一种抗原抗体共展示方法用于膜抗原的抗体文库筛选

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，特别是涉及一种抗原抗体共展示方法用于膜抗原的抗体文库筛选。

背景技术

多次跨膜蛋白(multi-pass membrane proteins,MMPs)是一类重要的膜蛋白质受体，主要包括了G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors，GPCRs)和离子通道蛋白(Ion channel proteins)，前者为7次跨膜蛋白，介导胞外信号向胞内转导；后者为跨膜次数不确定的筒状膜蛋白，介导细胞内外离子交换。MMPs在生命活动中起到重要的作用，所以成为一类重要的药物靶点。早期通过小分子药物对MMPs功能进行干预，但是由于许多MMPs，尤其是GPCR家族蛋白具有极高的序列同源性和结构的保守性，因此大部分小分子药物对MMPs选择性不强，会出现许多不确定的交叉反应，导致副作用明显。

单克隆抗体因为良好的靶点特异性和长效性成为一种优秀的靶向药物。随着生物技术的发展，有目的单克隆抗体药物开发成为了可能，很快成为药物开发的热点。但针对MMPs的单克隆抗体药物开发仍然困难重重。根据2019年上市抗体药物统计，仅有2种GPCR的靶向抗体药物上市，其余抗体药物的靶点均为单跨膜蛋白或粘附分子，这说明MMPs单抗的开发难度很大。

目前，MMPs单抗药物开发的最大的困难是如何取得天然结构的抗原。目前最常用的抗体筛选技术为杂交瘤技术和噬菌体展示技术，两者都需要纯化的、具有天然构象的目标蛋白作为基础，或作为免疫原用于免疫动物(杂交瘤技术)，或作为抗原对文库进行淘洗(噬菌体展示技术)。而MMPs恰恰是一种极难纯化的蛋白质，因为MMPs依赖细胞质膜维持天然结构，现有的纯化技术难以在不将MMPs从磷脂双分子层上剥离(去垢剂法)的情况下对其进行纯化，而一旦MMPs从脂双分子层上剥离，就会导致构象严重改变。

一些方法使用人工磷脂分子恢复MMPs的天然结构，但是收效甚微。另一些方法通过单独表达MMPs的胞外结构作为抗原，但仍然无法保证抗原的结构。还有方法绕过蛋白纯化步骤，直接将表达有MMPs的载体细胞用于免疫动物，避免了对MMPs天然构象的破坏。但是这种方法常常无法成功，可能因为免疫失败的原因包括靶蛋白丰度低、无免疫佐剂、种属间序列同源导致免疫耐受等问题。也有文献报，通过将靶基因直接转染到动物体内表达，产生免疫应答，制备杂交瘤。这些方法虽然克服了抗原构象问题，但是这些载体中表达的膜蛋白不能引起充分的免疫反应，在实际应用中鲜有成功的报道。同理，没有天然构象的MMPs分子作为抗原，各种抗体展示技术(包括噬菌体展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示、昆虫病毒展示等)均无法对文库进行淘洗，也就无法进行有效筛选。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗原抗体共展示方法用于膜抗原的抗体文库筛选，用于筛选针对膜蛋白的抗体，例如单克隆抗体。

本发明所要针对的目标抗原为膜蛋白，可将目标抗原表达在细胞膜上，将该目标抗原与细胞内侧的效应蛋白结构域偶联。同时将抗体文库(如单链抗体文库或Fab文库)通过跨膜肽表达在细胞膜表面，并且通过跨膜肽与胞内效应蛋白结构域偶联。如果细胞表面抗体和抗原双方能够发生作用，与双方所融合表达的效应蛋白结构域会重新组装成为有功能的效应蛋白，通过转录报告基因报告所述抗体与抗原的成功结合。采用本发明的技术方案可以快速有效的筛选出针对目标抗原的特异性抗体。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种针对膜抗原的抗体文库筛选方法，所述方法包括以下步骤：

(1)构建抗原模块表达载体，所述抗原模块表达载体为酵母表达载体，所述抗原模块表达载体中含有抗原模块编码基因，所述抗原模块编码基因包括目标抗原编码基因序列和第一胞内效应蛋白结构域编码基因序列的融合序列，所述目标抗原为膜抗原；

(2)构建抗体模块表达载体，所述抗体模块表达载体为酵母表达载体，所述抗体模块表达载体中含有抗体模块编码基因，所述抗体模块编码基因包括针对目标抗原的抗体编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、以及第二胞内效应蛋白结构域编码基因序列的融合序列，所述第二胞内效应蛋白结构域适于与所述第一蛋白效应蛋白结构域结合形成效应蛋白；

(3)将步骤(1)获得的抗原模块表达载体和步骤(2)获得的抗体模块表达载体分别转入宿主菌进行杂交，根据所述效应蛋白产生的理化效应筛选阳性克隆，获得抗原特异性抗体文库。

本发明中，所述跨膜肽是指一类疏水性极强、能够将融合蛋白嵌合至细胞质膜的氨基酸序列。所述跨膜肽为来源于哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞的天然序列，或人工设计的能够将融合蛋白嵌合至细胞质膜的序列。

本发明中，所述跨膜肽为来自酵母菌蛋白ALG5(2～25AA)、酵母菌蛋白PHO90(533～565AA)或小鼠CXCR5(162～194AA)蛋白中任一。

本发明中，所述第一胞内效应蛋白结构域以及第二胞内效应蛋白结构域又可称为报告单元。所述胞内效应蛋白结构域是指任何互补后产生功能的蛋白结构域，所产生的效应包括产生发荧光能力、释放转录因子转录报告基因、以及产生化学发光功能。

进一步地，所述效应蛋白选自连接有报告基因转录因子的泛素蛋白、荧光蛋白或萤光素酶；优选的，所述报告基因转录因子为GAL4。

进一步地，所述抗体编码基因序列表达的抗体位于跨膜肽的C端。

进一步地，d)步骤(3)中，所述宿主菌选自Y187细胞株或AH109菌株中任一。

进一步地，e)步骤(3)中，所述宿主菌为酵母，优选的，所述抗原模块表达载体和抗体模块表达载体分别转入不同结合型酵母。

进一步地，所述第一胞内效应蛋白结构域选自荧光蛋白C端或N端结构域、泛素蛋白C端或N端结构域、或萤光素酶N端或C端结构域中任一，所述第二胞内效应蛋白结构域包括适于与所述第一胞内效应蛋白结合形成荧光蛋白、泛素蛋白或萤光素酶的结构域；优选地，第一胞内效应蛋白结构域选自泛素蛋白C端或N端结构域，所述第一或第二胞内效应蛋白结构域末端连接转录因子GAL4，更优选地，所述泛素蛋白N端结构域氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。

例如，当细胞内侧泛素Cub和Nub结构域即被拉近，形成有活性的完整泛素蛋白，随后被细胞内源性泛素特异性蛋白酶消化，释放Cub末端所连接转录因子GAL4，进入细胞核转录报告基因His3、Ade2和LacZ。前两个报告基因帮助细胞在SD-His-Ade-营养缺陷培养基上生长，后者催化培养基中X-a-gal底物显色。

