种时，第一试剂球或第二试剂球的外观较佳。

在一些实施例中，第一试剂球和第二试剂球均为冻干试剂球，冻干试剂球的制备方法包括如下步骤：

S11、将检测试剂的液滴滴在液氮中，使检测试剂的液滴形成冰球；

例如，可以通过点胶机将各种检测试剂(如：第一试剂和第二试剂)的液滴滴在液氮中，使检测试剂的液滴在液氮中凝结成冰球。本领域技术人员可以根据实际需要调整滴入液氮中的混合液的液滴的大小，并通过控制液滴的大小来调整冰球的体积。可选的，在一些实施例中，冰球的体积为2.5-3.5ul，例如，可以是2.5μl、3μl或3.5μl。

在一些实施例中，第一试剂的配置方便法如下：在1升烧杯中加入800毫升的蒸馏水，称取第一缓冲液成分，待溶解完全后加入第一稳定剂，调节pH至6.0-11.0，再加入α-淀粉酶，最后加入第一赋形剂，定容至1升。

在一些实施例中，第二试剂的配置方法如下：在1升烧杯中加入800毫升的蒸馏水，称取第二缓冲液成分，待溶解完全后依次加入第二稳定剂、钙盐，调节PH至6.0-11.0，再加入2-氯-4-硝基苯酚麦芽二糖苷，最后加入第二赋形剂，定容至1升。

S12、将冰球进行冷冻干燥制得冻干试剂球；

本实施例中，将冰球置于真空冷冻干燥机进行冷冻干燥形成冻干试剂球，待氮气复压后将冻干试剂球收集并保存在干燥的铝瓶中。

冷冻干燥是指将含水的第一试剂或第二试剂预先进行降温冻结成固体冰球，在低温减压条件下利用水的升华性能，冰球低温脱水而达到干燥目的的一种干燥方法。冷冻干燥后，第一试剂中的第一缓冲液、α-淀粉酶和第一赋形剂留在冻结时的冰架中形成第一试剂球；同样，第二试剂中的第二缓冲液、2-氯-4-硝基苯酚麦芽二糖苷和第二赋形剂也留在冻结时的冰架中形成第二试剂球。因此，冷冻干燥后的冻干试剂球疏松多孔，且其体积与冻干前基本保持不变。由于冻干试剂球干燥前始终处于冻结状态，同时冰晶均匀分布于第一试剂或第二试剂的各组份中。升华过程中，各组份不会因脱水而发生浓缩现象。故冷冻干燥后的冻干试剂球呈海绵状疏松多孔，极易溶于水而恢复原状。

本发明实施例还提供一种血清氯检测芯片，该血清氯检测芯片包括芯片本体和上述实施例提供的血清氯检测试剂球。芯片本体上开设有比色孔，血清氯检测试剂球收容于比色孔中。

在一些实施例中，血清氯检测芯片还包括样本孔、稀释液孔、样本槽、稀释液槽、样本定量槽、稀释液定量槽和混合槽。使用该血清氯检测芯片进行测试时，无需对检测样本进行离心处理即可进行检测，因此，血清、血浆和全血都可以用于检测。具体可以通过移液器将血清样本(即，检测样本)从样本孔加入样本槽，再撕开稀释液槽的封口膜，采用离心的方式使预存的稀释液从稀释槽进入稀释液定量槽，使所述血清样本从样本槽进入样本定量槽，以及使稀释液定量槽中的稀释液和样本定量槽中的血清样本进入混合槽，以通过稀释液稀释血清样本。再通过离心的方式使混合槽中稀释后的血清样本填充到比色孔中，待稀释后的血清样本与比色孔中的所述冻干试剂球充分反应后，采用分光光度计测试所述比色孔中溶液的吸光度。具体的，稀释液可以是蒸馏水。

