溶酶体贮积症的生物标志物及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年12月10日提交的美国临时申请序列号62/777,599、2019年6月11日提交的美国临时申请序列号62/860,039、2019年7月1日提交的美国临时申请序列号62/869,387以及2019年10月8日提交的美国临时申请序列号62/912,253的优先权。以上引用的申请的全部内容以引用的方式并入本文中。

背景技术

溶酶体贮积症(lysosomal storage disorder，LSD)是由溶酶体功能缺陷导致的相对罕见的遗传性代谢疾病。LSD通常是由参与溶酶体中代谢产物分解的单一酶的缺乏引起的。由于缺乏酶活性而导致的产物堆积会影响各种器官系统，并可能导致严重的症状和过早死亡。大多数LSD还具有重要的神经系统成分，范围从进行性神经变性和严重的认知障碍到癫痫、行为和精神疾病。尽管已经进行了大量研究来研究LSD的根本分子机制并开发新的治疗方法，但仍需要进行其它工作。具体地说，需要用于例如评估患者和疗法以及用于筛选治疗活性剂的新的LSD生物标志物。

发明内容

因此，本文所述的某些实施方案提供一种检测患有溶酶体贮积症(LSD)的受试者中的一种或多种生物标志物的方法，所述方法包括：

1)测量来自所述受试者的样品中的两种或更多种脂质的组合的浓度，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

a)双(单酰基甘油)磷酸酯(BMP)；

b)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

c)GD3神经节苷脂；

d)GD1a/b神经节苷脂；以及

e)葡萄糖基神经酰胺(GlcCer)；

2)测量来自所述受试者的样品中的GlcCer的浓度，条件是所述LSD是粘多糖贮积病(MPS)病症；

3)测量来自所述受试者的样品中的神经丝轻链(Nf-L)的浓度；和/或

4)测量来自所述受试者的样品中的在髓样细胞上表达的可溶性触发受体2(sTREM2)的浓度。

本发明的某些其它实施方案提供一种治疗受试者的LSD的方法，所述方法包括：

1)向所述受试者施用LSD治疗；

2)测量以下的浓度：

a)来自所述受试者的样品中的两种或更多种脂质的组合，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

i)BMP；

ii)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

iii)GD3；

iv)GD1a/b；以及

v)GlcCer；

b)来自所述受试者的样品中的GlcCer，条件是所述LSD是MPS病症；

c)来自所述受试者的样品中的Nf-L；和/或

d)来自所述受试者的样品中的sTREM2；以及

3)基于与对照值相比来自所述受试者的所述样品中的所选脂质/蛋白质的浓度，调整所述LSD治疗的剂量。

附图说明

图1.IDS KO小鼠中相对于年龄匹配的对照的脑HS/DS(GAG)积聚。对于每个年龄分组，野生型(WT)展示在左侧并且IDS KO展示在右侧。

图2A-2D.相对于年龄匹配的对照，溶酶体脂质(GM2、GM3、BMP和GlcCer)积聚在IDSKO小鼠的脑中。在图2B-2D中，对于每个年龄分组，代表WT的条展示在左侧并且代表IDS KO的条展示在右侧。

图3.相对于年龄匹配的对照，在IDS KO小鼠的血清中观察到BMP的水平升高。对于每个年龄分组，代表野生型(WT)的条展示在左侧并且代表IDS KO的条展示在右侧。

图4.相对于年龄匹配的对照，在IDS KO小鼠的CSF中观察到溶酶体脂质(Gd1a/b、GM3、BMP和GlcCer)的水平升高。对于每个年龄分组，代表野生型(WT)的条展示在左侧，并且代表IDS KO的条展示在右侧。

图5A-5B.ETV:IDS的外周施用(4周处理)校正了IDS KO小鼠中的(图5A)脑和(图5B)CSF GAG积聚。图表显示平均值±SEM和p值：单向ANOVA与邓尼特多重比较检验(Dunnettmultiple comparison test)；*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，且****p≤0.0001。

图6.ETV:IDS的外周施用(4周处理)校正了IDS KO脑中的溶酶体脂质(神经节苷脂)积聚。图表显示平均值±SEM和p值：单向ANOVA与邓尼特多重比较检验；*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，且****p≤0.0001。

