用于抑制神经细胞变性的组合物

技术领域

本发明涉及用于抑制神经细胞变性的组合物等。需要说明的是，本说明书中记载的全部文献的内容通过参照而引入本说明书。

背景技术

已知神经细胞变性会导致运动障碍的发生。例如，帕金森病是以中脑黑质-纹状体多巴胺能神经变性为特征的进行性神经变性疾病，会产生手足震颤、肌肉僵硬等运动功能障碍。但是，其变性、丢失的原因尚未阐明。多巴胺不稳定，会因自氧化而产生活性氧，因此一般认为活性氧与多巴胺能神经变性有关。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Singhuber J,Baburin L,Khom S et al.:GABAA receptormodulators from the Chinese herbal drug junci medulla-the pith of juncuseffuses.Planta med 78:455-458(2012)

非专利文献2：Wang YG,Wang YL,Zhai HF et al.:Phenanthrens from juncuseffusus with anxiolytic and sedative activities.Nat Prod Res.26:1234-1239(2012)

非专利文献3：Liao YJ,Zhai HF,Zhang B et al.:Anxiolytic and sedativeeffects of dehydroeffusol from juncus effusus in mice.Planta med.77:416-420(2011)

非专利文献4：Haruna Tamano,Ryusuke Nishio,Hiroki Morioka,AtsushiTakeda:Mol.Neurobiol.,56,435-443(2019).

非专利文献5：Haruna Tamano,Hiroki Morioka,Ryusuke Nishio,AzusaTakeuchi,Atsushi Takeda:Mol.Neurobiol.,56,4539-4548(2019).

非专利文献6：Haruna Tamano,Ryusuke Nishio,Hiroki,Morioka,Ryo Furuhata,Yuuma Komata,Atsushi Takeda:Mol.Neurobiol.,56,7789-7799(2019).

发明内容

本发明人们建立了如下假说：作为活性氧(Reactive Oxygen Species；ROS)的过氧化氢的产生所引起的、细胞内Zn

因此，本发明人们认为，通过开发抑制神经细胞变性的手段，可能能够治疗由该神经细胞变性引起的病情，以开发出这样的手段为目标进行了反复研究。

本发明人们发现，厄弗酚(Effusol)和脱氢厄弗酚能发挥神经细胞变性抑制效果，进一步反复进行了改良。

本发明例如包括以下项中所记载的主题。

项1.

一种用于抑制神经细胞变性的组合物，其含有厄弗酚和/或脱氢厄弗酚。

项2.

根据项1所述的组合物，其中，神经细胞为多巴胺神经细胞。

项3.

根据项2所述的组合物，其用于发生了多巴胺神经细胞变性的对象。

项4.

根据项1～3中任一项所述的组合物，其用于改善由神经细胞变性引起的运动障碍。

项5.

根据项1～4中任一项所述的组合物，其用于治疗帕金森病。

根据本发明所包括的组合物、方法等，能够抑制神经细胞变性。由此，可期待由神经细胞变性引起的病情(例如运动障碍)的恢复。

附图说明

图1：示出利用荧光试剂测定将用于制作帕金森病模型的6-OHDA与厄弗酚或脱氢厄弗酚一起给药于大鼠单侧黑质致密部时的、细胞内活性氧(ROS)量而得的结果。

图2：示出利用荧光试剂测定将用于制作帕金森病模型的6-OHDA与厄弗酚或脱氢厄弗酚一起给药于大鼠单侧黑质致密部时的、细胞内过氧化氢量而得的结果。

图3：示出利用荧光试剂测定将用于制作帕金森病模型的6-OHDA与厄弗酚或脱氢厄弗酚一起给药于大鼠单侧黑质致密部时的、细胞内Zn

图4：示出利用酪氨酸羟化酶(TH)免疫染色测定将用于制作帕金森病模型的6-OHDA与厄弗酚或脱氢厄弗酚一起给药于大鼠单侧黑质致密部时的、已变性的神经细胞量而得的结果。

