高通量单细胞转录组测序方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种基因测序方法，具体涉及一种新型的高通量单细胞转录组测序方法及相应试剂盒，属于分子生物学领域。

背景技术

单细胞转录组能够检测单细胞的异质性，为疾病的诊断和治疗提供精准的信息。受制于单细胞测序技术的处理通量和成本等问题，很多大规模的单细胞表观遗传学的研究工作无法展开。例如，传统的一种方式是利用口吸管进行显微操作，该方法通量低，耗时长，过程繁琐；另一种方式是利用流式细胞仪实施的，该方法样本需求量大，需要精准控制，对细胞有损伤。对于后续建库要求高。

业界推测，微流控技术和单细胞甲基化技术相结合可以很好地解决这些问题。基于这样的预期，研究人员提出了多种方案。例如，美国Fludigm公司于2014年推出了C1单细胞全自动系统，该仪器利用微阀实现单细胞的分离，其通量已提升到一次可以分析数百个单细胞。该系统的出现使得大规模研究单细胞甲基化成为可能。同时由于其可视化操作，可以剔除两个细胞以上的样本。又例如，有厂商提出了Microwell-split pool系统，其可以实现单细胞的分离。又例如，有厂商发展了10X genomics和Biorad系统，其利用微流控芯片将带有标签的微珠和单细胞包裹在一个液滴中，实现单细胞的分离与标记。通量可以达到1万个细胞。但是，这些技术仍或多或少存在一些不足，例如：

前述的C1系统通量较低，目前最多只能做938个细胞，且成本高。前述的Microwell-split pool系统通量也较低，通常为1000-2000个细胞，反应体积大，试剂消耗多，成本高且对细胞损耗大。而前述的10X genomics、Biorad系统之中，液滴生成装置需要用电力驱动，成本高，且每次实验只能同时做4个或者8个样本，灵活性有限。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种高通量单细胞转录组测序文库、高通量单细胞转录组测序方法及相应试剂盒，从而克服现有技术的不足。

为了达到前述发明目的，本发明采用了以下方案：

本发明实施例提供了一种高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其包括：

利用微流控芯片进行单细胞捕获并进行包装，从而生成包含单细胞的油包水反应液滴；

对所述油包水反应液滴中的细胞进行裂解、反转录，获得反转录产物；

对所述油包水反应液滴进行破乳处理，并对所述反转录产物进行预扩增处理，获得预扩增产物；

对所述预扩增产物进行片段化处理，之后在获得的片段化产物两端添加接头，生成测序文库。

在一些实施方式中，所述的构建方法具体包括：

提供微流控芯片，其包括细胞微流道、细胞隔离介质微流道、细胞标签微流道和单细胞样本收集口；

将细胞悬液、细胞标签悬液分别注入微流控芯片，并使细胞悬液、细胞标签悬液在分别流经细胞微流道、细胞标签微流道后相互混合形成细胞载液；

将细胞隔离介质注入微流控芯片，且使细胞隔离介质在细胞隔离介质微流道内流动时与细胞载液接触，并对细胞载液进行剪切、包裹，从而形成包含单细胞和单个细胞标签的油包水反应液滴；

以及，从单细胞样本收集口处收集所述油包水反应液滴。

在一些实施方式中，所述油包水反应液滴还包含细胞裂解试剂和RNA反转录试剂。

在一些实施方式中，所述细胞标签悬液包含可变形微珠和携带标签的polyT引物，所述polyT引物连接在可变形微珠上，并且所述polyT引物能够在物理作用和/或化学作用下脱离可变形微珠。

本发明实施例还提供了一种高通量单细胞转录组测序方法，其包括：采用前述的任一种方法构建单细胞转录组测序文库，之后进行测序分析。

本发明实施例还提供了一种试剂盒，用于构建高通量单细胞转录组测序文库，其包括：

微流控芯片，至少用于捕获单细胞并进行包装，从而生成油包水反应液滴，所述油包水反应液滴包括油相和被油相包裹的细胞液相，并且所述油包水反应液滴包含单细胞、单个细胞标签、细胞裂解试剂以及RNA反转录试剂；

