一种用于鉴定沉香品种的SSR分子标记的核心引物组及应用

技术领域

本发明涉及到分子标记技术领域，具体涉及一种用于鉴定沉香品种的SSR分子标记的核心引物组及应用。

背景技术

沉香是中国、日本、印度以及许多东南亚国家的传统珍稀药材和名贵香料，在医药、香水和文化等领域具有重要的应用价值。瑞香科沉香属植物是生产沉香的主要植物资源，其中白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)是中国产沉香的唯一法定植物来源。因过度的伐树结香及生态环境的破坏，导致包括白木香在内的野生沉香属植物资源已濒临灭绝，大多数沉香树种先后被各国列为珍稀濒危保护植物，2004年沉香属的所有物种均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约附录II》。目前，世界各国对野生药用植物的保护工作已从单纯的保护转变为保护和栽培养护并行。据报道，沉香属植物在马来西亚、印度尼西亚、印度、孟加拉、缅甸，不丹，越南等多国开展种植。

历史上沉香树以野生资源为主，并没有品种之分，但随着沉香人工种植规模的扩大以及人们对沉香产量和品质的追求，大量的沉香品种被选育出来。据统计，海南省林木品种审定委员会审(认)定的白木香优良品种已达13种，而市场上嫁接的白木香农家种最多时高达150多种。同时，随着国际贸易活动的增多，原来仅分布在特定范围的沉香树种在不同国家和地区间的流动也越来越频繁。例如，A.crassna和A.malaccensis是原分布在东南亚各国的主要结香树种，已引种到中国。

过去主要依据叶形、株形和果形等形态特征对沉香树进行鉴定，但由于沉香属植物的形态或外观比较相近，且形态性状容易受外界环境条件影响而发生变异，导致市场上的很多沉香品种，包括农家种、选育品种以及国外物种，用形态鉴定方法很难准确区分。造成沉香市场上存在同名异物、同物异名，以及进口沉香和药用沉香混乱等问题，因此开发一种对沉香品种或沉香来源精准鉴定的方法十分必要。

简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)标记法具有数量丰富、多态性高、易检测、重复性高、呈共显性等优势，已广泛应用于植物遗传育种的各个领域。国际植物新品种保护联盟(UPOV)将SSR标记指定为DNA指纹数据库的首先标记方法之一，在中国转基因大豆和玉米审定标准中将SSR标记作为转基因品种与受体品种鉴别的DNA指纹图谱。

发明内容

针对目前沉香种质资源形态鉴别难度大的问题，本发明的目的在于提供一种沉香品种SSR分子标记的核心引物组和应用。

本发明的第一个目的在于提供一种鉴定沉香品种SSR分子标记的引物，是先从白木香转录组测序数据中获取SSR序列，筛选出2个、3个、4个、5个、6个碱基重复单元，重复次数5次以上的SSR序列；以筛选出的SSR序列为模板，设计特异性引物，引物长度为20bp，目标扩增产物在110-350bp，设计并合成200对SSR引物，其中正向引物的5’端分别采用不同的荧光进行标记，反向引物合成常规引物；利用15～20个形态特征明显且差异较大的沉香品种对S4中的200对引物进行多态性扩增，通过琼脂糖凝胶电泳和和毛细管电泳等技术从中筛选出3～10对扩增稳定好、特异性和多态性高的核心引物组，包括以下的一组或多组：

引物ASSR-28：

F：5'-TCCTTACGCGGAACCAATAC-3'(SEQ ID NO.1)；

R：5'-GAGCGGGTTAACAATTCCAA-3'(SEQ ID NO.2)；

引物ASSR-155：

F：5'-GGTATGGTAGCAGGAGCCAA-3'(SEQ ID NO.3)；

R：5'-GTTAGCCCTTCCTAATCCCG-3'(SEQ ID NO.4)；

引物ASSR-158：

F：5'-CCCATGAGACAAGGAAAGGA-3'(SEQ ID NO.5)；

R：5'-CACCAGAAATGGGATGCTCT-3'(SEQ ID NO.6)；

引物ASSR-169：

F：5'-CAGCAGCAGATGCCATTAAA-3'(SEQ ID NO.7)；

R：5'-ACAAGCCATGCAATCATCAC-3'(SEQ ID NO.8)；

引物ASSR-171：

F：5'-AGTGAGATATGGCGTGGCTC-3'(SEQ ID NO.9)；

R：5'-TAACCCTGTTCCCGTCACTC-3'(SEQ ID NO.10)。

优选地，所述的引物的正向引物的5'端标记有荧光基团。

优选地，所述的荧光基团为ROX、FAM、HEX或TAMRA。

本发明的第二个目的在于提供一种鉴定沉香品种的检测试剂盒，包含上述鉴定沉香品种SSR分子标记的引物。

本发明的第三个目的在于提供上述引物或检测试剂盒在沉香品种鉴定、沉香溯源检测或沉香新品种选育中的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种鉴定沉香品种的方法，包括以下步骤：