图5：示出对灯芯草全草50％乙醇水溶液提取液或灯芯草芯50％乙醇水溶液提取液进行HPLC分析而得的色谱图。

具体实施方式

以下对本发明所包括的各实施方式进一步进行详细说明。本发明优选包括用于抑制神经细胞变性的组合物等，但是当然不限于此，本发明包括本说明书中公开的、本领域技术人员所能意识到的全部发明。

本发明所包括的神经细胞变性抑制组合物含有选自由厄弗酚和脱氢厄弗酚组成的组中的至少1种化合物。有时将该组合物称为本发明的组合物。

厄弗酚为以下结构式所示的化合物。

本发明的组合物中使用的厄弗酚可以是合成品，也可以是对自然界中存在的厄弗酚进行提取和纯化而得的。可以利用公知的方法或可由公知的方法容易地想到的方法而合成得到。另外，也可以购买市售品来使用。在从自然界得到时，例如，已知灯芯草(rushgrass)中存在厄弗酚，可以从灯芯草中提取，并根据需要进行纯化而得到。例如，可以利用水、甲醇、乙醇、或这些中的至少2种的混合液等来进行提取，并根据需要进行纯化而得到。作为该提取液，没有特别限制，优选甲醇、或40～60％乙醇水溶液。另外，可以根据需要进一步对得到的提取液进行进一步分级和/或纯化。分级例如可以通过液液分配萃取来进行。该分配例如可以使用水、正己醇和乙酸乙酯等来进行。另外，纯化例如可以通过硅胶柱色谱和/或高效液相色谱(HPLC)来进行。更详细而言，可列举例如下述方法：对灯芯草的甲醇提取液进行减压浓缩，用水和正己醇进行液液分配萃取，向得到的水层中进一步加入乙酸乙酯进行液液分配萃取，通过色谱(硅胶柱色谱和高效液相色谱)对乙酸乙酯层进行纯化。需要说明的是，供于提取的灯芯草的部分也没有特别限制，例如，可以将灯芯草的全草供于提取，也可以将灯芯草的芯供于提取。

另外，脱氢厄弗酚为以下结构式所示的化合物。

本发明的组合物中使用的脱氢厄弗酚可以是合成品，也可以是对自然界中存在的厄弗酚进行提取和纯化而得的。可以利用公知的方法或可由公知的方法容易地想到的方法而合成得到。在从自然界得到时，例如，已知灯芯草(rush grass)中存在脱氢厄弗酚，可以从灯芯草中提取(和根据需要进行纯化)而得到。更详细而言，例如，可以从灯芯草中利用水、乙醇、或这些的混合液进行提取而得到。作为该提取液，特别优选40～60％乙醇水溶液，特别优选50％乙醇水溶液。另外，可以根据需要进一步对得到的提取液进行进一步分级和/或纯化。分级例如可以通过液液分配萃取来进行。该分配例如可以使用水和乙酸乙酯来进行。另外，纯化例如可以通过高效液相色谱(HPLC)来进行。另外，供于提取的灯芯草的部分也没有特别限制，例如，可以将灯芯草的全草供于提取，也可以将灯芯草的芯供于提取。灯芯草的芯中存在较多的脱氢厄弗酚，因此特别优选使用灯芯草的芯。

本发明的组合物可用于抑制神经细胞(特别是脑神经细胞)变性。其中，优选用于抑制多巴胺神经细胞变性。另外，神经细胞变性包括神经细胞受到损伤的情况之类的全部情况，例如，包括神经细胞丢失、神经细胞死亡等。

另外，如上所述，神经细胞变性会导致运动功能障碍的发生，因此，通过利用本发明的组合物抑制神经细胞变性，还可期待运动功能障碍的改善。因此，本发明的组合物也可以用于改善由神经细胞变性引起的运动障碍的用途。特别地，可以优选用于治疗帕金森病。

需要说明的是，本发明的组合物的应用对象优选为发生了神经细胞(特别是多巴胺神经细胞)变性的对象，进而，更优选发生了运动功能障碍的对象。另外，使用对象不限于人。例如，也可以用于非人哺乳动物。特别优选作为宠物和家畜而饲养的哺乳动物。具体而言，可例示狗、猫、猴、牛、马、绵羊、山羊、猪、兔子、小鼠、大鼠、骆驼、羊驼等。