图7A-7B.ETV:IDS的外周施用(4周处理)校正了IDS KO脑中的溶酶体脂质(GlcCer)积聚。图表显示平均值±SEM和p值：单向ANOVA与邓尼特多重比较检验；*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，且****p≤0.0001。

图8.ETV:IDS的外周施用(4周处理)校正了IDS KO脑中的溶酶体脂质(BMP)积聚。图表显示平均值±SEM和p值：单向ANOVA与邓尼特多重比较检验；*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，且****p≤0.0001。

图9.示出用媒介物、ETV:IDS或Elaprase(艾杜硫酶(idursulfase))处理的IDS KO小鼠的脑中的脂质水平的热图。变化倍数是与WT相比。

图10.ETV:IDS的外周施用校正了IDS KO脑中的TREM2积聚。图表显示平均值±SEM和p值：单向ANOVA与邓尼特多重比较检验；****p 0.0001。

图11.ETV:IDS的外周施用减少IDS KO；TfR

图12A-12C.用媒介物或3、10、20或40mg/kg ETV:IDS处理的IDS KO小鼠中的血清(图12A)、脑(图12B)和CSF(图12C)HS/DS(GAG)积聚。

图13A-13C.与用媒介物处理的IDS KO小鼠相比，ETV:IDS的外周施用校正了用3、10、20或40mg/kg ETV:IDS处理的IDS KO小鼠脑中的GM3(图13A)、GlcCer(图13B)和BMP(图13C)积聚。图表显示平均值±SEM和p值：单向ANOVA与邓尼特多重比较检验；*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，且****p≤0.0001。

图14A-14B.与用媒介物处理的IDS KO小鼠相比，ETV:IDS的施用减少来自IDS KO小鼠的脑(图14A)和CSF(图14B)中的单独GAG物质(D0S0、D0A0和D0a4)的水平。图表显示平均值±SEM和p值：单向ANOVA与邓尼特多重比较检验；**p≤0.01，***p≤0.001，且****p≤0.0001。

图15A-15C.图15A示出了用于分离神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的富集群体的CNS细胞分选方案的示意图。图15B示出了用于分离富集群体的代表性门控方案的流程图。图15C示出了图15B中所描述的分选程序的代表性FACS门控。从左上方开始到右下方：前向(FSC)和侧向(SSC)散射确定碎片中的细胞；活细胞正门控；确认排除了CD31阳性内皮细胞；EAAT2阳性星形胶质细胞从CD11b小胶质细胞亚门控(subgate)；Thy1阳性神经元从EAAT2阳性星形胶质细胞亚门控；并且最终去除CD11b小胶质细胞、EAAT2星形胶质细胞和Thy1神经元细胞群体中的O1少突胶质细胞决定了最终的分选标准。

图16.使用来自具有最高方差的前500个基因的进行对数转换的CPM表达值进行主成分分析。主成分1和2分别占样本间方差的48％和26％。

图17A-17C.图17A示出了通过RNA-Seq确定的纯化的神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和输入细胞悬浮液中的某些细胞特异性标志物的表达。行是细胞类型所特定的基因组：(endo.)内皮，(oligo.)少突胶质细胞；每个基因的表达值被描绘为偏离其平均值的标准偏差数(z评分)；n＝4只小鼠。图17B列出并示出了通过每种细胞类型的富集倍数>5.0和FDR<0.01所确定的前20种富集基因的表达。热图表达值被绘制为基因水平z评分。输入细胞是来自解离的脑的单细胞悬浮液。图17C示出了从神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的分离的细胞群体中生成的qRT-PCR数据。基因类别在x轴上分组：(Astro)星形胶质细胞，(MG)小胶质细胞，(Neu)神经元，(Oligo)少突胶质细胞和(Endo)内皮细胞；n＝5只小鼠。图表显示平均值±SEM。

图18A.从IDS KO；TfR

图18B.在经过媒介物处理的TfR

图19.来自IDS KO；TfR

图20.来自IDS KO；TfR

图21.来自IDS KO；TfR

图22.来自IDS KO；TfR

图23.在每周一次持续四周给与媒介物、艾杜硫酶或ETV:IDS之后，野生型和IDSKO；TfR

图24.来自TfR

图25.细胞类型特异性的富集基因集的表；表中的信息与图17B的热图相对应。通过每个细胞类型的富集倍数>5.0和FDR<0.01确定的前20种基因的表达以p值的升序列出。平均对数变化倍数(logFC.avg)是相对于另外两个“外群”群体，并且最右侧三列示出每个细胞群体内的基因的平均表达；n＝4只小鼠。