一种实施方式中，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白EGFP、黄色荧光蛋白YFP。

进一步地，抗原模块编码基因中还包括信号肽编码基因，所述信号肽编码基因与目标抗原编码基因连接。当采用抗原模块表达载体本身含有的信号肽编码基因时则无需添加信号肽编码基因，当采用非抗原模块表达载体本身含有的信号肽编码基因时则需要添加信号肽编码基因，使得抗原能够分泌至细胞膜表面。

进一步地，所述抗原模块编码基因中，目标抗原编码基因序列和第一胞内效应蛋白结构域编码基因序列之间通过连接肽连接。当所述抗原模块编码基因中含有信号肽编码基因序列时，目标抗原编码基因序列与第一胞内效应蛋白结构域编码基因序列之间通过第一连接肽连接，所述信号肽编码基因序列与目标抗原编码基因之间通过第二连接肽连接。所述第一连接肽以及第二连接肽可以为3-10个长度的GGGGS。

进一步地，所述抗体模块编码基因中，抗体编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、以及第二胞内效应蛋白结构域编码基因序列之间依次通过连接肽连接。例如抗体编码基因序列与跨膜肽编码基因之间通过第三连接肽连接，所述跨膜肽编码基因与第二胞内效应蛋白结构域编码基因序列之间通过第四连接连接。所述第三连接肽以及第四连接肽可以为3-10个长度的GGGGS。

进一步地，所述抗体编码基因表达产物可以为抗体的scFv形式或Fab形式。本技术方案对这两种不同形式的抗体都适用。

进一步地，当所述抗体编码基因表达产物为Fab时，所述抗体模块表达载体包括：

a)轻链模块表达载体：所述轻链表达载体包括轻链编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、以及第二胞内效应蛋白结构域编码基因序列的融合序列；

b)重链模块表达载体：所述重链表达载体包括重链编码基因序列和恒定区1区序列的融合序列；

步骤3)包括：将转化有抗原及抗体重链表达模块的第一酵母菌株A，与转化有轻链模块表达载体的第二酵母菌株B杂交。

进一步地，当所述抗体编码基因表达产物为scFv形式时，所述抗体模块表达载体包括：

抗体模块编码基因，所述抗体模块编码基因是针对目标抗原的抗体编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、以及第二胞内效应蛋白结构域编码基因序列的融合序列。

进一步地，所述抗体编码基因序列表达的抗体位于跨膜肽的C端。即下文中提及的反式结构。

进一步地，所述抗原模块表达载体、抗体模块表达载体都选自pGAD-T7质粒。当然也可以采用其他适合表达的载体。

于一实施例中，筛选时，将转化后的细胞于培养基中培养。所述选择培养基为营养缺陷培养基。所述营养缺陷培养基可以适合特殊菌株生长，因此可以用于选择出具有特殊性质的菌株。例如，可以是在SD/Trp

于一实施例中，筛选阳性结果是指可以使得培养基中X-a-gal底物显色。

本发明的另一方面提供了一种用于膜抗原的抗体文库筛选系统，所述系统包括：

抗原模块表达载体、抗体模块表达载体、以及宿主菌，

所述抗原模块表达载体：包括抗原模块编码基因，所述抗原模块编码基因包括目标抗原编码基因序列和第一胞内效应蛋白结构域编码基因序列的融合序列，所述目标抗原为膜抗原；

抗体模块表达载体：包括抗体模块编码基因，所述抗体模块编码基因包括针对目标抗原的抗体编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、以及第二胞内效应蛋白结构域编码基因序列的融合序列，所述第二胞内效应蛋白结构域适于与所述第一蛋白效应蛋白结构域结合形成有活性的效应蛋白。

进一步地，所述跨膜肽选自酵母菌蛋白ALG5(2～25aa)、酵母菌蛋白PHO90(533～565aa)或小鼠CXCR5(162～194aa)蛋白中任一。

进一步地，所述第一胞内效应蛋白结构域选自荧光蛋白C端与或N端结构域、泛素蛋白C端与或N端结构域、或萤光素酶N端与或C端结构域中任一，所述第二胞内效应蛋白结构域包括适于与所述第一胞内效应蛋白结合形成荧光蛋白、泛素蛋白或萤光素酶的结构域；优选地，第一胞内效应蛋白结构域选自泛素蛋白C端或N端结构域，所述第一或第二胞内效应蛋白结构域末端连接转录因子GAL4，更优选地，所述泛素蛋白N端结构域氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

进一步地，所述抗体编码基因序列表达的抗体位于跨膜肽的C端。

进一步地，所述抗原模块编码基因还包括信号肽编码基因，所述信号肽编码基因与目标抗原编码基因连接。

进一步地，当所述抗体编码基因表达产物为Fab形式时，所述抗体模块表达载体包括：

a)轻链模块表达载体：所述轻链表达载体包括轻链编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、以及第二胞内效应蛋白结构域编码基因序列的融合序列；

b)重链模块表达模块：所述重链表达载体包括重链编码基因序列和恒定区1区的融合序列。

进一步地，当所述抗体编码基因表达产物为scFv形式时，所述抗体模块表达载体包括：

抗体模块编码基因，所述抗体模块编码基因包括针对目标抗原的抗体编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、以及第二胞内效应蛋白结构域编码基因序列的融合序列。

进一步地，所述抗原模块编码基因还包括信号肽编码基因，所述信号肽编码基因与目标抗原编码基因连接。

进一步地，所述抗原模块编码基因中，目标抗原编码基因序列和第一胞内效应蛋白结构域编码基因序列之间通过连接肽连接；所述抗体模块编码基因中，抗体编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、以及第二胞内效应蛋白结构域编码基因序列之间依次通过连接肽连接。

进一步地，所述宿主菌分别选自Y187细胞株、AH109菌株中任一。

进一步地，所述宿主菌分别选自Y187细胞株、GoldY2H菌株中任一。

优选地，所述系统还包括选择培养基。所述选择培养基用于培养转化后的转化细胞达到检测出结果的目的。更优选地，所述选择培养基为营养缺陷培养基。所述营养缺陷培养基可以适合特殊菌株生长，因此可以用于选择出具有特殊性质的菌株。例如，可以是在SD/Leu

本发明的另一方面提供了上述系统用于筛选针对膜蛋白特异性抗体的用途。

如上所述，本发明的膜抗原的抗体文库筛选系统，具有以下有益效果：

传统的酵母展示是将抗体展示在细胞壁上，而本系统需要将其展示在细胞膜上，并且能够使抗体CDR区翻转回来朝向细胞膜以便与抗原接触，这就需要对抗体模块的结构进行合理的设计。本课题通过给抗体序列融合不同功能的肽段实现抗体的分泌、锚定和自由摆动。