用于形成所述油相的油；

细胞裂解试剂；

RNA反转录试剂；

细胞标签，包括可变形微珠和连接在可变形微珠上的带标签的polyT引物，所述带标签的polyT引物能够在物理作用和/或化学作用下脱离可变形微珠；以及

cDNA预扩增试剂、转座片段化试剂和在片段化产物两端连接接头所需的试剂。。

在一些实施方式中，所述微流控芯片包括细胞微流道、细胞隔离介质微流道、细胞标签微流道和单细胞样本收集口，所述细胞微流道具有细胞悬液入口和单细胞悬液出口，所述细胞隔离介质微流道具有细胞标签悬液入口和细胞标签悬液出口，并且所述单细胞悬液出口与细胞标签悬液出口交会，使所述细胞微流道输出的单细胞悬液能够与所述细胞标签微流道输出的细胞标签悬液混合形成细胞载液，所述细胞载液的流动路径与所述细胞隔离介质微流道交叉，从而使在所述细胞隔离介质微流道内流动的细胞隔离介质能够剪切并包裹细胞载液，从而形成包含单细胞的油包水反应液滴，所述包含单细胞的油包水反应液滴由单细胞样本收集口输出。

进一步的，所述细胞微流道的尾部区域设置为单细胞通道，所述单细胞通道的宽度等于或稍大于单细胞直径，所述单细胞通道的出口与细胞标签微流道的出口交会，使得从所述细胞微流道输出的单细胞悬液与从所述细胞标签微流道输出的细胞标签悬液混合形成细胞载液，所述细胞载液的连续流动路径与所述细胞隔离介质微流道交叉，使得流经所述细胞隔离介质微流道的细胞隔离介质能够将连续的细胞载液剪切为离散液滴状的细胞液相并使每一细胞液相包含单细胞和单个细胞标签，同时使所述细胞隔离介质作为油相对所述细胞液相进行包裹，从而形成所述油包水反应液滴。

本发明采用凝胶微珠构建细胞标签，并在油包水反应液滴中进行逆转录，同时利用空气泵等作为动力源驱动油包水反应液滴生成，可以同时做多个样本，有效的提高细胞的捕获效率，减少了液滴破乳之后的微珠相互污染，提高的有效数据的占比，同时降低了成本，使用方式更为灵活，整体操作时间相比较于现有的indrop和dropseq平台，由30小时缩短至7个小时，使得操作更容易。

总而言之，较之现有技术，本发明提供的高通量单细胞转录组测序方法在提高细胞通量的同时降低了成本，通量与目前市场上最高的10x genomics相当，单次实验可达2000-17000个细胞，成本却为10X genomics的三分之一以下，人力成本也大大降低，使得大规模进行单细胞测序研究成为可能。