图26A-26C.3月龄、6月龄和9月龄的野生型和IDS敲除小鼠中的Nf-L浓度的散布图。图26A和26B中分别示出了9月龄小鼠的血清和CSF中的Nf-L水平。图26C中示出了不同年龄的小鼠队列的CSF中的Nf-L水平。数据显示为平均值+/-SEM，p值通过未配对t检验分析来获得。

图27.ETV:IDS的外周施用(每周一次持续13周给与1mg/kg或3mg/kg)减少IDS敲除小鼠中的神经丝轻链(Nf-L)水平。数据显示为平均值+/-SEM，p值通过未配对t检验分析来获得(*p<0.05；***p<0.001；误差条＝SEM)。

图28.ETV:IDS的外周施用(每周一次持续13周给与1mg/kg或3mg/kg)减少IDS敲除小鼠的肝和尿中的GAG水平积聚。尿GAG水平相对于肌酐归一化。数据显示为平均值+/-SEM，p值通过未配对t检验分析来获得(****p<0.0001；误差条＝SEM)。

具体实施方式

如本文所述，已经鉴定了一系列与LSD相关的生物标志物。具体地说，如实施例中所述，显示一系列次级溶酶体脂质在来自LSD鼠模型的脑、CSF和血清中积聚。此外，还显示在髓样细胞上表达的触发受体2(TREM2)和神经丝轻链(Nf-L)在来自这些小鼠的脑组织中积聚。值得注意的是，通过施用LSD治疗(例如ETV:IDS)，所述次级脂质积聚和TREM2的积聚有所改良。基于这些发现，这些脂质/蛋白质可以用作生物标志物，包括但不限于以评估患有这类病症的受试者，评估某些治疗的功效，开发和/或修改治疗方案(例如调整剂量)以及用于筛选治疗活性剂的方法中。

因此，本文所述的某些实施方案提供了一种检测患有LSD的受试者中的一种或多种生物标志物的方法，所述方法包括：

1)测量来自所述受试者的样品中的两种或更多种脂质的组合的浓度，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

a)BMP；

b)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

c)GD3神经节苷脂；

d)GD1a/b神经节苷脂；以及

e)GlcCer；

2)测量来自所述受试者的样品中的GlcCer的浓度，条件是所述LSD是MPS病症；和/或

3)测量来自所述受试者的样品中的sTREM2的浓度。

本文所述的某些实施方案还提供了一种检测患有LSD的受试者中的一种或多种生物标志物的方法，所述方法包括：

1)测量来自所述受试者的样品中的两种或更多种脂质的组合的浓度，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

a)BMP；

b)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

c)GD3神经节苷脂；

d)GD1a/b神经节苷脂；以及

e)GlcCer；

2)测量来自所述受试者的样品中的GlcCer的浓度，条件是所述LSD是MPS病症；

3)测量来自所述受试者的样品中的Nf-L的浓度；和/或

4)测量来自所述受试者的样品中的sTREM2的浓度。

本文所述的某些实施方案还提供了一种评估患有LSD的受试者中的治疗功效的方法，所述方法包括：

1)测量来自所述受试者的样品(即在施用所述治疗之后从所述受试者获得的样品)中的两种或更多种脂质的组合的浓度，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

a)BMP；

b)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

c)GD3神经节苷脂；

d)GD1a/b神经节苷脂；以及

e)GlcCer；

2)测量来自所述受试者的样品中的GlcCer的浓度，条件是所述LSD是MPS病症；和/或

3)测量来自所述受试者的样品中的sTREM2的浓度；

其中与在施用所述治疗之前从所述受试者获得的样品中的所选脂质/蛋白质的浓度相比，来自所述受试者的所述样品中的所述脂质/蛋白质的浓度下降与治疗功效相关。

本文所述的某些实施方案提供了一种评估患有LSD的受试者中的治疗功效的方法，所述方法包括：

1)测量来自所述受试者的样品(即在施用所述治疗之后从所述受试者获得的样品)中的两种或更多种脂质的组合的浓度，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