生物提取物(优选为灯芯草提取物)本身也包含在本发明的组合物中。即，含有厄弗酚和/或脱氢厄弗酚的生物提取物(和根据需要进行了纯化者、或根据需要进一步配合了其它成分者)只要可发挥效果，则也包含在本发明的组合物中。

另外，本发明的组合物当然没有特别限定，但优选为经口组合物或注射组合物。为注射组合物的情况下，作为其给药方法，可例示经血管给药(例如经静脉给药或经动脉给药)或直接给药于脑或脊髄的方法。另外，为经口组合物的情况下，例如可以如下述那样以经口药物组合物或食品组合物形式使用。

需要说明的是，厄弗酚和脱氢厄弗酚虽然是具有菲骨架的化合物，但是，据报道作为具有菲骨架的化合物的吗啡可通过血脑屏障，另有报道指出脱氢厄弗酚可能也能通过血脑屏障(上述非专利文献3)。进而，厄弗酚虽然为不溶于水的脂溶性成分，但是其脂溶性不像脂肪酸那么高，可以称为适合于通过血脑屏障的脂溶性。综上，认为厄弗酚和/或脱氢厄弗酚例如即使是通过经口给药或经血管给药也能到达脑部而发挥效果。

本发明的组合物可以优选以药物组合物或食品组合物形式使用。以药物组合物形式使用时，该组合物(有时记作“本发明的药品组合物”)中可以配合有厄弗酚和/或脱氢厄弗酚(或者含有厄弗酚和/或脱氢厄弗酚的生物提取物)以及根据需要的药学上允许的基剂、载体、添加剂(例如赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、溶剂、甜味剂、着色剂、矫味剂、矫臭剂、表面活性剂、保湿剂、保存剂、pH调节剂、增稠剂等)等。这样的基材、载体、添加剂等例如在药品添加物辞典2016(株式会社药事日报社)等中有具体的记载，例如可以使用其中所记载者。另外，制剂方式也没有特别限定，可利用常规方法将有效成分与其它成分混合，制成例如片剂、包衣片剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、胶囊剂、丸剂、液体剂、悬浮剂、乳剂、凝胶剂、咀嚼剂、软片剂(soft tablet)等制剂。例如片剂的制造可通过压片法来进行。可以使用将混合后的原料直接进行压片的直接压片法、将混合后的原料制成颗粒后再进行压片的颗粒压片法中的任一方法。另外，例如，为胶囊剂的情况下，可以为软胶囊和硬胶囊中的任一种。

本发明的药物组合物中的厄弗酚和/或脱氢厄弗酚的配合量只要可发挥记忆障碍预防或改善效果就没有特别限定，可根据对象适宜设定。优选为0.0005～100质量％、更优选为0.005～90质量％、进一步优选为0.05～80质量％。需要说明的是，下限可以为10质量％、20质量％、30质量％、40质量％、50质量％、60质量％、70质量％、或80质量％左右。

本发明的药物组合物的给药时期没有特别限定，例如，可考虑制剂方式、给药对象的年龄、给药对象的症状的程度等来适宜选择给药时期。需要说明的是，给药方式没有特别限定，优选经口给药和经血管给药(经静脉给药、经动脉给药)。

本发明的药物组合物的给药量可根据给药对象的年龄、给药对象的症状的程度、其它条件等适宜选择。特别地，可以以所含的厄弗酚和/或脱氢厄弗酚的量为基准在不损害效果的范围内适宜设定。虽然没有特别限制，但是例如成人每天所给药的厄弗酚和/或脱氢厄弗酚的量优选为0.5～100mg左右，更优选为1～50mg左右，进一步优选为5～30mg左右、6～24mg左右、10～24mg左右、或12～24mg左右。需要说明的是，可以1天1次或分为数次(优选为2～3次)地给药。在非人哺乳动物的情况下，也可以参考所述人类的情况来适宜设定给药量。