为进一步阐述本发明的技术方案，以下提供本发明的血清总氯测定试剂制备方法的若干实施例。

血清氯检测芯片包括第一试剂球和第二试剂球。

第一试剂包括以下组分：20mmol/L的MES缓冲液，10g/L的麦芽糖，15g/L的牛血清白蛋白，10KU/L的α-淀粉酶，150g/L的甘露醇和10g/L的葡聚糖一万。第一试剂的pH值为6.0。

第二试剂包括以下组分：

20mmol/L的MES缓冲液，15g/L的乙二胺四乙酸，20g/L的牛血清白蛋白，10g/L的3-氯-4-硝基苯酚麦芽二糖苷，1g/L的醋酸钙和100g/L的海藻糖。第二试剂的pH值为6.0

本实施例与实施例1的区别如下：

第一试剂包括以下组成：100mmol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液，50g/L的乙二胺四乙酸，50KU/L的α-淀粉酶和150g/L的海藻糖。第一试剂pH值为9.0

第二试剂包括以下组成：100mmol/L甘氨酸-NaOH缓冲液：100mmol/L乙二胺四乙酸：50g/L的4-氯-4-硝基苯酚麦芽二糖苷，10g/L的醋酸钙，200g/L的甘露醇和10g/L的聚乙二醇3350。第二试剂的pH值为9.0。

下面结合表格对本发明实施例1所得的血清氯检测芯片的性能进行说明。需要说明的是，本发明实施例使用便携式生化分析仪测定37℃下，注入检测样本(即，血清样本)的测定芯片吸光度的变化值；并且，使用英国朗道公司提供的校准品进行定标，可计算得到检测样本中血清氯的浓度。

(1)、精密度测试：采用本发明实施例1提供的血清氯检测芯片测试已知血清氯浓度为100mmol/L的检测样本中的血清氯浓度20次，并通过以下公式计算测得浓度值的平均值

其中，X

得到测试同一检测样本20次获得的测得浓度值的平均值

(2)、准确度测试：采用本发明实施例1提供的血清氯检测芯片测试已知血清氯浓度为119mmol/L的检测样本三次，获取测得的血清氯浓度值，计算出3次测得血清氯浓度值的平均值为121mmol/L，相对偏差为1.68％。

(3)临床相关性分析：

采用本发明实施例1提供的血清氯检测芯片与Abaxis试剂盘同时测定多个血清氯浓度不同的检测样本的血清氯含量。相应的测得血清氯浓度值(单位mmol/L)如表一所示，表一中，X列数值为Abaxis试剂盘测得的血清样品中的血清氯浓度，Y列数值为本发明实施例1提供的血清氯检测芯片测得的血清样品中的血清氯浓度。例如，对于1号检测样本，采用为Abaxis试剂盘测试的血清氯的浓度为119mmol/L，而采用本发明实施例1提供的血清氯检测芯片测试的1号血清样本中的血清氯浓度为116mmol/L。

根据表一中的数据作图并得到图1，如图1所示，本发明实施例提供的血清氯检测芯片与Abaxis试剂盘的两组测试结果之间的相关方程如下：

y＝1.0026x+0.2503

相关系数R＝0.9860，相关系数越接近1代表两组数据之间的相关性越强。因此，本发明实施例提供的血清氯检测芯片与Abaxis试剂盘的测试结果相关性强。

表一：血清氯检测试剂盒的临床相关系分析表。

(4)、线性范围测试

测试方法如下：用接近线性范围([80，135]mmol/L)上限的高浓度(活性)样本和接近线性范围下限的低浓度(活性)样本，按表二所示，将高浓度检测样本和低浓度检测样本以不同比例混合成6个稀释浓度的检测样本。6个检测样本中血清氯含量分别为60mmol/L、76mmol/L、92mmol/L、108mmol/L、124mmol/L和140mmol/L。由于低浓度(活性)样本难以收集，可以以较低浓度的氯化钠溶液代替。