附图说明

图1显示为抗原模块结构示意图。

图2显示为抗原模块与抗体模块相互作用检测原理图。

图3a显示为抗原模块的两种拓扑结构。

图3b抗体模块拓扑结果预测结果。At1-scFv抗体模块的顺式和反式结构通过一种隐马尔可夫算法软件，TMHMM，进行预测。

图3c显示抗原GPCR与两种拓扑结构抗体模块相互作用的示意图。

图3d显示细胞生长检测照片和β-Gal活性测定结果。

图4a带有不同跨膜肽的scFv抗原模块示意图。

图4b抗原(CXCR4)相互作用与含有不同跨膜肽的抗体(At1-scFv)模块的相互作用β-Gal活性测定结果。

图4c检测含有抗原和抗体模块的杂合细胞在选择培养基上的生长状况。

图4d不同跨膜肽的抗体模块的亚细胞定位。

图5a scFv抗体模块带有不同长度柔性肽的示意图。

图5b CXCR4与不同长度柔性肽的抗体模块的相互作用β-Gal活性测定结果。

图5c包含抗原和抗体模块的杂合细胞细胞生长测试。

图6a带有不同信号肽的抗原结构示意图。

图6b两种结构的抗原与At1-scFv抗体模块(反式)相互作用β-Gal活性情况。

图6c抗原模块与At1抗体模块杂交菌株的生长。

图6d抗原模块的亚细胞定位。

图7荧光显微镜观察抗原蛋白在细胞中表达。

图8荧光显微镜观察抗体蛋白在细胞中表达。

图9抗原-抗体结合后细胞生长情况以及β-Gal活性情况。

图10 CXCR4与抗体PR4-Fab相互作用的检测。

Y187菌株表达抗原和Fab抗体重链序列，AH109表达Fab抗体轻链序列。NC-VH是阴性对照抗体重链序列，NC-VL是阴性对照抗体轻链序列；PR4-VH是专利抗体PR4的重链序列；PR4-VL是专利抗体PR4的轻链序列。每个序列取2个克隆进行平行实验。

图11 CXCR5与抗体相互作用后细胞生长情况。

图12a单链抗体对CXCR4和CXCR5的交叉反应识别。

图12b抗体与CXCR5荷载的细胞进行流式细胞术的相互作用检测。抗原的表达通过EGFP(绿光)检测，抗体的结合通过APC标记的二抗(红光)检测。

图12c抗体与CXCR4荷载的细胞进行流式细胞术的相互作用检测。抗原的表达通过EGFP(绿光)检测，抗体的结合通过APC标记的二抗(红光)检测。

图13a CXCR4突变体的示意图。CXCR4上4个胞外区片段分别被GGGGSGGGGS柔性肽替代，形成4中突变体，分别命名为CXCR4ΔNT,CXCR4ΔECL1,CXCR4ΔECL2,and CXCR4ΔECL3。

图13b CXCR4突变体和CXCR4特异性抗体At1之间的相互作用检测。CXCR4突变体被克隆进入抗原模块，与At1-scFv的相互作用通过细胞生长检测。突变体CXCR4ΔECL1,CXCR4ΔECL2与At1-scFv之间的相互作用被阻碍了。

图1411人外周血单个核细胞总RNA提取样品电泳结果。

图15外周血单个核细胞cDNA IgG重链(1～34泳道)和轻链(35～94泳道)可变区PCR电泳结果。

图16 CXCR4 Fab抗体与CXCR4在AACD系统中的报告基因(β-Gal)表达量与KD值的相关性。

具体实施方式

AACD系统设计(膜抗原的抗体文库筛选系统)

AACD系统主要包括抗原模块表达载体和抗体模块表达载体。抗原模块表达载体包括抗原模块编码基因，所述抗原模块编码基因是将目标抗原编码基因序列和胞内效应蛋白结构域编码基因序列融合后获得；抗体模块表达载体：包括抗体模块编码基因，所述抗体模块编码基因是将针对目标抗原的抗体编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列融合后获得。抗原模块表达载体和抗体模块表达载体转化细胞后，分别表达抗原和抗体。如果细胞表面抗体和抗原双方能够发生作用，与双方所融合表达的效应蛋白结构域会重新组装成为有功能的效应蛋白，通过转录报告基因报告所述抗体与抗原的成功结合。

为设计并检验AACD系统是否适用于研究膜抗原和单链抗体scFv的相互作用，我们采用了人类G蛋白偶联受体(GPCR)基因CXCR4及其抗体序列作为模型。抗原模块的结构展示在图1中i。它包含了3个部分，分别是信号肽、抗原CXCR4和胞内瞎用蛋白结构域。当然可以不同信号肽。当使用信号肽时，为优化信号肽，我们检测了来自不同基因的信号肽，分别是酿酒酵母(S.cerevisiae-secreted)基因Mfal1信号肽和CXCR4自身信号肽。胞内胞内效应蛋白结构域，又可称为报告单元，可以是包含了泛素蛋白C端结构域(Cub)和转录因子GAL4。在抗体模块中可包括分裂泛素系统的N端结构域(NubG)。NubG和Cub结构域组成了分裂泛素系统。

图中1ii表示了另外一种CXCR4抗原模块的结构，表示抗原模块中可以连接有信号肽。

图2表示了抗原抗体相互作用的检测原理。一旦scFv结合在GPCR上，分裂泛素系统将被牵拉重组、成为完整的、有活性的泛素蛋白，它能够被泛素特异性蛋白酶识别，并对Cub的C末端肽链进行水解，产生游离的GAL4。转录因子GAL4被SV40细胞核定位信号引导进入细胞核并启动下游报告基因HIS3，ADE2和LacZ，促使细胞在缺陷培养基上的生长和显色反应。野生型的泛素N段结构域——NubI被作为阳性对照，它能够自发结合Cub，导致不依赖抗原-抗体相互作用的GAL4的释放。

抗体模块拓扑结构优化

我们设计了两种抗体的拓扑结构，分别是反式结构和顺式结构(图3)。反式结构中NubG表达在模块的氨基(N)末端，scFv通过跨膜肽分泌到细胞膜外侧，形成II型跨膜蛋白。在顺式结构中，scFv表达在模块的N末端，通过其上游融合的分泌信号肽分泌至细胞膜外侧，通过跨膜肽与胞内的报告模块NubG连接，形成I型跨膜蛋白。两种拓扑结构的差异在于跨膜肽和连接肽的方向，反式结构中跨膜肽连接于scFv的N末端，而顺式结构中连接于ScFv的C末端。

实验中，我们使用了专利(US7892546B2)中CXCR4的抗体序列。序列中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)被提取出来，通过GGGGSx3柔性连接肽将VH和VL连接起来，形成单链抗体，称作At1-scFv。两种拓扑模式下，抗体模块的跨膜结构通过软件TMHMM(Serverv.2.0)进行了预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)如图3b。通过检测CXCR4和At1-scFv来测试系统。反应示意图如图3c。