在以食品组合物(例如饮食品、食品添加物)形式使用本发明的组合物时，该组合物(以下有时记作“本发明的食品组合物”)中可以配合有厄弗酚和/或脱氢厄弗酚(或者含有厄弗酚和/或脱氢厄弗酚的生物提取物)以及食品卫生学允许的基剂、载体、添加剂、其它可用作饮食品的成分/材料等。例如，可例示出含有厄弗酚和/或脱氢厄弗酚的用于记忆障碍预防或改善的加工食品、饮料、健康食品、功能性食品、营养辅助食品、补充剂、保健功能食品、特定保健用食品、营养功能性食品、功能性标示食品、或病人用食品(医院饮食、病人饮食或看护饮食等)等食品组合物。虽然没有特别限制，但在该食品组合物中配合的厄弗酚和/或脱氢厄弗酚为生物提取物(优选为灯芯草提取物)时，例如可以为配合有该提取物的加工食品、健康食品、营养功能食品、特定保健用食品、补充剂、病人用食品等。另外，在将厄弗酚和/或脱氢厄弗酚制成例如粉末状等时，可以包含在饮料类(果汁等)、点心类、面包类、汤类(包括汤粉末等)、加工食品等各种饮食品中。需要说明的是，医院饮食是住院时医院所提供的饮食，病人饮食是病人用的饮食，看护饮食是被看护者用的饮食。本发明的食品组合物尤其可以优选用作住院、家庭休养等的患者、或接受看护的患者中的感觉到记忆障碍的对象用的医院饮食、病人饮食或看护饮食。

在以健康食品(营养功能食品、特定保健用食品等)、补充剂形式制备本发明的食品组合物时，为了容易持续地摄取，优选制备成例如颗粒、胶囊、片剂(包括咀嚼剂等)、饮料(饮用剂)等形态，其中从摄取简便的角度出发优选胶囊、片(タブレット)、片剂(錠剤)的形态。但是不特别限定于这些。颗粒、胶囊、片剂等形态的本发明的食品组合物可以使用药学上和/或食品卫生学上允许的载体等按照常规方法来适宜制备。另外，制备成其它形态时，按照现有方法即可。

本发明的食品组合物中的厄弗酚和/或脱氢厄弗酚的配合量只要可发挥效果就没有特别限制。优选为0.0005～100质量％、更优选为0.005～90质量％、进一步优选为0.05～80质量％。需要说明的是，下限可以为10质量％、20质量％、30质量％、40质量％、50质量％、60质量％、70质量％、或80质量％左右。

本发明的食品组合物的摄取量、摄取对象等例如优选与上述的本发明的药物组合物相同。

本发明还包括：用于抑制神经细胞变性的组合物的制造方法，其包括配合厄弗酚和/或脱氢厄弗酚的工序；以及，通过给药厄弗酚和/或脱氢厄弗酚(优选上述的含有厄弗酚和/或脱氢厄弗酚的用于抑制神经细胞变性的组合物)来抑制神经细胞(尤其是脑神经细胞、特别是多巴胺神经细胞)变性的方法、以及改善运动功能障碍的方法；等。这些方法中的各种条件如上所述。

需要说明的是，本说明书中“包含”还包括“实质上由……构成”和“由……构成”(The term"comprising"includes"consisting essentially of”and"consisting of.")。另外，本发明包括全部的、本说明书中说明的构成要件的任意组合。

另外，上述针对本发明的各实施方式而说明的各种特性(性质、结构、功能等)在确定本发明所包括的主题时，可以任意地进行组合。即，本发明中包括全部的、由本说明书中记载的可组合的各特性的所有组合构成的主题。

以下示出例子来更具体地说明本发明的实施方式，但是本发明的实施方式不受下述例子限定。需要说明的是，大鼠使用了购自日本SLC株式会社的Wistar系大鼠。

制备了(i)含有800μM 6-羟基多巴胺(6-OHDA；购自SIGMA-ALDRICH)的生理盐水、(ii)含有800μM 6-OHDA和200μM厄弗酚的生理盐水、或(iii)含有800μM 6-OHDA和200μM脱氢厄弗酚的生理盐水，用于以下研究中。

