一种使用光声成像技术的检测方法

技术领域：

本发明涉及光声成像技术，用于医学领域，尤其设计一种光声成像技术评估脂肪组织部位棕色脂肪和米色脂肪比例的方法，用于验证脂肪组织褐变程度，指导患者的下一步用药周期和剂量。

技术背景：

脂肪组织(adipose tissue,AT)根据其解剖位置以及代谢功能分别分为白色脂肪、棕色脂肪和米色脂肪，白色脂肪主要由白色脂肪细胞组成，含有单个细胞质脂滴，储存多余的能量；棕色脂肪由多个细胞质脂滴和大量线粒体的棕色脂肪细胞组成，可以以热的形式散发能量，但棕色脂肪在成人中很少见。米色脂肪存在于白色脂肪簇中，与基地状态下的白色脂肪细胞无法区分。有趣的是，米色脂肪经过冷刺激或β-肾上腺素激活后会发生褐变，增加热量的消耗可用于预防肥胖，因此，将米色脂肪褐变是治疗肥胖症的一个有前途的替代策略。然而，米色脂肪褐变程度至今没有在体检测的标准，同时对米色脂肪组织褐变程度也无相应标准，因此建立在体检测方法具有较为深远的临床意义，可用来指导患者的个性化用药方案，为患者的给药周期、给药频率提供参考意义。

光声成像(photoacoustic imaging,PAI)是目前国内外热门的新型成像技术之一，近年来发展迅速。PAI可提供基于组织多光谱吸收获得的功能代谢信息，实时定量反映组织中不同生物分子(如血红蛋白、黑色素、脂类等)的含量，并同时具有非侵入性、无电离辐射、多功能成像等多种特点。由于PAI可对脱氧血红蛋白和氧合血红蛋白进行区分，因此可检测组织血管中的血氧饱和度，进而反映缺血、缺氧等病生理状态的特征，在皮肤及浅表器官肿物、骨骼肌肉病变、肠道疾病、动脉斑块等多个方面的临床前和临床应用中具有广阔的潜力。但较少用于脂肪组织的检测，有研究通过脂肪组织血氧浓度、脂质、水等物质间接检测脂肪组织中棕色脂肪组织的比例，然而该种方式需要对仪器的要求较高，同时准确度欠佳。为了进一步检测米色脂肪组织褐变程度，本发明提出了一种使用光声成像技术的检测方法。

发明内容：

为了克服现有技术的缺陷，本发明要解决的技术问题提供了一种光声成像技术在体无创评价脂肪组织中白色脂肪组织和棕色脂肪组织所占的比例，其能够实现接近临床应用的实时和动态的不同脂肪组织所占比例的评估，为下一步给药周期、给药剂量的个性化提供了参考标准。

本发明的技术方案是：提供一种使用光声成像技术的检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)采用超高分辨率超声光声多模成像系统对棕色脂肪组织，白色脂肪组织，米色脂肪组织进行检测，得到超声/光声波谱图；

(2)根据波谱图计算米色脂肪组织中棕色脂肪组织和白色脂肪组织的比例。

其中，步骤2所述的根据波谱图计算，其方法是：

用棕色脂肪和白色脂肪组织的波谱图对米色脂肪组织的图谱进行拆分，获得米色脂肪组织中棕色脂肪组织和白色脂肪组织的比例，以及米色脂肪组织部位棕色脂肪组织和白色脂肪组织的比例。

所述步骤(1)中，棕色脂肪组织从肩胛骨部位取得，将棕色脂肪组织周围的白色脂肪组织除去后放置光声成像的仪器上，在棕色脂肪组织上覆盖超声耦合剂，调整超/光声探头位置，关上仓门，对棕色脂肪组织的波谱进行采集。

所述步骤(1)白色脂肪组织从附睾部位取得，白色脂肪放置光声成像的仪器上，在棕色脂肪组织上覆盖耦合剂，超/光声探头固定位置，关闭仓门，对白色脂肪组织的波谱进行采集。

所述步骤(1)米色脂肪组织从腹股沟部位取得，将米色脂肪组织取下后放置光声成像仪器上，在米色脂肪组织上覆盖耦合剂，固定超/光声探头的位置，关闭仓门，采集米色脂肪组织的光声图像.