附图说明

图1是本发明一典型实施方式中一种高通量单细胞转录组测序方法的工艺流程图；

图2是本发明一典型实施方式中一种微流控芯片的结构示意图；

图3是本发明一典型实施方式中于微流控芯片中生成油包水反应液滴时的光学照片；

图4是本发明一具体实施案例中细胞样本活性的检测结果；

图5是本发明一具体实施案例中生成的油包水反应液滴的光学照片；

图6是本发明一具体实施案例中cDNA预扩增产物的Labchip检测图谱；

图7是本发明一具体实施案例中测序文库的Labchip检测图谱；

图8A-图8C分别示出了本发明一具体实施案例中单细胞的nGene、nUMI、percent.Mito分布情况；

图9是本发明一具体实施案例中的细胞分群情况；

图10是本发明一具体实施案例中read1的测序质量评估结果；

图11是本发明一具体实施案例中read2的测序质量评估结果。

具体实施方式

本发明实施例的一个方面提供了一种高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其包括：

利用微流控芯片进行单细胞捕获并进行包装，从而生成包含单细胞的油包水反应液滴；

对所述油包水反应液滴中的细胞进行裂解、反转录，获得反转录产物；

对所述油包水反应液滴进行破乳处理，并对所述反转录产物进行预扩增处理，获得预扩增产物；

对所述预扩增产物进行片段化处理，之后在获得的片段化产物两端添加接头，生成测序文库。

在一些实施方式中，所述构建方法具体包括：

提供微流控芯片，其包括细胞微流道、细胞隔离介质微流道、细胞标签微流道和单细胞样本收集口；

将细胞悬液、细胞标签悬液分别注入微流控芯片，并使细胞悬液、细胞标签悬液在分别流经细胞微流道、细胞标签微流道后相互混合形成细胞载液；

将细胞隔离介质注入微流控芯片，且使细胞隔离介质在细胞隔离介质微流道内流动时与细胞载液接触，并对细胞载液进行剪切、包裹，从而形成包含单细胞和单个细胞标签的油包水反应液滴；

以及，从单细胞样本收集口处收集所述油包水反应液滴。

在一些实施方案中，所述微流控芯片包括细胞微流道、细胞隔离介质微流道、细胞标签微流道和单细胞样本收集口，所述细胞微流道具有细胞悬液入口和单细胞悬液出口，所述细胞隔离介质微流道具有细胞标签悬液入口和细胞标签悬液出口，并且所述单细胞悬液出口与细胞标签悬液出口交会，使所述细胞微流道输出的单细胞悬液能够与所述细胞标签微流道输出的细胞标签悬液混合形成细胞载液，所述细胞载液的流动路径与所述细胞隔离介质微流道交叉，从而使在所述细胞隔离介质微流道内流动的细胞隔离介质能够剪切并包裹细胞载液，从而形成包含单细胞的油包水反应液滴，所述包含单细胞的油包水反应液滴由单细胞样本收集口输出。

当然，还可以在所述单细胞悬液出口和细胞标签悬液出口的交会处与细胞隔离介质微流道之间设置供细胞载液流动的一个过渡段，其可以命名为细胞载液微流道(参阅图2中的附图标记13)，该细胞载液微流道与细胞隔离介质微流道交叉。

进一步的，所述细胞微流道的尾部区域设置为单细胞通道，所述单细胞通道的宽度等于或稍大于单细胞直径，所述单细胞通道的出口与细胞标签微流道的出口交会，使得从所述细胞微流道输出的单细胞悬液与从所述细胞标签微流道输出的细胞标签悬液混合形成细胞载液，所述细胞载液的连续流动路径与所述细胞隔离介质微流道交叉，使得流经所述细胞隔离介质微流道的细胞隔离介质能够将连续的细胞载液剪切为离散液滴状的细胞液相并使每一细胞液相包含单细胞和单个细胞标签，同时使所述细胞隔离介质作为油相对所述细胞液相进行包裹，从而形成所述油包水反应液滴。

进一步的，所述油包水反应液滴是作为油包水微反应器，其大小可以是皮升级的。

进一步的，所述微流控芯片还包括分别与所述细胞微流道、细胞隔离介质微流道、细胞标签微流道连通的细胞悬液加样杯、细胞隔离介质加样杯、细胞标签加样杯。

在一些实施方案中，所述单细胞样本收集口处设置有负压动力生成装置。所述负压动力生成装置可以采用空气泵等，其可以在微流控芯片内产生负压，从而驱使各微流道中的流体流动。例如，可以在单细胞样本收集口处用空气泵向外抽取空气，给微流控芯片整体施加-4K～-10K Pa的负压。通过采用此种负压方式，且设置芯片为3通道，不需要用动力驱使，相比现有技术中的正压驱动、多通道(4通道以上)，操作更方便，时间也大大缩短，可以做微量样本，灵活性更高，可以同时做1到8个样本。