表二：

采用本发明实施例1提供的血清氯检测芯片分别测试6个检测样本的血清氯浓度，每个检测样本测试3次，分别求出6个检测样本中血清氯测得浓度值的平均值(y

其中，n为测定样品的数量，x

如图2所示，得到的线性回归方程为y＝0.9728x+2.7221，相关系数R＝0.9985。

通常，当试剂盒检测血清氯浓度在[80，135]mmol/L区间内的检测样本时，其线性相关系数R≥0.990，则满足要求。故，本发明实施例提供的血清氯检测试剂球具备线性范围宽的特点。

(5)、热稳定性测试

在8％空气湿度环境中，将本发明实施例1提供的血清氯检测试剂球装入芯片本体内形成多个检测芯片，并装入铝箔袋进行密封。

将实施例1提供的多个检测芯片在37℃避光环境中贮存0、2、3、4、6和8天后，分别对英国朗道公司提供的两组校准品(样本1和样本2)中的血清氯浓度进行多次检测，以分析多次检测的结果的平均值和相对偏差(单位为mmol/L)，从而分析检测芯片的检测准确度，检测结果请参阅表三和表四。为了确保检测结果的准确度，相对偏差的绝对值应在±10.0％以内。

表三和表四分别为存储不同时间后的检测芯片对样本1和样本2中血清氯浓度检测3次的检测结果，以及计算出的检测结果的平均值和相对偏差，其中，各个表中的靶值为相应地为样本1和样本2中血清氯的实际浓度。为了确保检测结果的准确度，相对偏差的绝对值应在10.0％以内。从表三和表四中可以看出，本发明实施例提供的检测芯片在37℃环境中储存2、3、4、6或8天后检测结果的相对偏差的绝对值仍在±10.0％以内，因此，本实施例提供的检测芯片热稳定性好。

表三：热稳定性分析表。

表四：热稳定性分析表。

(6)长期稳定性测试

将实施例1提供的多个检测芯片在2-8℃避光环境中贮存避光环境中贮存0、3、6、9、12和15个月后，分别对英国朗道公司提供的两组校准品(样本3和样本4)中的血清氯浓度进行多次检测，以分析多次检测的结果的平均值和相对偏差(单位为mmol/L)，从而分析检测芯片的检测准确度，检测结果请参阅表五和表六。

表五：长期稳定性分析表。

表六：长期稳定性分析表。

表五和表六分别为存储不同时间后的检测芯片对样本3和样本4中血清氯浓度检测3次的检测结果，以及计算出的检测结果的平均值和相对偏差，其中，各个表中的靶值相应地为样本3和样本4中血清氯的实际浓度。表五和表六中可以看出，本发明实施例提供的检测芯片在2-8℃环境中存储3、6、9、12和15个月后，检测结果的相对偏差的绝对值仍在±10.0％以内，因此，本实施例提供的检测芯片的长期定性好，在2-8℃环境中长期储存后仍能确保其检测结果的准确性。

(7)抗干扰能力测试

取同批次同一患者的血清样本，分为对照组和实验组，其中，对照组无人为添加的干扰物，而实验组分别添加如表七所示的六种干扰物质。采用本发明实施例提供的血清氯检测芯片，分别对实验组和对照组的检测样本进行检测。每个检测样本重复检测三次，检测结果取平均值。对照组血清氯的测得浓度为104mmol/L，实验组的测定结果表七。表七中相对偏差(％)＝(实验组的测得值－对照组的测得值)/对照组测得值×100％。

从表七可以看出，实验组测得的血清氯的浓度与对照组测得的血清氯的浓度之间的偏差均不超过±10.0％。本发明实施例提供的血清氯检测试剂球和检测芯片对抗坏血酸、胆红素、血红蛋白、甘油三酯、溴离子和硫氰酸钾均具有较强的抗干扰能力。

表七：抗干扰能力分析表。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明，它们没有在细节中提供；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。