表达抗原模块CXCR4-Cub-GAL4的AH109细胞和表达两种拓扑结构抗体模块(顺式和反式)的Y187细胞进行杂交，涂布在SD/Leu-Trp-Ade-His-gal+平板上。72小时后观察克隆生长。实验中CXCR4-Cub-GAL4×TMpho-NubG杂合菌被作为阴性对照，而CXCR4-Cub-GAL4×TMpho-NubI被用作阳性对照。Ag：antigen，Ab：antibody。测定两种拓扑结构的抗体模块与抗原模块的宿主细胞的β-Gal活性。实验独立重复3次，每次重复实验每样品进行2个平行孔测试。

两种拓扑结构的效率用他们和CXCR4的相互作用检测进行评估,结果如图3d。结果表明反式拓扑结构下，抗体模块可以显著的激活报告基因，而顺式结构不能激活报告基因。该结果提示，在顺式的抗体模块中，柔性肽的长度可能影响了scFv抗原结合区的方向取向，使其无法形成朝向细胞膜的方向。因此反式拓扑结构更加适合用于检测多此跨膜蛋白，如CXCR4。

跨膜肽优化

在抗体模块中，跨膜肽是一个很重要的元件。来自3个跨膜蛋白的3个跨膜肽被用于优化抗体模块，结构如图4a。一方面检测他们介导的细胞膜定位和与抗原相互作用的强度。3个跨膜肽分别来自酵母菌蛋白Alg5(2～25aa)，命名为TMalg；酵母菌蛋白Pho90(533～565aa)，命名为TMpho；小鼠CXCR5蛋白(162～194aa)，命名TMr54。结果如图4b-4d显示，三个跨膜肽均能够正确引导抗体模块定位于酵母细胞膜。CXCR4和含有3中不同跨膜肽的At-scFv相互作用通过克隆生长和β-Gal活性检测进行评价。TMpho被选择用于后续实验，因为它介导的抗体产生了最强的相互作用信号。

柔性连接肽长度优化

在AACD系统中，柔性肽被用于抗体模块中scFv和跨膜肽之间的柔性连接。我们在这里尝试了4种不同长度的连接肽(如图5a)，来测试抗体和抗原模块之间的相互作用强度，长度分别为0x,3x,6x,or 10xGGGGS。实验结果如图5b-5c证明，使用0长度GGGGS柔性肽的scFv，无法介导报告基因表达，而含有其他3种长度GGGGS柔性肽的scFv所介导的报告基因表达强度基本相同。最终我们选择最短的柔性肽(3xGGGGS)作为后续实验的柔性肽长度，因为较短的柔性肽可以避免抗体和抗原之间的非特异性结合。

抗原蛋白前信号肽的影响

本研究中使用CXCR4作为模型抗原,如图6a。CXCR4是一种7次跨膜蛋白，其本身N末端不带有信号肽，引导其跨膜的信息包含在其7个跨膜肽中。在酵母细胞中，我们确认CXCR4是否可以被正确嵌合在细胞膜中。通常情况下，酵母α信号肽是最常用于以酵母为宿主的蛋白表达系统或酵母表面展示系统中的。它可以引导目标蛋白分泌进入细胞周质。在此，我们比较了CXCR4本身和N末端融合了α信号肽的CXCR4他们的定位情况，以及和抗原模块之间的相互作用情况。实验结果如图6a-6d,证明两种抗原模式均可以正确定位在细胞膜上，而不带有α信号肽的CXCR4模块能够产生更高的报告基因信号。

抗体特异性检测

挑选了6个scFv基因用来评估AACD系统检测抗原抗体相互作用的特异性。6个抗体分别为2个专利公开的CXCR4抗体(At1(US7892546B2)，At2(US10421815B2))，1个专利公开的CXCR5抗体(At3(US9534054B2))和3个无关的抗体序列。抗体模块与CXCR4和CXCR5两个抗原组合，进行杂交实验。

流式细胞实验显示，At1-IgG与CXCR4存在相互作用，而与CXCR5不存在相互作用。而At2-IgG和At3IgG可以同时识别CXCR4和CXCR5。这一结果说明At2和At3可以与CXCR4和CXCR5发生交叉反应，而At1没有。使用AACD系统所获得的结论与流式细胞术结果一直，说明AACD系统可以正确检测抗原-抗体之间的交叉反应。

CXCR4抗原表位测试

为分析CXCR4上介导与At1-scFv相互作用的表位，分别对CXCR4的4个胞外片段进行突变。4个胞外片段分别是1个N端片段(NT)和3个胞外环(ECL)。将这4个片段分别用2xGGGGS柔性肽替换。

结果CXCR4ΔECL1,CXCR4ΔECL2两个突变体与抗体的相互作用完全被阻碍，而CXCR4ΔNT,CXCR4ΔECL3两个突变体与At1-scFv的相互作用仍然存在。这一结果提示，At1-scFv所识别的CXCR4表位是由ECL1和ECL2组成的不连续表位。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

实施例1.多次跨膜蛋白-抗原蛋白的载体构建与表达定位

目的：通过将CXCR4基因与EGFP，Cub，GAL4基因融合表达，达到定位于细胞膜的效果。

质粒构建：

将人的CXCR4(SEQ ID NO.1所示，具体为：

MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS)扩增并测序，与EGFP(SEQ ID NO.2所示，具体为:

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKSGLRSRAQASNSAVDGTAGPGSTGSR)、泛素蛋白C端结构域Cub(SEQ IDNO.3所示，具体为：GIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG)、酵母转录因子GAL4(SEQ ID NO.4所示，具体为:

KLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSAELIPEPPKKKRKVELGTAANFNQSGNIADSSLSFTFTNSSNGPNLITTQTNSQALSQPIASSNVHDNFMNNEITASKIDDGNNSKPLSPGWTDQTAYNAFGITTGMFNTTTMDDVYNYLFDDEDTPPNPKKE)，这四部分的编码序列相融合，整个融合蛋白编码序列克隆至酵母表达载体pGAD-T7中，形成如图7中A所示结构，记为pGAD-T7-CXCR4-EGFP-Cub-GAL4质粒。

阳性对照：

将EGPF、跨膜肽TMwbp1(SEQ ID NO.5所示，具体为：

MARVMRTDWNFFFCILLQAIFVVGTQTSRTLVLYSK)、Cub和GAL4，四部分编码序列相融合，整个融合蛋白克隆至酵母表达载体pGAD-T7中，形成如图7中B所示结构，记为pGAD-T7-EGFP-TMpho-Cub-GAL4质粒。

质粒转染：通过LiAc转化方法转化将pGAD-T7-CXCR4-EGFP-Cub-GAL4和pGAD-T7-EGFP-TMpho-Cub-GAL4质粒至Y187细胞株(MATα,ura3-52,his3-200,ade2-101,trp1-901,leu2-3,112,gal4Δ,met-,gal80Δ,URA3::GAL1

细胞定位观察：荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的细胞定位。如图7中C和D所示，观察结果显示，细胞膜表面有明显的绿色荧光信号，同时细胞膜DiL染色的红色荧光信号也在细胞膜显现，证明CXCR4抗原蛋白能够如所预测的正确表达在细胞膜表面。