进一步的，前述实施方案中的一种微流控芯片的结构可以参阅图2所示，包括细胞悬液加样杯1、细胞标签加样杯2、细胞隔离介质加样杯4，该细胞悬液加样杯1、细胞标签加样杯2、细胞隔离介质加样杯4分别与细胞微流道11、细胞标签微流道12、细胞隔离介质微流道14连通，同时所述微流控芯片还设有单细胞样本收集口3。其中，细胞微流道11、细胞标签微流道12相互交叉后，还与细胞隔离介质微流道14交叉，进而与单细胞样本收集口3连通。

在本发明的以上实施例中，微流控芯片的细胞微流道为用于形成细胞液相的一个组分的细胞悬液的流动通道，细胞标签通道为用于形成细胞液相的另一个组分的细胞标签悬液的流动通道，细胞隔离介质微流道为作为油相的组份的流动通道，所有组份均在芯片上增加压力的情况下，随其流动通道按一定速度流动，且细胞悬液和细胞标签悬液混合形成的细胞载液并被作为油相的细胞隔离介质切割，形成物理隔离，通过控制压力和流阻设计，实现细胞隔离介质对单个细胞和细胞标签进行切割，实现了单个细胞和凝胶微珠的分离，确保每个油包水反应液滴作为一个微反应体系且包含一个细胞和一个细胞标签。

在一些实施方案中，所述油相包含油和细胞裂解试剂，所述细胞液相包含RNA反转录组件。

在一些实施方案中，所述油与细胞裂解试剂的体积比为100：1～500：1，例如可以为100：1、200：1、300：1、500：1等，但不限于此。

在一些实施方案中，所述细胞标签包括带标签的polyT引物和可变形微珠，所述带标签的polyT引物连接在可变形微珠上，并且所述带标签的polyT引物能够在物理作用和/或化学作用下脱离可变形微珠。

其中，通过所述polyT引物内的polyT序列，可以更好的捕获RNA。

进一步，所述物理、化学作用包括本领域技术人员熟知的各种物理、化学作用，例如可以优选采用紫外光辐照方式或者特异性酶切等，且不限于此。例如，所述polyT引物可以标记为紫外敏感、光照敏感或者可以被特异性酶切的寡核苷酸链，且不限于此。本发明通过物理或化学的方式使得微珠上带标签的序列解离下，可以三维立体的捕获游离在油包水微反应体系中的mRNA，相比于直接用微珠上的序列捕获mRNA的方式，效率要更高。在本发明中优选采用紫外光照等方式使带标签的polyT引物脱离可变形微珠，其不仅非常便捷，而且还不会向微反应体系内引入其它化学物质，从而可以避免潜在的污染风险，另外，游离的带标签的polyT引物捕获目的产物效率更高，可以消除固定在微珠上的引物捕获目的产物时因微珠的空间位阻效应而导致的捕获效率低等问题。

进一步的，所述标签包括用于标识细胞的条形码。所述条形码的长度可以为4-30nt，但不仅限于此长度范围的碱基序列及一定顺序排列组合。

更进一步的，所述条形码可以包含3段但不仅限于3段的恒定碱基序列。

更进一步的，所述条形码可以包含3nt的但不仅限于3nt的riboG碱基。

更进一步的，所述带标签的polyT引物的总长度可以为50nt-200nt不等，且不限于此。

在一些实施方案中，所述带标签的polyT引物可以通过化学和/或物理方式与可变形微珠连接。例如，所述polyT引物与微珠可以通过共价键、化学聚合、抗原抗体结合、酶催化的连接反应等方式进行连接，且不限于此。