所述步骤(2)中对米色脂肪组织中的白色脂肪组织和棕色脂肪组织使用多模式自动拆分，从而获得棕色脂肪组织和白色脂肪组织所占的比例数值。

本发明所述超高分辨率超声光声多模成像系统，主要用于小动物，如大鼠、小鼠、豚鼠等，本发明试验采用的是小鼠。

本发明经过对有关数据的采集，可以用于分析动物给药前后试验的结果，特别用于和脂肪组织相关的药物的药效测试。

根据脂肪组织棕色脂肪组织和白色脂肪组织产生信号值的大小，判断给药前后药物治疗的效果，其中以未给药时的脂肪组织部位棕色脂肪组织的光声信号与白色脂肪组织光声信号数值比例作为基准值，给药后继续检测脂肪组织部位棕色脂肪组织和白色脂肪组织光声信号强度，棕色脂肪组织与白色脂肪组织比值增加意味着脂肪组织中棕色脂肪组织比例升高，可增加体内多余热量的消耗，减少白色组织堆积，进而改善因脂肪堆积而产生的系列慢性疾病，治疗效果较佳，反之则说明治疗无效。

以下是对本发明名词术语的解释：

小动物超高分辨率超声光声多模成像系统：纳秒级脉冲激光通过光纤照射到组织(区域)激发，体内生色基团(内源/外源)吸收特定波长光能量，引发热弹性膨胀运动(产生超声波)，利用超高频探头检测热弹性影涨产生的声波，系统进行信号处理，实现高分辨率超声与光声图像的共定位。

型号：富士VisualSonics的

用途：超声/光声一体机(主机型号VS-11946)：用于肿瘤生物学、心血管生物学、神经生物学、分子生物学等领域.*B-Mode(B超)：动物结构成像、肿瘤、脏器等结构影像；PA-Mode：1.光声影像与超声成像实时同步并自动共定位；2.多光谱扫描三维成像；3.血氧饱和度检测：血红蛋白(含氧血红蛋白及去氧血红蛋白)活体内分布的成像与定量；4.黑色素在活体的分布与定量分析，无需染色可以直接检测。

棕色脂肪组织(brown adipose tissue)：是指动物体内呈棕色的脂肪组织。其特点是脂肪细胞体积较小，胞质中有多个较小的脂滴，并有较多的线粒体；细胞核呈圆形，位于细胞中央；脂肪细胞之间的疏松结缔组织中有较丰富的毛细血管和神经纤维。

白色脂肪组织：根据脂肪组织存在的部位分类，多指存在于附睾及内脏部位的脂肪组织。

米色脂肪组织：根据脂肪组织存在的部位分类，多指存在于腹股沟部位的脂肪组织，一般含有白色脂肪组织和棕色脂肪组织，其中白色脂肪组织可向棕色脂肪组织转变。

超声/光声波谱图：B超探头同时发射和接收几十或更多的超声反射信息实时组成的二维图像而形成超声图，一种基于光声效应建立的混合模式生物/医学成像形成的图片是光声图，超声图可用于定位光声图的组织结构信息，波谱图则反应光声信号产生的强度。

耦合剂(超声用)：医用用于一种由新一代水性高分子凝胶组成的医用产品。它的PH值为中性，对人体无毒无害，不易干燥，不易酸败，超声显像清晰，粘稠性适宜，无油腻性，探头易于滑动，可湿润皮肤，消除皮肤表面空气，润滑性能好，易于展开；对超声探头无腐蚀、无损伤。

超/光声探头：在PA模式成像过程中提供激光并接收超声信号以产生图像的探头。仓门：用于防止激光能量辐射对用户造成危害的一种钢制机柜的门。

米色脂肪组织的光声图像：米色脂肪组织根据产生光声信号的不同而产生的光声图像。

自动拆分：可用于为光声成像采集中的每个波长图像系列分配颜色和其他视觉属性。然后，将这些图层作为数据的单独视图或组合视图进行查看。

棕色脂肪组织和白色脂肪组织所占的比例：选取米色脂肪组织部位利用多模式、超高分辨率小动物光声/超声成像系统，处理数据时将处理的棕色脂肪组织波谱图和白色脂肪组织波谱图调取出来，系统根据光声信号自动拆分出两种脂肪组织所占数值，两者进行计算即可。

比例的计算公式和方法：棕色脂肪组织/白色脂肪组织＝PA(棕色脂肪组织)/PA(白色脂肪组织)，其中，所述比例是指不同脂肪组织产生光声信号强度的比值。如图2～图5所示，本发明光声成像技术评估米色脂肪组织中不同脂肪组织所占比例的方法，其包括以下步骤：