实施例2.抗体模块的载体构建与表达定位

目的：通过将At1-scFv基因与EGFP，跨膜肽TMpho，NubG，基因融合表达，达到定位于细胞膜的效果。

质粒构建：

将抗人CXCR4的单链抗体At1-scFv(SEQ ID NO.6所示，具体为：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNSRTRKKYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASKRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSRFLRAFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTSTDYYFSWVRQAPGKGLEWVGFIRTKSKGYTTEYSGSVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAREPITTDPRDYWGQGTLVTVS)编码序列扩增并测序，与EGFP、泛素蛋白N端结构域NubG(SEQ ID NO.7所示，具体为：MQIFVKTLTGKTGTLEVESSDTIDNVKSKIQDKEGIP)、酵母跨膜肽TMpho(SEQ ID NO.8所示，具体为：SWLLAFAGCKPRNVLLMAMCVVFFLSMWISNVAAPVLTYSLLSP)，这四部分相融合，整个融合蛋白克隆至酵母表达载体pGAD-T7中，形成如图8A所示结构，记为pGBK-T7-NubG-TMpho-At1-scFv-EGFP质粒。

阳性对照：

将EGPF、跨膜肽TMpho、NubG，三部分相融合，整个融合蛋白克隆至酵母表达载体pGBK-T7中，记为pGBK-T7-NubG-TMpho-EGFP质粒。

质粒转染：通过LiAc转化方法转化将pGBK-T7-NubG-TMpho-At1-scFv-EGFP和pGBK-T7-NubG-TMpho-EGFP质粒至Y187细胞株，转化子在SD Leu-营养缺陷型培养基上30摄氏度筛选5天。

细胞定位观察：荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的细胞定位。如图8所示，观察结果显示，细胞膜表面有明显的绿色荧光信号，同时细胞膜Dil染色的红色荧光信号也在细胞膜显现，证明At1-scFv抗体蛋白能够如所预测的正确表达在细胞膜表面。

实施例3.CXCR4单链抗体At1-scFv与CXCR4抗原的相互作用检测

目的：观察CXCR4及其单链抗体At1-scFv的相互作用。

原理：当CXCR4蛋白与抗体发生相互作用时，细胞内侧泛素Cub和Nub结构域即被拉近，形成有活性的完整泛素蛋白，随后被细胞内源性泛素特异性蛋白酶消化，释放Cub末端所连接转录因子GAL4，进入细胞核转录报告基因His3、Ade2和LacZ。前两个报告基因帮助细胞在SD-His-Ade-营养缺陷培养基上生长，后者催化培养基中X-a-gal底物显色。其中抗体质粒有两种拓扑结构的形式，分别为Cis和Trans。

质粒构建：

抗原质粒：将人CXCR4基因、Cub和GAL4基因融合至pGAD-T7质粒，记为pGAD-T7-CXCR4-EGFP-Cub-GAL4质粒。

抗体质粒：

Trans结构：将NubG、跨膜肽TMpho、抗CXCR4的单链抗体At1-scFv融合至pGBK-T7质粒，记为pGBK-T7-NubG-TMpho-At1-scFv质粒。

Cis结构:将酵母信号肽、抗CXCR4的单链抗体At1-scFv、跨膜肽WBP1、NubG融合至pGBK-T7质粒，记为pGBK-T7-At1-scFv-WBP1-NubG质粒。

阳性抗体对照：将NubG和跨膜肽TMpho融合至pGBK-T7质粒，记为pGBK-T7-NubG-TMpho质粒。

阴性抗体对照：将NubI和跨膜肽TMpho融合至pGBK-T7质粒，记为pGBK-T7-NubI-TMpho质粒。

质粒转染和杂交：通过LiAc转化方法转化将抗体和抗原质粒至Y187和AH109(trp1-901,leu2-3,112,ura3-52,his3-200,gal4Δ,gal80Δ,LYS2::GAL1

酵母生长检测和β-Gal活性检测

挑取阳性克隆，划线在SD/Leu-Trp-His-Ade-+X-α-gal养缺陷型培养基按照4个10倍稀释梯度涂板(分别为1、0.1、0.01、0.001)，30摄氏度筛选5天，观察克隆生长情况。

将杂交后的酵母(OD600＝0.8,SD/Leu-Trp-)细胞溶解在100毫升Z缓冲液(60mMNa2HPO4,40mM NaH2PO4,10mM KCl,1mM MgSO4,pH 7.0)中，通过三次冻融(液氮和37℃水浴)，然后将细胞溶解产物悬浮在700毫升的Z缓冲液(包含0.27％(v/v)2-巯基乙醇和0.4％ONPG)，30℃的显色反应。30-60min后加入400ml 1m Na

t＝elapsed time(min)

V＝0.1ml×concentration factor

OD600＝A600 of culture

结果：CXCR4与其对应的scFv具有显著的相互作用关系；阴性对照无菌落生长，阳性对照菌落明显生长，并伴随底物显色，说明该实验系统正确可靠，本方法能够定性的研究跨膜蛋白CXCR4和相对应的scFv间的相互作用(图9)。

实施例4.CXCR4 Fab抗体与CXCR4抗原的相互作用检测

原理：采用三杂交模式。Fab的轻链和重链表达后，会在内质网和高尔基体通过二硫键相连形成Fab结构。将轻链与Nub结构域融合。抗原CXCR4蛋白与Cub和转录因子GAL4相融合。当CXCR4蛋白与抗体发生相互作用时，细胞内侧泛素Cub和Nub结构域即被拉近，形成有活性的完整泛素蛋白，随后被细胞内源性泛素特异性蛋白酶消化，释放Cub末端所连接转录因子GAL4，进入细胞核转录报告基因His3、Ade2和LacZ。前两个报告基因帮助细胞在SD-His-Ade-营养缺陷培养基上生长，后者催化培养基中X-a-gal底物显色。

质粒构建：

抗原质粒构建：将pGAD-T7中leu编码基因更换为新霉素基因neomycin(SEQ IDNO.9所示，具体为：

MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRPVLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLSSHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQGLAPAELFARLKARMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRYQDIALATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF)，记为pGND-T7。将人CXCR4基因、Cub和GAL4基因融合至pGAD-T7质粒，记为pGND-T7-CXCR4-EGFP-Cub-GAL4质粒。

轻链质粒构建：将抗体的轻链基因编码序列、跨膜肽TMpho和NubG转入pGBK-T7质粒。记为pGBK-T7-NubG-TMpho-VL。

重链质粒构建：将抗体的重链基因的可变区和恒定区1区编码序列转入pGAD-T7质粒。记为pGAD-T7-VH。

轻链对照质粒：将NubG和跨膜肽TMpho融合至pGBK-T7质粒，记为pGBK-T7-NubG-TMpho质粒。

重链对照质粒：将pGAD-T7空质粒作为重链对照质粒。

实验过程：

1.将抗原质粒pGND-T7-CXCR4-EGFP-Cub-GAL4转化至酵母菌株Y187中，在YPD/G418+平板上筛选，获得转化子CXCR4/Y187菌株。