在一些实施方案中，所述可变形微珠可以是有机材质或者无机-有机复合材质的，例如可以为聚丙烯酰胺凝胶微珠、琼脂糖凝胶微珠、琼脂糖包裹的磁性微珠、硅珠、惰性材料制备的微珠等，且不限于此。优选的，所述可变形微珠可以选用凝胶微珠，其有利于进一步提高所述微流控芯片进行油包水反应液滴包装的效率，以及协同微流控芯片而大幅提升细胞通量。其机理可能在于：由于采用可变形微珠，从而使得每个油包水反应液滴里均可包上带分子标签的微珠，单包裹率可以达到100％，而若替换为硬微珠，则在液滴包裹时要遵从泊松分布规则，实际包裹效率远低于可变形微珠。进一步的，在本发明中优选采用多孔的聚丙烯酰胺微珠，因其比表面积远大于其它微珠，例如树脂或磁性微珠等硬微珠的比表面积，故所携带的引物远远多于其它微珠。合成所述聚丙烯酰胺微珠时，使用的丙烯酰胺单体浓度可以为1％-10％。

在一些实施方案中，所述微珠的直径可以为10μM-200μM。

在本发明的前述实施例中，利用所述微流控芯片，在相同浓度细胞的情况下，单口双包率是双口的1/2，不同细胞大小可以通过调整压力(例如，以负压动力生成装置产生的压力作为动力)来实现包裹，特别是在利用负压动力生成装置作为动力源时，还可以快速高效地完成细胞包裹，以及，利用凝胶微珠形成细胞标签时，其悬液流速有冲击力，流速可控，可以实现90％以上的包裹率。

以及，在本发明的前述实施例中，通过微流控芯片技术可以实现皮升级的油包水微反应器，相较于现有技术中在96孔板中进行分离等方式，在相同数量的反转录组份的情况下，可以检测数量更多的细胞，极大地降低的单个细胞的检测成本，并且通过增加了负载在凝胶微珠上的分子标签，还可实现多达17000个细胞的分离和检测。

在一些实施方式中，所述油包水反应液滴还包含细胞裂解试剂和RNA反转录试剂，所述细胞裂解试剂包含细胞裂解酶或其它能促使细胞裂解的物质，所述RNA反转录试剂包含反转录引物、RNA反转录酶和RNA反转录酶抑制剂等。

本发明通过采用模版转换方式在油包水反应液滴内进行逆转录反应，同时在液滴外结合转座酶建库的方式，逆转录到建库整体流程耗时小于8小时，而与之形成鲜明对比的是，现有技术中所采用的体外转录方式耗时一般都超过30小时。并且，本发明采用的逆转录反应方式，还可避免在液滴外进行逆转录而导致的交叉污染，有效降低双包率，减少假阳性结果。以及，还利于简化后续的建库操作，例如，无需采用操作复杂且耗时的末端加A建库方式。

在一些实施方式中，所述的构建方法还包括：

对所述油包水反应液滴进行破乳处理后，依次对所述反转录产物进行纯化、预扩增处理，获得预扩增产物；

对所述预扩增产物进行纯化处理后，再采用转座酶进行片段化处理，并在片段化反应终止后，对所获片段化产物进行纯化处理；

在纯化后的片段化产物两端添加接头，生成测序文库，并对测序文库进行纯化处理。

其中，所述破乳处理优选采用超声等物理破乳方式，避免化学破乳方式存在的化学组分如PFO对后续反应的影响。

在一些实施方式中，所述的构建方法还可以包括对“待测样本”或“待测样品”进行前处理的步骤。但是，应用本发明实施例提供的方法，对前处理的要求较低，例如，可以根据细胞的物理特性或生物特性进行初步富集，所获得的样本即可用于后续步骤。

在本说明书中，“待测样本”或“待测样品”可以来自于个体(如人的血液、生物组织等)，也可以是其它来源的，例如一些经处理或未经处理的实验室材料。另外，在本说明书中，对于“样本”或“样品”的检测并非仅涉及诊断目的，还可涉及其它非诊断目的。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种试剂盒，用于构建高通量单细胞转录组测序文库，其包括：