a)BMP；

b)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

c)GD3神经节苷脂；

d)GD1a/b神经节苷脂；以及

e)GlcCer；

2)测量来自所述受试者的样品中的GlcCer的浓度，条件是所述LSD是MPS病症；

3)测量来自所述受试者的样品中的Nf-L的浓度；和/或

4)测量来自所述受试者的样品中的sTREM2的浓度；

其中与在施用所述治疗之前从所述受试者获得的样品中的所选脂质/蛋白质的浓度相比，来自所述受试者的所述样品中的所述脂质/蛋白质的浓度下降与治疗功效相关。

本文所述的某些实施方案提供了一种鉴定患有LSD的受试者为治疗候选者的方法，所述方法包括：

1)测量来自所述受试者的样品中的两种或更多种脂质的组合的浓度，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

a)BMP；

b)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

c)GD3神经节苷脂；

d)GD1a/b神经节苷脂；以及

e)GlcCer；

2)测量来自所述受试者的样品中的GlcCer的浓度，条件是所述LSD是MPS病症；和/或

3)测量来自所述受试者的样品中的sTREM2的浓度；

其中基于与对照值相比所述样品中的所选脂质/蛋白质的浓度，鉴定所述受试者为治疗候选者或非治疗候选者。举例来说，来自所述受试者的样品中的所选脂质/蛋白质的浓度至少与对照值一样高方可鉴定所述受试者为治疗候选者。

本文所述的某些实施方案还提供了一种鉴定患有LSD的受试者为治疗候选者的方法，所述方法包括：

1)测量来自所述受试者的样品中的两种或更多种脂质的组合的浓度，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

a)BMP；

b)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

c)GD3神经节苷脂；

d)GD1a/b神经节苷脂；以及

e)GlcCer；

2)测量来自所述受试者的样品中的GlcCer的浓度，条件是所述LSD是MPS病症；

3)测量来自所述受试者的样品中的Nf-L的浓度；和/或

4)测量来自所述受试者的样品中的sTREM2的浓度；

其中基于与对照值相比所述样品中的所选脂质/蛋白质的浓度，鉴定所述受试者为治疗候选者或非治疗候选者。举例来说，来自所述受试者的样品中的所选脂质/蛋白质的浓度至少与对照值一样高方可鉴定所述受试者为治疗候选者。

在某些实施方案中，本文所述的方法还包括向受试者施用LSD治疗。在某些实施方案中，本文所述的方法还包括调整受试者的治疗方案。举例来说，基于所选脂质/蛋白质中的每一者的浓度与对照值的比较，可以增加或减少给药，可以增加或减少给药频率或可以施用替换疗法。

因此，本文所述的某些实施方案提供了一种治疗受试者的LSD的方法，所述方法包括：

1)向所述受试者施用LSD治疗；

2)测量以下的浓度：

a)来自所述受试者的样品中的两种或更多种脂质的组合，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

i)BMP；

ii)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

iii)GD3神经节苷脂；

iv)GD1a/b神经节苷脂；以及

v)GlcCer；

b)来自所述受试者的样品中的GlcCer，条件是所述LSD是MPS病症；和/或

c)来自所述受试者的样品中的sTREM2；以及

3)基于与对照值相比来自所述受试者的所述样品中的所选脂质/蛋白质的浓度，调整所述LSD治疗的剂量。在某些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用调整剂量的所述LSD治疗，其中所述剂量调整是基于所选脂质/蛋白质的浓度与对照值相比。在某些实施方案中，所述方法包括当所选脂质/蛋白质的浓度比对照值高时向所述受试者施用剂量比原始LSD治疗剂量(步骤1)高的LSD治疗。在某些实施方案中，所述方法包括当所选脂质/蛋白质的浓度比对照值低时向所述受试者施用剂量比原始LSD治疗剂量(步骤1)低的LSD治疗。