2.将重链表达质粒pGAD-T7-VH转化至CXCR4/Y187菌株，在SD/Leu-His-Ade-平板上筛选，获得CXCR4/VH/Y187菌株。

3.重链对照质粒pGAD-T7转化至CXCR4/Y187菌株，在SD/Leu-His-Ade-平板上筛选，获得CXCR4/NC-VH/Y187菌株。

4.将轻链表达质粒pGBK-T7-NubG-TMpho-VL转化至AH109菌株中，在SD/Trp-His-Ade-平板上筛选，获得VL/AH109菌株。

5.将轻链对照质粒pGBK-T7-NubG-TMpho转化至AH109菌株中，在SD/Trp-His-Ade-平板上筛选，获得NC-VL/AH109菌株。

6.将重链表达菌株CXCR4/VH/Y187及其对照菌株CXCR4/NC-VH/Y187与轻链表达菌株VL/AH109及其对照菌株NC-VL/AH109分别杂交。杂交方法为，取重链和轻链菌株单克隆1枚，投入0.5ml YPD培养基中，在30℃，200rpm条件下培养16h，离心，用接种针挑取细胞沉淀少量，划线在SD/Leu-Trp-His-Ade-gal+平板上，培养48h，拍照。每个杂交进行4个平行重复。

结果：CXCR4与其对应的Fab具有显著的相互作用关系；重链轻链同时表达的杂交菌株，明显生长，并伴随底物显色；阴性对照无菌落生长。说明该实验系统正确可靠，本方法能够定性的研究跨膜蛋白CXCR4和相对应的Fab间的相互作用(图10)。

实施例5.CXCR5单链抗体与CXCR5抗原的相互作用检测

目的：为了验证系统的普遍适用性，我们用CXCR5及其专利抗体在次验证了系统的可靠性。

质粒构建：

抗原质粒：将人CXCR5基因、Cub和GAL4基因融合，克隆至pGAD-T7质粒，记为pGAD-T7-CXCR5-Cub-GAL4质粒。

抗体质粒：将NubG、跨膜肽TMpho、抗CXCR5的单链抗体At3-scFv融合，克隆至pGBK-T7质粒，记为pGBK-T7-NubG-TMpho-At3-scFv质粒。

抗体阴性对照质粒：将NubG和跨膜肽TMpho融合至pGBK-T7质粒，记为pGBK-T7-NubG-TMpho质粒。

抗体阳性对照质粒：将NubI和跨膜肽TMpho融合至pGBK-T7质粒，记为pGBK-T7-NubI-TMpho质粒。

实验流程：

1.将抗原质粒pGAD-T7-CXCR5-Cub-GAL4转化至Y187菌株，在SD/Leu-His-Ade-平板上筛选获得抗原表达菌株CXCR5/Y187。

2.将抗体质粒、抗体阴性对照质粒和抗体阳性对照质粒分别转化至菌株AH109菌株，获得相应转基因菌株。

3.将抗原表达菌株CXCR5/Y187与抗体菌株及其对照菌株进行杂交，杂交方法同实施例4。将杂交后的菌液，做一系列稀释，滴加在筛选培养基SD/Leu-Trp-His-Ade-gal+上，观察菌体生长和显色。

结果：CXCR5与其对应的scFv杂交菌株生长旺盛，并伴有显色；阴性对照无菌落生长，无显色；阳性对照菌落明显生长，并伴有显色。说明本系统检测出CXCR5与抗体的相互作用，证明该实验系统正确可靠，本方法能够定性的研究跨膜蛋白CXCR5和相对应的scFv间的相互作用(图11)。

实施例6单链抗体对CXCR4和CXCR5的交叉反应识别

目的：抗体与抗原的交叉反应是抗体筛选和验证的重要步骤，而本系统不仅在跨膜蛋白的抗体筛选具有优势，同样也能很好的应用在检测抗体的交叉反应测试当中。为了验证系统的普遍适用性，我们特将多个抗原和抗体进行了杂交，从而观察其相互作用。为了验证结果的可靠性，我们还通过流式验证了抗原抗体的相互作用。

1.质粒构建：

抗原质粒：将人CXCR4基因、Cub和GAL4基因融合克隆至pGAD-T7质粒，记为pGAD-T7-CXCR4-Cub-GAL4质粒。将人CXCR5基因、Cub和GAL4基因融合至pGAD-T7质粒，记为pGAD-T7-CXCR5-Cub-GAL4质粒。

抗体质粒：将NubG、跨膜肽TMpho、抗CXCR4的单链抗体At1-scFv(专利US7892546B2)，和At2-scFv(专利US10421815B2)融合至pGBK-T7质粒，记为pGBK-T7-NubG-TMpho-At1-scFv和pGBK-T7-NubG-TMpho-At2-scFv质粒。将NubG、跨膜肽TMpho、抗CXCR5的单链抗体At3-scFv(专利US9534054B2)融合至pGBK-T7质粒，记为pGBK-T7-NubG-TMpho-At3-scFv质粒，同时选择了3个scFv作为对照，观察与抗原的相互作用。记为At4-scFv，At5-scFv和At6-scFv。

阳性抗体对照：将NubG和跨膜肽TMpho融合至pGBK-T7质粒，记为pGBK-T7-NubI-TMpho质粒。

阴性抗体对照：将NubI和跨膜肽TMpho融合至pGBK-T7质粒，记为pGBK-T7-NubG-TMpho质粒。

2.酵母双杂交：

(1)将表达CXCR4或CXCR5抗原的质粒转化至Y187菌株，用选择培养基SD/Leu-His-Ade-筛选获得抗原表达菌株；

(2)将上述6个抗体表达质粒转化至AH109菌株，用选择培养基SD/Trp-His-Ade-进行筛选，获得抗体表达菌株；

(3)将抗原表达菌株与抗体表达菌株杂交，杂交方法同实施例4。

3.流式抗体检测：

(1)抗体制备

将重链抗体和轻链抗体序列克隆到pcDNA3.4中。然后在ExpiCHO

(2)抗原展示

将CXCR4和CXCR5的ORF与EGFP融合，克隆到pIRES粒体中。然后使用Lipofectamine

(3)流式检测

BHK21细胞(5x10

4.结果：流式细胞术分析结果(图12b和图12c)显示At1-IgG可以与CXCR4互作，但不能与CXCR5互作，而At2-IgG和At3-IgG可以与CXCR4和CXCR5互作。这表明At2与CXCR5发生了交叉反应，At3与CXCR4发生了交叉反应，而At1没有发生交叉反应。同样的结果显示在图12a使用AACD系统测试。这些结果表明AACD系统能够特异性地检测抗原和与之相互作用的抗体，表明该系统具有较高的特异性。

实施例7.CXCR4单链抗体对CXCR4抗原突变体的相互作用检测

目的：在阐述抗体作用的机制当中，抗体作用在抗原的表位检测往往是必不可少的一步。本系统中，通过对膜蛋白的定点突变，可以快速精确到找到抗体所结合的抗原表位。

1.质粒构建：

抗原质粒：根据UniProt数据库，CXCR4的四个细胞外片段，包括一个NT片段和三个细胞外环(ECLs)。将这四个胞外区的多肽分别跟换为柔性肽4x GGGGS,记为CXCR4ΔNT、CXCR4ΔECL1、CXCR4ΔECL2和CXCR4ΔECL3。如图13a。然后将这四个变体蛋白Cub和GAL4基因融合至pGAD-T7质粒中。