(1)棕色脂肪组织从小鼠肩胛骨部位取得。方法如下：将小鼠安乐死，小心将小鼠背部的皮肤剪开，暴露小鼠肩胛骨蝴蝶状颜色较深的棕色脂肪组织，将棕色脂肪组织周围的白色脂肪组织除去后放置光声成像的仪器上，在棕色脂肪组织上覆盖耦合剂，调整超/光声探头位置，关上仓门，对棕色脂肪组织的波谱进行采集，保存图谱即得棕色脂肪组织图谱。

(2)白色脂肪组织从小鼠附睾部位取得。方法如下：将小鼠安乐死，小心剪开腹部，将连接在附睾周围的白色脂肪组织取出，并除去附睾，白色脂肪放置光声成像的仪器上，在棕色脂肪组织上覆盖耦合剂，超/光声探头调整位置，关上仓门，对白色脂肪组织的波谱进行采集，保存图谱即得白色脂肪组织图谱。

(3)米色脂肪组织从小鼠腹股沟部位取得，方法如下：将小鼠安乐死，小心将小鼠背部的皮肤剪开小口，将小鼠下侧的皮肤除去，即暴露小鼠的米色脂肪组织，将小鼠米色脂肪组织取下后放置光声成像台上，在米色脂肪组织上覆盖耦合剂，固定超/光声探头的位置，关上仓门，采集米色脂肪组织的光声图像，在处理数据时调出保存的米色脂肪组织和棕色脂肪组织，系统会对米色脂肪组织中的白色脂肪组织和棕色脂肪组织自动拆分，从而获得棕色脂肪组织和白色脂肪组织所占的比例数值。

(4)根据本发明所述的光声成像评估棕色脂肪和白色脂肪比例的方法，采用超/光声双模态成像的方法，持续观测以期评价在体小鼠腹股沟米色脂肪光声信号，利用光声成像光谱值变化对不同波段脂肪组织的分布情况作出评价。

已知，有人利用棕色脂肪组织不同血氧梯度会产生不同的光声信号，进而通过无标记光声测量血红蛋白梯度，间接测量棕色脂肪在代谢过程中的激活程度，属于间接测定脂肪组织中棕色脂肪组织含量变化。而本发明是通过直接检测棕色脂肪组织和白色脂肪组织光声信号，确定不同脂肪组织的光声波段分布后，仪器对米色脂肪组织中的白色脂肪组织和棕色脂肪组织自动拆分计算，属于直接测定，准确度更高。

本发明能够根据不同脂肪组织吸收不同的特定波长，用户自定义不同组织产生光声波段并储存在仪器中进行调用，使用时可将自定义的光声波段调取出来供用户使用，避免仅能使用仪器上自带的血氧模式波谱图，提高了仪器检测的精确度，更重要的是超声模块可定位脂肪部位，对脂肪组织中不同波段脂肪组织的分布进行无侵入检测。

附图说明

图1示出了多模式、超高分辨率小动物光声/超声成像系统外观图。

图2示出了棕色脂肪组织在近红外区域的吸收系数图谱。

图3示出了白色脂肪组织在近红外区域的吸收系数图谱。

图4示出了米色脂肪组织在近红外区域白色脂肪组织和棕色脂肪组织所占的比例。图5示出了在体小鼠腹股沟米色脂肪组织白色脂肪组织和棕色脂肪组织所占的比例。

图6示出了在体小鼠经不同组治疗后米色脂肪组织光声图像的变化代表图。

图7示出了不同组光声成像中棕色脂肪组织与白色脂肪组织比例具体数值计算结果。

具体实施方式

实验方案：

1、建立棕色脂肪光声波谱图。

实验方法：小鼠安乐死，解剖取小鼠肩胛骨部位的棕色脂肪组织，放置多模式、超高分辨率小动物光声/超声成像系统的操作台上，在超光声探头以及棕色脂肪组织覆盖耦合剂，避免超光声探头与棕色脂肪组织之间产生空气，固定好超光声探头位置后，关闭仓门，进行超光声成像，待采集好超光声图像后，根据棕色脂肪组织超声位置共定位光声位置，选择生成该位置的光声波谱，即可生成棕色脂肪组织光声波谱，如图2所示，将波谱图保存到电脑中，后续可直接调出使用，命名为z-smj。