本文所述的某些实施方案还提供了一种治疗受试者的LSD的方法，所述方法包括：

1)向所述受试者施用LSD治疗；

2)测量以下的浓度：

a)来自所述受试者的样品中的两种或更多种脂质的组合，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

i)BMP；

ii)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

iii)GD3神经节苷脂；

iv)GD1a/b神经节苷脂；以及

v)GlcCer；

b)来自所述受试者的样品中的GlcCer，条件是所述LSD是MPS病症；

c)来自所述受试者的样品中的Nf-L；和/或

d)来自所述受试者的样品中的sTREM2；以及

3)基于与对照值相比来自所述受试者的所述样品中的所选脂质/蛋白质的浓度，调整所述LSD治疗的剂量。在某些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用调整剂量的所述LSD治疗，其中所述剂量调整是基于所选脂质/蛋白质的浓度与对照值相比。在某些实施方案中，所述方法包括当所选脂质/蛋白质的浓度比对照值高时向所述受试者施用剂量比原始LSD治疗剂量(步骤1)高的LSD治疗。在某些实施方案中，所述方法包括当所选脂质/蛋白质的浓度比对照值低时向所述受试者施用剂量比原始LSD治疗剂量(步骤1)低的LSD治疗。

在某些实施方案中，本文所述的方法包括测量或已经测量来自患有LSD的受试者的样品中的sTREM2的浓度。

在某些实施方案中，本文所述的方法包括测量或已经测量来自患有LSD的受试者的样品中的Nf-L的浓度。

如本文所述，可以测量来自患有LSD的受试者的样品中的GlcCer的浓度。在这样的实施方案中，LSD是MPS。因此，在某些实施方案中，本文所述的方法包括测量或已经测量来自患有LSD的受试者的样品中的GlcCer的浓度，条件是所述LSD是MPS。在某些其它实施方案中，GlcCer与本文所述的其它脂质/蛋白质组合测量。在这样的实施方案中，LSD可以是任何LSD，例如本文所述的LSD。