抗体质粒：将NubG、跨膜肽TMpho、抗CXCR4的单链抗体At1-scFv融合至pGBK-T7质粒，记为pGBK-T7-NubG-TMpho-At1-scFv质粒。

抗原阳性对照质粒：将人CXCR4基因、Cub和GAL4基因融合至pGAD-T7质粒，记为pGAD-T7-CXCR4-Cub-GAL4质粒。

抗原阴性对照质粒：将跨膜肽WBP1、Cub和GAL4基因融合至pGAD-T7质粒，记为pGAD-T7-WBP1-Cub-GAL4质粒。

2.酵母杂交：

(1)将CXCR4抗原质粒、抗原突变体质粒、阳性对照质粒、以及阴性对照质粒转化至Y187菌株，在选择培养基SD/Leu-His-Ade-筛选，获得相应转基因菌株；

(2)将抗体质粒转化至AH109菌株，用选择培养基SD/Trp-His-Ade-筛选获得抗体表达菌株。

(3)将抗原表达菌株与抗体表达菌株杂交，杂交方法同实施例4。

3.结果：

根据图13b可知，ECL1或ECL2的突变完全阻碍了At1-scFv与CXCR4的相互作用，而NT和ECL3的突变则没有影响At1-scFv与CXCR4的相互作用。同样，CXCR4的结构分析支持了这一结果，ECL1和ECL2靠二硫键连接，而NT和ECL3相距很远。CXCR4的两个环共同构成一个表位，参与了At1-scFv的相互作用。与传统表位检测的方法相比，AACD方法更加简单。

实施例8 AACD系统抗体文库构建

实验目的：构建适用于AACD系统抗体重链表达载体和轻链表达载体，并克隆人外周血单核细胞抗体基因池到重链和轻链表达载体，将构建的文库转化至大肠杆菌。

实验方法:轻链文库表达载体以乙醇脱氢酶1启动子(ADH1 promoter)启动轻链基因，轻链基因由(1)分裂泛素N端结构域、(2)柔性连接肽1、(3)跨膜肽、(4)柔性连接肽2、(5)轻链可变区、(6)轻链恒定区六部分串联组成，基因的转录通过乙醇脱氢酶1终止子(ADH1terminator)终止。其中轻链可变区在载体中被一段无意义序列代替，两侧留有限制性内切酶识别位点。文库构建时通过T4连接将轻链可变区基因池连接到载体中，形成轻链文库。轻链表达载体还带有大肠杆菌DNA复制起始位点pUC、氨苄青霉素(ampicillin)抗性基因、酵母菌复制起始位点2μ、酵母菌营养标记Trp1。轻链表达载体命名为20022。

同理，重链文库表达载体以乙醇脱氢酶1启动子启动重链基因，重链基因由(1)alpha信号肽、(2)重链可变区(VH)、(3)重链恒定区1(CH1)三部分串联组成。其中重链可变区在载体中被一段无意义序列代替，两端留有限制酶识别位点。在文库构建是通过“酶切—连接”的方法将重链可变区基因文库插入该位置，形成重链文库。重链基因转录通过ADH1终止子终止。载体中带有大肠杆菌DNA复制起始位点pUC、卡纳霉素(Kanamycin)抗性基因、酵母菌复制起始位点2μ、酵母菌营养标记Leu2。重链表达载体命名为20018。

采集11人外周血全血，使用淋巴细胞分离液分离获得外周血单个核细胞(PBMC)；使用RNA提取试剂盒提取PBMC总RNA(图14)。使用寡聚脱氧胸苷酸(oligo dT)为引物，逆转录获得总cDNA。使用人类IgG抗体可变区简并引物扩增轻链基因池和重链文库基因池。将基因池用限制性内切酶处理，同时将表达载体用同样内切酶处理，切胶回收。T4连接酶16℃过夜连接，回收纯化后通过电转化方法(2.5kV，25μF，200Ω)转化至大肠杆菌，取小部分样品梯度稀释，用于滴度测定，剩余样品涂布于相应的选择培养基上，37℃培养16小时，之后收集所有菌落，并提取质粒DNA。所建立的轻链和重链文库通过测序确定文库的有效库容。轻链文库命名为20022-L，重链文库命名为20018-H。

实验结果：从11人PBMC提取总RNA逆转录成为cDNA，并使用简并引物扩增，其电泳结果如图15所示。其扩增产物条带大小与预期大小一致，证明实验成功扩增到了重链可变区和轻链可变区序列。将PCR产物用相应的内切酶酶切后，与酶切的载体用T4连接酶连接，连接产物电转化大肠杆菌，用相应抗生素平板筛选，统计克隆数得，重链文库克隆数为5x10

结果显示所有抗体序列均为独特序列。说明所获得的文库多样性充分。

实施例9.从人天然Fab文库中筛选CXCR3抗体序列

构建抗原表达载体：抗原表达载体是用于在宿主酵母菌中表达抗原模块。通过甲硫氨酸25启动子(Met25 promoter)启动抗原模块转录，由Met25终止子终止转录。抗原模块基因包括(1)α信号肽、(2)抗原基因、(3)柔性连接肽、(4)分裂泛素系统C端结构域、(5)转录因子。其中抗原基因在空白载体中被一段无意义序列替代，两侧各包含一个限制性内切酶识别位点，通过“酶切——连接”将目标抗原克隆到该位置。抗原表达载体上还包含了大肠杆菌DNA复制起始位点pUC、氨苄青霉素(ampicillin)抗性基因、酵母菌复制起始位点2μ、G418抗性基因(Neomycin resistant gene)。抗原表达载体命名为20007。

克隆人CXCR3到抗原表达载体。使用外周血cDNA为模板，通过PCR方法扩增CXCR3开放阅读框。引物两翼带有载体相应的内切酶识别位点。将PCR产物切胶回收，并通过内切酶消化。载体20007也用相同内切酶消化，纯化回收。通过T4连接酶连接，转化至大肠杆菌，在Ampicillin平板上筛选转化子。从阳性转化子中提取质粒、测序、确定正确插入的CXCR3的载体，命名为20007-CXCR3。

将抗原模块表达载体20007-CXCR3转化至菌株Y187，构成抗原菌株Y187(20007-CXCR3)。将20018-H文库转化至抗原菌株构成酵母文库Y187(20007-CXCR3,20018-H)文库容量2.5x10

72h后观察筛选平板中克隆生长情况，共取得阳性克隆14株。测定克隆中重链可变区和轻链可变区序列，其中3株为相同克隆，总计获得序列特意的抗体11株。将11株Fab抗体用CHO细胞重组表达，通过流式细胞术检测KD值(Weaver-Feldhaus,Lou et al.2004)，见表1。