微流控芯片，至少用于捕获单细胞并进行包装，从而生成油包水反应液滴，所述油包水反应液滴包括油相和被油相包裹的细胞液相，并且所述油包水反应液滴包含单细胞、单个细胞标签、细胞裂解试剂以及RNA反转录试剂；

用于形成所述油相的油；

细胞裂解试剂；

RNA反转录试剂；

细胞标签，包括可变形微珠和连接在可变形微珠上的带标签的polyT引物，所述带标签的polyT引物能够在物理作用和/或化学作用下脱离可变形微珠；以及

cDNA预扩增试剂、转座片段化试剂和在片段化产物两端连接接头所需的试剂。

在本实施例提供的试剂盒中，所述微流控芯片的结构与工作原理如上文所述，此处不再赘述。

在一些实施方式中，所述油相包含油和细胞裂解试剂。其中，所述油与细胞裂解试剂的体积比为100：1～500：1，例如可以为100：1、200：1、300：1、500：1等，但不限于此。

在一些实施方式中，所述细胞液相包含单细胞、单个细胞标签和RNA反转录试剂。

在本实施例提供的试剂盒中，所述细胞标签的组成可以如前文所述，此处不再赘述。

在一些实施方式中，所述的试剂盒还包括：对反转录产物、cDNA预扩增产物、片段化产物和测序文库中的任一者或多者进行纯化所需的试剂，例如磁珠等，且不限于此。

在本发明的前述实施例中，所述细胞裂解试剂可以选用本领域技术人员所熟知的类型，其可以包含本领域技术人员所熟知的任何适用于细胞裂解的蛋白酶和蛋白变性试剂以及裂解缓冲体系等。

在本发明的前述实施例中，所述RNA反转录试剂可以包含RNA反转录引物和本领域技术人员所熟知的RNA反转录酶、RNA反转录酶抑制剂和RNA反转录缓冲液等。

例如，所述反转录酶可以包括M-MLV反转录酶，其是一种RNA模板依赖性DNA聚合酶。

例如，所述反转录缓冲液的主要成分可以为Tris-HCl、KCl、MgCl

在本发明的前述实施例中，所述cDNA预扩增试剂可以包含cDNA预扩增引物和本领域技术人员所熟知的DNA聚合酶和扩增缓冲液。例如，所述扩增缓冲液即cDNA预扩增反应液的主要成分可以包括：KCl、NH

在本发明的前述实施例中，所述DNA聚合酶可以是本领域技术人员所熟知的任何热稳定的DNA聚合酶，例如：LA-Taq，rTaq，Phusion，Deep Vent，Deep Vent(exo-)，Gold360，Platinum Taq，KAPA 2G Robust等，且不限于此。

在本发明的前述实施例中，所述转座片段化试剂可以包含本领域技术人员所熟知的转座酶、转座酶反应缓冲液和转座反应终止液等。例如，所述转座酶可以选用Tn5等，且不限于此。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种高通量单细胞转录组测序方法，其包括：采用前述的任一项方法构建单细胞转录组测序文库，之后进行测序分析。

进一步的，所述测序分析亦可以是依照本领域技术人员熟知的方式操作。例如可以参考图4，其可以包括基本分析、标准分析和高级分析。

本发明前述实施例采用凝胶微珠构建细胞标签，并在油包水反应液滴中进行逆转录，同时利用空气泵等作为动力源驱动油包水反应液滴生成，可以同时做多个样本，有效的提高细胞的捕获效率，减少了液滴破乳之后的微珠相互污染，提高的有效数据的占比，同时降低了成本，使用方式更为灵活，整体操作时间相比较于现有的indrop和dropseq平台，由30小时缩短至7个小时，使得操作更容易。此外用紫外或者其他化学方式释放微珠上的引物，可以三维立体的捕获游离在液滴里的mRNA，相比于常规直接用连接在微珠上的引物捕获mRNA的效率更高。更具体地讲，本发明通过在油包水反应液滴内进行逆转录，细胞捕获效率高，通量可高达10