在某些实施方案中，本文所述的方法包括测量或已经测量来自患有LSD的受试者的样品中的两种或更多种脂质的组合的浓度。

在某些实施方案中，本文所述的方法包括测量或已经测量来自患有LSD的受试者的样品中的一种或多种脂质的组合的浓度和sTREM2的浓度。

在某些实施方案中，本文所述的方法包括测量或已经测量来自患有LSD的受试者的样品中的一种或多种脂质的组合的浓度和Nf-L的浓度。

在某些实施方案中，本文所述的方法包括测量或已经测量来自患有LSD的受试者的样品中的sTREM2的浓度和Nf-L的浓度。

在某些实施方案中，本文所述的方法包括测量或已经测量来自患有LSD的受试者的样品中的一种或多种脂质的组合的浓度、sTREM2的浓度和Nf-L的浓度。

本文所述的某些实施方案提供了一种治疗受试者的LSD的方法，所述方法包括向所述受试者施用LSD治疗，其中所述受试者具有或经确定具有：

1)与对照相比浓度增加的两种或更多种脂质的组合，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

a)BMP；

b)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

c)GD3神经节苷脂；

d)GD1a/b神经节苷脂；以及

e)GlcCer；

2)浓度增加的GlcCer，条件是所述LSD是MPS病症；和/或

3)浓度增加的sTREM2。

本文所述的某些实施方案提供了一种治疗受试者的LSD的方法，所述方法包括向所述受试者施用LSD治疗，其中所述受试者具有或经确定具有：

1)与对照相比浓度增加的两种或更多种脂质的组合，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

a)BMP；

b)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

c)GD3神经节苷脂；

d)GD1a/b神经节苷脂；以及

e)GlcCer；

2)浓度增加的GlcCer，条件是所述LSD是MPS病症；

3)浓度增加的Nf-L；和/或

4)浓度增加的sTREM2。

本文所述的某些实施方案提供了一种治疗受试者的LSD的方法，所述方法包括：

1)从所述受试者获得或已经从所述受试者获得样品；

2)检测到或已经检测到所述样品中：

a)与对照相比，所述样品中的两种或更多种脂质的组合的浓度增加，其中所述脂质/蛋白质的组合选自由以下组成的组：

i)BMP；

ii)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

iii)GD3神经节苷脂；

iv)GD1a/b神经节苷脂；以及

v)GlcCer；

b)与对照相比，所述样品中的GlcCer的浓度增加，条件是所述LSD是MPS病症；和/或

c)与对照相比，所述样品中的sTREM2的浓度增加；

3)当检测到所选脂质/蛋白质的浓度增加时，将所述受试者诊断为患有LSD；以及

4)向确诊的受试者施用有效量的LSD治疗。

本文所述的某些实施方案提供了一种治疗受试者的LSD的方法，所述方法包括：

1)从所述受试者获得或已经从所述受试者获得样品；

2)检测到或已经检测到所述样品中：

a)与对照相比，所述样品中的两种或更多种脂质的组合的浓度增加，其中所述脂质/蛋白质的组合选自由以下组成的组：

i)BMP；

ii)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

iii)GD3神经节苷脂；

iv)GD1a/b神经节苷脂；以及

v)GlcCer；

b)与对照相比，所述样品中的GlcCer的浓度增加，条件是所述LSD是MPS病症；

c)与对照相比，所述样品中的Nf-L的浓度增加；和/或

d)与对照相比，所述样品中的sTREM2的浓度增加。

3)当检测到所选脂质/蛋白质的浓度增加时，将所述受试者诊断为患有LSD；以及

4)向确诊的受试者施用有效量的LSD治疗。

在某些实施方案中，受试者具有或经确定具有浓度增加的sTREM2。

在某些实施方案中，受试者具有或经确定具有浓度增加的Nf-L。

在某些实施方案中，受试者具有或经确定具有浓度增加的GlcCer。

在某些实施方案中，受试者具有或经确定具有浓度增加的两种或更多种脂质的组合。

在某些实施方案中，受试者具有或经确定具有浓度增加的一种或多种脂质和浓度增加的sTREM2。

在某些实施方案中，受试者具有或经确定具有浓度增加的一种或多种脂质和浓度增加的Nf-L。

在某些实施方案中，受试者具有或经确定具有浓度增加的Nf-L和浓度增加的sTREM2。

在某些实施方案中，受试者具有或经确定具有浓度增加的一种或多种脂质、浓度增加的Nf-L和浓度增加的sTREM2。

某些实施方案还提供了用于本文所述的方法中的LSD治疗。

某些实施方案提供了LSD治疗制备用于本文所述的方法中的药物的用途。

溶酶体贮积症的生物标志物

如本文所述，已经鉴定了一系列LSD生物标志物。具体地说，这些生物标志物包括在患有LSD的受试者中特定的脂质(即BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3)积聚，以及TREM2积聚(可以基于sTREM2水平测量)和Nf-L积聚。因此，这些生物标志物可以通过测量从受试者获得的样品中的这些脂质/蛋白质中的一种或多种脂质/蛋白质的浓度来评估。

如本文所用，短语“样品”或“生理样品”意指从含有蛋白质和/或脂质的受试者获得的生物样品。因此，可以在脂质或蛋白质水平下评估样品。在某些实施方案中，生理样品包含组织、脑脊髓液(CSF)、尿、血液、血清或血浆。在某些实施方案中，样品包含组织，例如脑、肝、肾、肺或脾。样品可包括流体。在某些实施方案中，样品包含CSF。在某些实施方案中，样品包含血液和/或血浆。在某些实施方案中，样品包含血清。

TREM2

如本文所用，术语“TREM2蛋白”是指在髓样细胞上表达的触发受体2蛋白，由基因Trem2编码。如本文所用，“TREM2蛋白”是指任何脊椎动物，例如(但不限于)人、非人灵长类动物(例如食蟹猕猴)、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)和其它哺乳动物的天然(即野生型)TREM2蛋白。在一些实施方案中，TREM2蛋白是具有在UniprotKB登录号Q9NZC2中鉴定的序列的人TREM2蛋白。

TREM2基因编码230个氨基酸长度的蛋白质，所述蛋白质包括胞外结构域、跨膜区和短胞质尾(参见UniProtKB Q9NZC2；NCBI参考序列：NP_061838.1)。由外显子2编码的胞外区由单一类型的VIg-SF结构域构成，含有三个潜在的N-糖基化位点。假定的跨膜区含有带电的赖氨酸残基。TREM2的胞质尾缺乏信号传导基序，并且认为其通过信号传导衔接分子DAP12/TYROBP和通过DAP10传导信号。在破骨细胞、不成熟的树突状细胞和巨噬细胞的表面上发现了TREM2。在中枢神经系统中，TREM2只在小胶质细胞中表达。