2、建立白色脂肪组织光声波谱图

实验方法：小鼠安乐死，解剖取小鼠附睾部位的白色脂肪组织，放置多模式、超高分辨率小动物光声/超声成像系统的操作台上，在超光声探头以及白色脂肪组织覆盖耦合剂，避免超光声探头与白色脂肪组织之间产生空气，固定好超光声探头位置后，关闭仓门，进行超光声成像，待采集好超光声图像后，根据白色脂肪组织超声位置共定位光声位置，选择生成该位置的光声波谱，即可生成白色脂肪组织光声波谱，如图3所示，将波谱图保存到电脑中，后续可直接调出使用，命名为b-smj。

3、离体米色脂肪组织检测实验验证计算棕色脂肪组织和白色脂肪组织比例的可行性实验方法：小鼠安乐死，解剖取小鼠腹股沟部位的米色脂肪组织，放置多模式、超高分辨率小动物光声/超声成像系统的操作台上，在超光声探头以及米色脂肪组织覆盖耦合剂，避免超光声探头与米色脂肪组织之间产生空气，固定好超光声探头位置后，关闭仓门，进行超光声成像，待采集好超光声图像后，根据超声图像选取米色脂肪组织位置，选择多波谱模式后，可同时调出棕色脂肪组织和白色脂肪组织波谱图，系统自动拆分后，分别设置不同波谱图对应的颜色，如图4所示，红色为棕色脂肪组织产生的光声信号，绿色为白色脂肪组织产生的光声信号，其中右上角会显示区域面积，棕色脂肪组织光声信号强度平均值，以及白色脂肪组织光声信号强度平均值。(备注：PA代表光声成像，z-smj为棕色脂肪组织，b-smj为白色脂肪组织)

4、小鼠在体米色脂肪组织检测实验验证计算棕色脂肪组织和白色脂肪组织比例的可行性实验方法：小鼠腹股沟部位脱毛后，异氟烷麻醉放置操作台上并使其处于持续麻醉状态，用胶带使小鼠固定在操作台上，在超光声探头以及小鼠腹股沟部位覆盖上耦合剂，避免超光声探头与检测部位之间产生空气，固定好超光声探头位置后，关闭仓门，进行超光声成像，待采集好超光声图像后，根据超声图像选取小鼠皮下米色脂肪组织位置，选择多波谱模式后，调出棕色脂肪组织和白色脂肪组织波谱图，系统自动拆分后，分别设置不同波谱图对应的颜色，如图5所示，红色为棕色脂肪组织产生的光声信号，绿色为白色脂肪组织产生的光声信号，其中右上角会显示区域面积，棕色脂肪组织光声信号强度平均值，以及白色脂肪组织光声信号强度平均值。如PA Avr(z-smj)＝0.469代表在选取的面积范围内在棕色脂肪组织波谱图产生的信号值为0.469,PA Avr(b-smj)＝0.246代表在选取的面积范围内在白色脂肪组织波谱图产生的信号值为0.246，PA Avr(z-smj)/PA Avr(b-smj)即为脂肪组织内棕色脂肪组织与白色脂肪组织所占比例。

实施例1

小鼠在体无侵入考察给药前后小鼠米色脂肪组织中棕色脂肪组织和白色脂肪组织所占比例实验方法：高脂饲养C57BL/6J雄性小鼠14～16周后进行分组，每组3只，分组为PBS、DLG-B、OBIM、ORIB、MS、DLG-L以及DLG+L，分别注射不同制剂，其中PBS组每侧注射100μL的PBS，DLG代表双层脂质凝胶，分为外层(Outer layer)和内层(Inner layer)，内外层各注射50μL，外层凝胶包载以聚乙二醇修饰黑磷纳米颗粒为二级载体的罗格列酮(Rosi@mPEG-P)，其中Rosi的注射量为100μg，内层凝胶包载二甲双胍(MET)，MET的注射量为50μg，若双层凝胶均不含有药物则命名为DLG-B；若外层凝胶不含有药物而内层凝胶含有药物则命名为OBIM；若外层凝胶含有药而内层凝胶不含有药物则命名为ORIB；若不借助凝胶载体，仅将外层药物和内层药物混合命名为MS(Mix solution)；DLG-L代表内外层均含有药物，其中未进行光照；而DLG+L代表内外层均含有药物并进行光照；其中其余含有黑磷的药物制剂均进行了光照(光照采用808nm波长的激光器，光照温度维持43℃，每次光照10min)，光照周期以注射当天开始计算，记为第0天，注射后分别于不同天检测注射后的小鼠脂肪组织中棕色脂肪组织和白色脂肪组织所占比例，结果如图6所示，其中白色虚框为脂肪区域，对应的棕色脂肪组织光声信号强度与白色脂肪组织光声信号强度比值经过处理如图7所示，可以更直观的观察到不同组别的小鼠经过治疗后棕色脂肪组织和白色脂肪组织的比例变化，其中比例变高说明脂肪组织中的棕色脂肪组织所占比例升高，有利于消耗体内多余热量，改善小鼠因肥胖引发的各种并发症，而当棕色脂肪组织所占比例降低，则说明白色脂肪组织的堆积进一步增加，小鼠肥胖症以及相关疾病进一步加重。