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。若非特别说明，则下列实施例中使用的各种试剂均是本领域技术人员熟知的，并可以通过市场购买等途径获取。而下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

如下实施例所使用的一种用于构建人单细胞BCR测序文库的试剂盒包含有单细胞免疫组库文库构建所需的试剂及耗材，例如：具有单细胞分离和油包水反应液滴生成功能的微流控芯片；生成所述反应液滴所需的油；载有带标签的polyT引物的水凝胶微珠；反转录引物(参阅SEQ ID NO:1)；RNA反转录酶；RNA反转录缓冲液；无核酸酶水；Taq聚合酶反应液；cDNA扩增反应缓冲液；cDNA扩增引物(参阅SEQ ID NO:2)；cDNA扩增酶；转座酶反应缓冲液；转座酶；转座反应终止液；用于双链DNA纯化的磁珠；用于文库扩增的接头，等等，且不限于此。若非特别说明，前述这些试剂均可以从市场购得。例如，如下实施例所用的纯化磁珠可以优选为Beckman公司的Ampure XP beads、Beckman公司的SPRI beads等，且不限于此。

参阅图1所示，如下实施例的测序文库构建及测序过程可以包括如下步骤：

(1)消化组织或者细胞得到单细胞悬液；

(2)利用载有带标签的polyT引物的水凝胶微珠作为细胞标签和液滴微流控技术(基于图2所示微流控芯片实施)，将单细胞悬液与细胞标签分别包裹在油包水反应液滴(如下简称“液滴”)中，对液滴进行处理(例如UV光照)后，水凝胶微珠上带标签的polyT引物释放出来，使得带标签的polyT引物通过polyT捕捉mRNA；

(3)在一定温度下(例如55℃)孵育液滴一定时间(例如1.5h)，mRNA逆转录为cDNA；

(4)破乳，利用磁珠等提取cDNA；

(5)通过超声和PCR等方式使提取的cDNA片段化并在两侧加上测序接头；

(6)将建好的文库进行二代测序，测序方案可以为PE150或其它方案；

(7)信息数据解读，确定细胞亚群。

以下对该实施例的具体实施过程作更为详尽的说明。

1.实验准备

1.1 油相(即前述细胞隔离介质，组成详见表1)

表1油相组分

1.2 细胞相(即，细胞悬液)(详见表2)

表2细胞相组分

注：细胞相细胞使用荧光细胞分析仪检测出浓度和活性后，根据实验需要计算出所需体积。

1.3 beads相(即，细胞标签悬液)(详见表3)

表3水相组分

注：Beads使用荧光细胞分析仪检测出浓度和直径后，根据实验需要计算出所需体积。

构成该细胞标签的凝胶微珠可以选自直径为10μM-200μM的聚丙烯酰胺凝胶微珠、琼脂糖凝胶微珠等，连接于凝胶微珠上的ployT引物为紫外敏感的寡核酸链，其长度可以为50nt-200nt，其中包含长度为8nt左右的条形码，该条形码可以包含3段或更多恒定碱基序列，以及该条形码可以包含3nt或更多的riboG碱基。例如，所述细胞标签可以表示为：微珠-5’-CGATGACGCTACACGACGCTCTTCCGATCTACjjjjjjjjGTGATTGCTTGTGACjjjjjjjjCGACTCACACTACACGCjjjjjjjjNNNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。其中，j、N所示序列为标签序列，其可以为随机序列。

2.实验操作及结果展示

2.1 细胞准备

2.1.1

根据处理样本数量的需求取适量PBS溶液提前半小时放入水浴锅中预热。

2.1.2

取新鲜肺癌样本1cm

2.2 单细胞包裹

2.2.1 上机生成液滴

单细胞悬液、细胞标签悬液、油相分别加入图2所示微流控芯片。按空气泵，使体积由20ml拉至30ml。其中产生油包水反应液滴的过程如图3所示。生成液滴的形态如图5所示。