(实验1)用50分钟将1μL 6-OHDA(800μM)与厄弗酚(200μM)或脱氢厄弗酚(200μM)一起给药于大鼠脑部的单侧黑质致密部。给药具体而言如下进行：在经麻醉的大鼠的颅骨上开孔，将注射套管(内径：0.15mm、外径：0.35mm)插入黑质致密部而进行。给药结束起10分钟后，通过APF(Aminophenyl Fluorescein，氨基苯基荧光素)的荧光来测定黑质细胞内ROS水平，结果6-OHDA单独给药的情况下，与生理盐水(对照)给药相比，细胞内ROS(活性氧)水平显著上升，该上升可被厄弗酚或脱氢厄弗酚的同时给药抑制(图1)。需要说明的是，AFP通过与活性酶反应而显示强荧光。另外，图1中的图是将显微镜照片中的白色虚线所包围的部分的荧光强度(相对值)数值化而成的。另外，该白色虚线所包围的部分为“黑质致密部”。以下的图中也同样。

(实验1-2)与实验1同样地，用50分钟将1μL 6-OHDA(800μM)与厄弗酚(200μM)或脱氢厄弗酚(200μM)一起给药于大鼠单侧黑质致密部。给药结束起10分钟后，通过HYDROP的荧光测定黑质细胞内过氧化氢水平，结果，6-OHDA单独给药的情况下，与生理盐水(对照)给药相比，细胞内过氧化氢水平显著上升，该上升可被厄弗酚或脱氢厄弗酚的同时给药抑制(图2)。需要说明的是，HYDROP为特异性检测H

(实验2)对过氧化氢诱导性的黑质细胞内Zn

(实验2-2)进而，通过酪氨酸羟化酶(TH)免疫染色研究了厄弗酚或脱氢厄弗酚对于神经细胞死亡的效果。与实验1同样地，用50分钟将1μL6-OHDA(800μM)与厄弗酚(200μM)或脱氢厄弗酚(200μM)一起给药于大鼠单侧黑质致密部。给药结束起两周后，将大鼠麻醉，用冰冷的4％多聚甲醛进行灌注，摘出脑。在-20℃下由经固定的脑制作切片，将切片用抗酪氨酸羟化酶抗体(Abcam)、Alexa Fluor 633山羊抗兔二抗(ThermoFisher)处理，进行作为多巴胺神经标志物的酪氨酸羟化酶(TH)的免疫染色。6-OHDA单独给药导致处于黑质致密部的TH阳性细胞变成了约50％，观察到约半数的多巴胺神经变性。该神经变性可被厄弗酚或脱氢厄弗酚的同时给药完全抑制(图4)。

由以上结果推测，即使对于出现运动障碍的实验模型动物，厄弗酚和脱氢厄弗酚也具有充分效果(能够改善运动障碍)。

需要说明的是，厄弗酚和脱氢厄弗酚使用的是将灯芯草(全草或芯)的50％乙醇水溶液提取液进一步纯化而得者。图5示出了对灯芯草全草50％乙醇水溶液提取液或灯芯草芯50％乙醇水溶液提取液进行HPLC分析而得的色谱图。关于有关灯芯草芯的提取、分级和纯化，以下进行详细说明。将市售的灯心草(灯心草科灯心草的茎的髄心的干燥物)5kg在20倍量的50％含水乙醇中在80℃加热下进行2次2小时的回流提取，过滤。将滤液在减压下浓缩，向浓缩液中加入1.3升蒸馏水而悬浮，加入1.3升乙酸乙酯，用分液漏斗进行液液分配萃取。将其重复3次而分为水层和乙酸乙酯层。乙酸乙酯层在减压下馏去溶剂而干燥，得到乙酸乙酯提取物26.2g。将该乙酸乙酯提取物用硅胶柱色谱(510毫升)分级为A至M这13个级分(洗脱液：含有2％甲醇的氯仿～含有40％甲醇的氯仿)。将级分F和G用制备型HPLC纯化，得到化合物1(0.218克)、化合物2(1.725克)。化合物1和2经NMR谱测定，分别被鉴定为厄弗酚和脱氢厄弗酚。