1.首先根据前期建立的棕色脂肪组织光谱图以及白色脂肪组织光谱图。图2为棕色脂肪组织光谱图，将小鼠解剖取棕色脂肪组织，放置操作台上，覆盖上耦合剂，进行超光声成像，根据右上方超声图像选择棕色脂肪组织，选取该区域后生成相关图谱，图3为白色脂肪组织光谱图，操作方法与棕色脂肪组织相同，待检测米色脂肪时，首先捕捉超光声信号后，根据超声图像选取相应脂肪区域，选择多模式图谱中储存的棕色脂肪图谱和白色脂肪图谱，系统自动拆分光声信号，并获得棕色脂肪和白色脂肪光声信号强度值储存于仪器系统中；

2.对不同给药组别的小鼠腹股沟部位脱毛、异氟烷麻醉后将其放置多模式、超高分辨率小动物光声/超声成像操作台上，对超/光声探头以及小鼠检测部位覆盖上耦合剂，确保探头与检测部位之间无空气残留；根据超声图像调整超/光声探头的位置并固定，关上仓门，进行光声成像。

3.根据B超图像选取小鼠脂肪组织部位，该部位会与光声图像共定位出光声的脂肪组织部位，调出储存的棕色脂肪光声谱图以及白色脂肪光声谱图，系统自动拆分出不同脂肪组织对应的数值，记录该数值即可。

4.根据记录的数值，分别用棕色脂肪组织记录的数值比上白色脂肪组织记录的数值即可计算出棕色脂肪组织和白色脂肪组织所占的比例。

5.以第一天的比值作为基准数值，检测药物治疗周期脂肪组织的变化情况，如图7所示。

该结果可以直观地观察到不同治疗组小鼠腹股沟部位棕色脂肪组织和白色脂肪组织的变化情况，用于评价药物的治疗效果，为下一步给药周期的调整提供参考依据，为患者个性化给药方案提供理论基础。

如图6所示，白色虚线框是根据超声光声共定位选取测量部位的脂肪组织，其中红色代表棕色脂肪组织光声信号，绿色代表白色脂肪组织光声信号，超光声共定位选取脂肪组织区域后系统会自动计算不同区域的光声信号强度，图7是根据图6的数值进行计算，我们发现PBS组棕色脂肪白色脂肪的光声信号的比值几乎没有变化，甚至比值降低，说明随着时间的推移，PBS组的小鼠棕色脂肪比例降低，PBS对治疗没有效果，甚至随着时间的推移，PBS组小鼠白色脂肪组织所占比例增加，肥胖加重；DLG-B，OBIM组棕色脂肪组织所占比例几乎没有变化；ORIB，MS，DLG-L以及DLG+L组棕色脂肪组织所占比例不断增加，说明该治疗方式能促进棕色脂肪的生成，增加体内多余热量的消耗，在一定程度上治疗肥胖诱导的相关疾病，其中DLG+L的治疗效果最好，该实例证明了该方法的可行性。

参考文献：

[1]J.Reber,M.Willershauser,A.Karlas,K.Paul-Yuan,G.Diot,D.Franz,T.Fromme,S.V.Ovsepian,N.Beziere,E.Dubikovskaya,D.C.Karampinos,C.Holzapfel,H.Hauner,M.Klingenspor,V.Ntziachristos,Non-invasive Measurement of Brown FatMetabolism Based on Optoacoustic Imaging of Hemoglobin Gradients,Cell Metab27(3)(2018)689-701e4.https://doi.org/10.1016/j.cmet.2018.02.002.