2.2.2 cDNA逆转录

将收集管处的温控设置按如下设置：进行RT反应(反应温度：42℃反应时间：90min)，获得RT产物(即cDNA)。

2.2.3 破乳

在收集管中加入3ml PFO，用枪头吹打15次，离心(800g，10min，4℃)，取上清，其中含有RT产物，即cDNA；

2.3 RT产物纯化

2.3.1 提前将

2.3.2

2.3.3 将RT产物转移至一个新的1.5mL离心管中，并将样品体积补齐至250μL；

2.3.4 向样品中加入300μL Lysis/binding Buffer，上下颠倒混匀，室温放置5min；

2.3.5 向上一步骤的反应液中加入150μL异丙醇，加入50μL混匀的

2.3.6 瞬时离心离心管，收集管盖上的样品溶液，将离心管放置于磁力架上2min至溶液澄清，吸弃上清液；

2.3.7 将离心管管从磁力架上取下，向其中加入850μL的Washing Buffer 2，吹吸混匀4-5次，将离心管放置于磁力架上2min至溶液澄清，吸弃上清液；

2.3.8 重复步骤2.3.7一次；

2.3.9 将离心管从磁力架上取下，向其中加入450μL的Washing Buffer 1，吹吸混匀4-5次，并将溶液转移至一个新的1.5mL离心管中；将离心管放置于磁力架上1min至溶液澄清，吸弃上清液；

2.3.10 重复步骤2.3.9一次，不需要换新的1.5mL离心管；

2.3.11 室温晾干磁珠10-15min；

2.3.12 加入30μL RNase Free H

2.3.13 对纯化后的逆转录产物进行Qubit定量，记录浓度。

2.4 cDNA预扩增

2.4.1 配制反应体系及设置反应程序

1)PCR反应体系：

2)PCR反应程序：

选用0.6×KAPA Pure beads纯化产物，进行2100检测，其中主峰在1.2-1.7K左右，参阅图6所示。

2.4 文库构建

2.4.1 片段化处理

配制反应体系及设置反应程序

1)反应体系：

2)反应程序：

2.4.2 终止片段化

反应结束后，立即去除PCR管，加入10μL 6×Termination Buffer，吹吸混匀，室温孵育5min。

2.4.3 纯化片段化产物((1.0×KAPA Pure beads纯化)

2.4.4 PCR富集，加接头

配制反应体系及设置反应程序

1)反应条件：

2)反应程序：

2.4.5 用0.6×+0.15×KAPA Pure beads纯化文库后，用2100检测，其中主峰为464bp左右，参阅图7。

3.测序分析

该测序流程采用PE150测序方案，其可以在Illumina Nova Seq、Illumina Hiseq、Illumina Nextseq 500以及Illumina Miseq等平台上进行，相应操作方法及实验条件均是本领域技术人员熟知的。

对于本实施例而言，图8A表示每个单细胞基因检测数。图8B表示捕获的细胞转录本数量。图8C表示每个细胞线粒体基因的检测数，表示细胞的活性状态。图9示出了细胞分群情况，其中根据每个细胞的基因表达量的差异性，用降维分析，分成不同的亚群，每个颜色表示不同的群。本实施例的测序数据质量评估结果如图10-图11所示。

利用与本发明实施例相同的细胞样本，并按照本领域技术人员已知的方式，基于10X Genomics平台进行对照的测序试验，将所获测序结果与本发明实施例的测序结果比对，可以发现，利用本发明实施例的方法，所获测序结果准确、灵敏度高，且效率、成本等均远远优于基于10X Genomics平台的测序方案。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 苏州绘真生物科技有限公司

<120> 高通量单细胞转录组测序方法及试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

tacacgacgc tcttccgatc tgaatrgrgg 30

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

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