表1.CXCR3 Fab抗体亲和力

实施例10.从人天然Fab文库中筛选CXCR4抗体序列

CXCR4抗原载体构建：从人外周血cDNA中扩增CXCR4基因，通过“酶切——连接”的方法将CXCR4插入抗原表达载体20007，获得CXCR4抗原模块表达载体20007-CXCR4(方法同实施例9——CXCR3抗原载体构建)。

将抗原模块表达载体20007-CXCR4转化至菌株Y187，用抗生素G418筛选抗原模块表达菌株Y187(20007-CXCR4)。将20018-H文库转化至Y187(20007-CXCR4)构成轻链酵母文库Y187(20007-CXCR4,20018-H)，文库容量6.8x10

将文库Y187(20007-CXCR4,20018-H)和文库AH109(20022-L)分别在200ml YPD培养基中扩大培养，至OD

72h后观察筛选平板中克隆生长情况，共取得阳性克隆6株。将6株Fab抗体用CHO细胞重组表达，通过流式细胞术检测KD值(Weaver-Feldhaus,Lou et al.2004)，见表2。

表2.CXCR4 Fab抗体亲和力

实施例11.从人天然Fab文库筛选nCov2019 S1蛋白抗体

克隆新型冠状病毒nCov2019 S1蛋白，嵌入抗原模块表达载体20007，获得nCov2019S1蛋白表达载体20007-S1。转化20007-S1表达载体到Y187菌株，G418筛选获得抗原模块细胞株Y187(20007-S1)(方法同实施例9——CXCR3抗原载体构建)。

将20018-H文库转化至Y187(20007-S1)构成酵母文库Y187(20007-S1,20018-H)，文库容量3.7x10

72h后观察筛选平板中克隆生长情况，共取得阳性克隆15株。测定克隆中重链可变区和轻链可变区序列，其中2株为相同克隆，总计获得独特的抗体14株。将14株Fab抗体用CHO细胞重组表达，通过流式细胞术检测KD值(Weaver-Feldhaus,Lou et al.2004)，结果见表3。

表3. 2019nCov S1蛋白Fab抗体亲和力

实施例12.抗体抗原相互作用在AACD信号强度与流式细胞术测定亲和力的相关性检测

将实施例9中所获得的6株CXCR4 Fab抗体与CXCR4抗原表达模块，在AACD系统中检测报告基因β半乳糖苷酶表达强度。β半乳糖苷酶活性表征了抗原和抗体相互作用的强度。挑取每株抗体和抗原的杂合细胞3枚，将细胞在SD/Leu-Trp-培养基中过夜培养至OD

抗体与抗原的亲和力通过流式细胞仪测定。

将AACD系统所测定的报告基因强度与流式细胞仪所测定的亲和力进行相关性分析，两组数据存在显著的正相关(图16)。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种抗原抗体共展示方法用于膜抗原的抗体文库筛选

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 352

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met

1 5 10 15

Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu

20 25 30

Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Ser Ile Ile

35 40 45

Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val Met Gly

50 55 60

Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr Arg Leu His Leu

65 70 75 80

Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val

85 90 95

Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Phe Leu Cys Lys Ala Val

100 105 110

His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala

115 120 125

Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Asn Ser

130 135 140

Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys Val Val Tyr Val Gly Val

145 150 155 160

Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe Ala Asn

165 170 175

Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr Pro Asn

180 185 190

Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln His Ile Met Val Gly Leu

195 200 205

Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser

210 215 220

Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln Lys Arg Lys Ala Leu Lys Thr

225 230 235 240

Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr

245 250 255

Ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu Leu Glu Ile Ile Lys Gln

260 265 270

Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu

275 280 285

Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe

290 295 300

Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln His Ala Leu Thr Ser Val

305 310 315 320

Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly

325 330 335

His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser Phe His Ser Ser

340 345 350

<210> 2

<211> 265

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser

225 230 235 240

Gly Leu Arg Ser Arg Ala Gln Ala Ser Asn Ser Ala Val Asp Gly Thr

245 250 255

Ala Gly Pro Gly Ser Thr Gly Ser Arg

260 265

<210> 3

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr

20 25 30

Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly

35 40

<210> 4

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys

1 5 10 15

Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys

20 25 30

Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu

35 40 45

Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu

50 55 60

Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe

85 90 95

Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser

100 105 110

Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala

115 120 125

Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr

130 135 140

Val Ser Ala Glu Leu Ile Pro Glu Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

145 150 155 160

Glu Leu Gly Thr Ala Ala Asn Phe Asn Gln Ser Gly Asn Ile Ala Asp

165 170 175

Ser Ser Leu Ser Phe Thr Phe Thr Asn Ser Ser Asn Gly Pro Asn Leu

180 185 190

Ile Thr Thr Gln Thr Asn Ser Gln Ala Leu Ser Gln Pro Ile Ala Ser

195 200 205

Ser Asn Val His Asp Asn Phe Met Asn Asn Glu Ile Thr Ala Ser Lys

210 215 220

Ile Asp Asp Gly Asn Asn Ser Lys Pro Leu Ser Pro Gly Trp Thr Asp

225 230 235 240

Gln Thr Ala Tyr Asn Ala Phe Gly Ile Thr Thr Gly Met Phe Asn Thr

245 250 255

Thr Thr Met Asp Asp Val Tyr Asn Tyr Leu Phe Asp Asp Glu Asp Thr

260 265 270

Pro Pro Asn Pro Lys Lys Glu

275

<210> 5

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ala Arg Val Met Arg Thr Asp Trp Asn Phe Phe Phe Cys Ile Leu

1 5 10 15

Leu Gln Ala Ile Phe Val Val Gly Thr Gln Thr Ser Arg Thr Leu Val

20 25 30

Leu Tyr Ser Lys

35

<210> 6

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Lys Arg Lys Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Arg Phe Leu Arg Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Thr Asp Tyr Tyr

145 150 155 160

Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

165 170 175

Phe Ile Arg Thr Lys Ser Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Gly Ser

180 185 190

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu

195 200 205

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Ala Arg Glu Pro Ile Thr Thr Asp Pro Arg Asp Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

245

<210> 7

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Gly Thr Leu Glu

1 5 10 15

Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ser Lys Ile Gln Asp

20 25 30

Lys Glu Gly Ile Pro

35

<210> 8

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ser Trp Leu Leu Ala Phe Ala Gly Cys Lys Pro Arg Asn Val Leu Leu

1 5 10 15

Met Ala Met Cys Val Val Phe Phe Leu Ser Met Trp Ile Ser Asn Val

20 25 30

Ala Ala Pro Val Leu Thr Tyr Ser Leu Leu Ser Pro

35 40

<210> 9

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val

1 5 10 15

Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser

20 25 30

Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe

35 40 45

Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala

50 55 60

Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val

65 70 75 80

Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu

85 90 95

Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys

100 105 110

Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro

115 120 125

Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala

130 135 140

Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu

145 150 155 160

Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala

165 170 175

Arg Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys

180 185 190

Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp

195 200 205

Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala

210 215 220

Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe

225 230 235 240

Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe

245 250 255

Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe

260