S1.提取沉香对照品种和待测品种的基因组DNA；

S2.以步骤S1提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；

S3.对步骤S2获得的PCR产物进行检测；

S4.分析步骤S3检测结果，将待测品种与对照品种的扩增产物数据对比，根据扩增产物对应的位点及其等位基因大小的异同，判定待测品种与对照品种是否为同一品种。

优选地，步骤S1中提取的是沉香幼嫩的叶片基因组DNA。

优选地，步骤S2所述PCR扩增，其体系为：DNA模板大于30ng，2×Taq PCRMix 5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL,ddH

其程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸20min；或其程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62-55℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环，每个循环退火下降1℃；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；72℃延伸20min。

优选地，步骤S3中所述检测的方法为聚丙烯酰胺凝胶或毛细管电泳。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明提供的SSR分子标记引物组能够用来鉴定沉香品种和农家种，还可以用来对沉香香材进行溯源检测。本发明克服了外部形态对其鉴定的不确定性，结果稳定、重复性好和准确度高，可为沉香优良品种的选育、推广种植及其香材的开发利用提供技术保障。

附图说明

图1是本发明SSR引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，A为ASSR-96引物琼脂糖凝胶电泳图；B为ASSR-155引物的琼脂糖凝胶电泳图。

图2是基于UPGMA法构建的20个样品的聚类图。

图3是ASSR-28荧光毛细管电泳特征峰图，A-D分别为中科1号、棋香21号、棋香31号和棋香41号。

图4是ASSR-155荧光毛细管电泳特征峰图，A-D分别为中科1号、棋香21号、棋香31号和棋香41号。

图5是ASSR-158荧光毛细管电泳特征峰图，A-D分别为中科1号、棋香21号、棋香31号和棋香41号。

图6是ASSR-169荧光毛细管电泳特征峰图，A-D分别为中科1号、棋香21号、棋香31号和棋香41号。

图7是ASSR-171荧光毛细管电泳特征峰图，A-D分别为中科1号、棋香21号、棋香31号和棋香41号。

图8是基于SSR分子标记的白木香种质聚类图。T41-F1/F2/CM/DA/LH/HK分别代表种质T41嫁接1代，嫁接2代，澄迈基地，定安基地，龙湖基地和海口基地的样品。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1本发明沉香SSR分子标记核心引物组的开发

1.转录组数据来源于白木香2份种质Illumina高通量深度测序的结果。具体是将白木香茎进行钻孔伤害后，提取其RNA，最后经百迈客生物科技有限公司进行RNA-Seq转录组测序。

2.筛选500bp以上的转录本，利用MISA软件做SSR分析，共预测出8246个SSR，分成7种类型，其中混合碱基重复407个，占比4.94％；单碱基5531个，占比67.07％；双碱基1372个，占比16.64％；三碱基823个，占9.98％；四碱基80个占0.97％；五碱基23个，占比0.28％；六碱基10个，占比0.12％。

3.以2个、3个、4个、5个、6个碱基重复单元，重复次数5次以上和目标产物在110-350bp为标准，初步筛选出200对SSR引物。

4.合成初筛得到的200对SSR引物，在正向引物的5’端加入标记了FAM荧光基团的Ad接头序列5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'，反向引物合成常规引物。

5.从6个国家收集的物种明确且形态特征明显的20份样品(表1)作为筛选材料。

表1供试材料信息

6.使用omega bio-tek公司的植物基因组DNA提取试剂盒(D2485)提取上述20个样品的DNA。

7.荧光PCR扩增

(1)PCR扩增体系：

(2)PCR扩增程序：

8.荧光PCR产物电泳鉴定稀释

荧光PCR扩增完成后，取2uL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(1％浓度)。去除扩增特异性差、扩增效率差的SSR引物，如图1A显示的ASSR-96引物琼脂糖凝胶电泳图，有多个条带说明特异性差，部分样品条带亮度差说明扩增效率差；保留扩增的特异性好、扩增效率高的SSR引物，如图1B显示的ASSR-155引物的琼脂糖凝胶电泳图，只有一个条带说明特异性好，条带亮度高说明扩增效率好。将保留的荧光PCR产物进行稀释，得到浓度均一的荧光PCR产物。

9.荧光毛细管电泳检测

将稀释至统一浓度的荧光PCR产物加至96孔板中，然后加入0.5ulGeneScan

10.数据分析

根据每对SSR引物扩增产物的长度，利用GenAlex软件进行遗传多样性分析，进一步筛选出5对多态性好，分辨率高的SSR标记引物(表2)。

表2 5对核心引物组信息

从表3中可以可看出本发明提供的这5对SSR标记引物在供试的20个沉香个体中表现出较高的多态性。同时利用NTsys2.1中的非加权组平均法(unweighted pair-groupmethod with arithmetic means,UPGMA)建立聚类树(图2)。从图2中可以看出，5个SSR位点可将17份沉香种质区的20份样品区分开，说明5对SSR引物的分辨率高。

表3 5个SSR位点的遗传多样性分析

备注:Locus:位点名称；Na:等位基因数；Ne:有效等位基因数；I：Shannon’s多样性指数；Ho：观察杂合度；He：期望杂合度；Hs：Nei’s多样性指数；PIC：多态性信息含量。

实施例2利用本发明SSR进行白木香优良品种特征图谱的建立

1.以海南省林木品种审定委员会认定的沉香优良品种中科1号、棋香21号、棋香31号和棋香41号为样品，取其幼嫩叶片100mg，用70％酒精脱脂棉擦洗样品和刀具，在称量纸上切碎，置入2mL的离心管中，加入2颗70％酒精消毒过的钢珠，组织研磨机粉碎3分钟。

2.利用omega bio-tek公司的植物基因组DNA提取试剂盒(D2485)提取上述样品中的DNA，具体步骤如下：

(1)向研磨好的粉末中加600uL CPL缓冲液，用涡旋器充分混匀，然后65℃孵育40min，期间颠倒离心管混匀2-3次，水浴后放至室温。

(2)加600μl现配氯仿/异戊醇(24:1)，用手上下颠倒离心管30s，室温9000rpm离心10min。

(3)小心吸出300uL上清液到另一新的1.5mL离心管中，确保不要吸入残渣。

(4)加10uL RNase A，室温放置10-20min。

(5)加150uL Buffer CXD，然后加入300μl无水乙醇，轻轻混匀20s。

(6)所有溶液(包括沉淀)加入自带吸附柱的2.0mL收集管中，9000rpm离心1min，弃废液和2mL收集管。

(7)把吸附柱放到另一个收集管中，用650uL SPW Wash Buffer(加过无水乙醇)，9000rpm离心1min，弃溶液，收集管保留。

(8)再加650uL SPW Wash Buffer，9000rpm离心1min，弃溶液，收集管保留。

(9)将吸附柱放入空收集管中，9000rpm离心2min，吸附柱开盖放置2min，以挥发无水乙醇。

(10)将吸附柱放入一新的1.5mL离心管中，加50-100uL Elution Buffer(预热到65℃，悬空滴入，孵育3min，9000rpm离心1min。

(11)重复第10步，获得高质量的DNA，DNA浓度值要求在50ng/uL以上，OD

3.荧光PCR扩增

(1)PCR反应体系10μL，包括DNA模板1μL，2×EcoTaq PCR SuperMix 5μL(

Solarbio,PC1120)，上下引物各0.5μL，ddH

(2)PCR扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s,35个循环；72℃延伸10min；反应结束后4℃保存。

4.荧光PCR产物电泳鉴定稀释

荧光PCR扩增完成后，取2uL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(1％浓度)，通过PCR产物条带的亮度对各荧光PCR产物进行稀释，得到浓度均一的荧光PCR产物。

5.荧光毛细管电泳检测及特征峰图的获得

将稀释至统一浓度的荧光PCR产物加至96孔板中，然后加入0.5ulGeneScan

实施例3本发明SSR标记在白木香优良品种选育中的应用

《中华人民共和国植物新品种保护条例》规定植物新品种应具备特异性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和稳定性(Stability)，简称DUS。国家林业局颁布的《主要林木品种审定办法》要求品种及无性系应符合DUS要求，且要对其进行详细的描述。通过SSR分子标记技术可以从基因多态性层面证明所选育白木香优良品种的特异性，一致性和稳定性。具体步骤如下：

1.以已通过审定的白木香优良品种中科1号(A11)，棋香21号(R21)和棋香31号(B31)和农家种(CK和ZTJ)为对照，检测新选育的白木香优良品种(T41)的特异性、一致性和稳定性。

2.参照实施例2的方法提取上述样品的DNA，然后利用实施例1获得的5对核心SSR引物进行荧光PCR扩增，最后通过毛细管电泳法获得每对引物所对应的片段长度。

3.将片段长度换算为01矩阵后，利用NTsys2.1中的非加权组平均法(UPGMA)建立聚类树(图8)。从图8中可以看出，在各试验点的优良品种T41聚类为一支，显著区别于聚类为其他分支的品种A11、R21、B31和ZTJ等，表明T41具有显著的特异性；优良品种T41的嫁接1代(T41-F1)和嫁接2代(T41-F2)个体聚类为一支，相似度在0.98以上，说明T41在不同代际间稳定性好；另外各试验点白木香优良品种T41号均聚类在一支上，说明T41系列的一致性较高。

实施例4本发明SSR标记在沉香香材溯源中的应用

1.参照发明专利(CN108624588 B)实施例1，提取待鉴定沉香香材的基因组DNA。同步提取对照品种的DNA。提取的DNA达到以下质量要求：经琼脂糖凝胶电泳检测基因组主带清晰，无明显降解；DNA浓度大于50ng/uL，A260/A280为1.8-2.2，A260/A230大于1.0。

2.参照实施例2的方法，利用实施例1获得的5对核心SSR引物对提取的基因组DNA进行荧光PCR扩增，最后通过毛细管电泳法获得每个扩增产物的荧光毛细管电泳特征峰图和片段长度。

3.将待测沉香样品与对照品种的特征指纹图谱进行对比。若待测样品与对照品种存在等位基因不同的位点，则判定待测沉香不是来自对照品种，若待测样品与对照品种全部位点的等位基因均相同，则判定待测沉香来自对照品种。