TREM2可以由去整合素和金属蛋白酶(ADAM)蛋白酶(例如ADAM10和ADAM17)裂解，从而将可溶性TREM2(sTREM2)释放至细胞外环境中。如本文所述，TREM2的水平增加指示患有LSD的受试者中的下游病变。因此，可以使用本领域中已知的或本文所述的测定法测量TREM2或sTREM2水平。举例来说，用于检测和测量蛋白质表达水平的测定法包括例如蛋白质印迹分析、免疫荧光、免疫组织化学(例如组织阵列)、MesoScale Discovery(MSD)方法等。在本文所述的某些方法中，可以测量来自患有或怀疑患有LSD的受试者的样品中的TREM2浓度。在本文所述的某些方法中，可以测量来自患有或怀疑患有LSD的受试者的样品中的sTREM2浓度。

在某些实施方案中，来自患有LSD的受试者的样品中的sTREM2浓度与对照(例如未患LSD的健康对照受试者)相比增加。在某些实施方案中，sTREM2浓度与对照相比增加了至少约1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。在某些实施方案中，在例如脑的组织样品中观测到sTREM2浓度增加。在某些实施方案中，在CSF中观测到sTREM2浓度增加。在某些实施方案中，在血清中观测到sTREM2浓度增加。

在某些其它实施方案中，向患有LSD的受试者施用有效的LSD治疗，这使来自受试者的样品中的sTREM2的浓度与对照(例如在接受所述治疗之前的同一受试者)相比降低。在某些实施方案中，与对照相比sTREM2的浓度降低了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在某些实施方案中，在例如脑的组织样品中观测到sTREM2浓度降低。在某些实施方案中，在CSF中观测到sTREM2浓度降低。在某些实施方案中，在血清中观测到sTREM2浓度降低。

Nf-L

如本文所用，术语“Nf-L”是指由基因NEFL编码的神经丝轻链(又称为神经丝轻链多肽、神经丝轻多肽和神经丝轻蛋白)。如本文所用，“Nf-L蛋白”是指任何脊椎动物，例如(但不限于)人、非人灵长类动物(例如食蟹猕猴)、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)和其它哺乳动物的天然(即野生型)Nf-L蛋白。在一些实施方案中，Nf-L蛋白是具有UniprotKB登录号P07196中鉴定的序列的人Nf-L蛋白。

如本文所述，Nf-L的水平增加指示患有LSD的受试者中的下游病变。因此，可以使用本领域中已知的或本文所述的测定法测量Nf-L水平。举例来说，用于检测和测量蛋白质表达水平的测定法包括例如蛋白质印迹分析、免疫荧光、免疫组织化学(例如组织阵列)、MesoScale Discovery(MSD)方法等。在本文所述的某些方法中，可以测量来自患有或怀疑患有LSD的受试者的样品中的Nf-L浓度。

在某些实施方案中，来自患有LSD的受试者的样品中的Nf-L浓度与对照(例如未患LSD的健康对照受试者)相比增加。在某些实施方案中，Nf-L浓度与对照相比增加了至少约1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。在某些实施方案中，在例如脑的组织样品中观测到Nf-L浓度增加。在某些实施方案中，在CSF中观测到Nf-L浓度增加。在某些实施方案中，在血清中观测到Nf-L浓度增加。

在某些其它实施方案中，向患有LSD的受试者施用有效的LSD治疗，这使来自受试者的样品中的Nf-L的浓度与对照(例如在接受所述治疗之前的同一受试者)相比降低。在某些实施方案中，与对照相比Nf-L的浓度降低了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在某些实施方案中，在例如脑的组织样品中观测到Nf-L浓度降低。在某些实施方案中，在CSF中观测到Nf-L浓度降低。在某些实施方案中，在血清中观测到Nf-L浓度降低。

脂质

如本文所述，BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和/或GM3的水平增加指示患有LSD的受试者中的下游病变。因此，在本文所述的某些方法中，可以测量来自患有或怀疑患有LSD的受试者的样品中的至少一种BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和/或GM3的浓度。可以使用本领域中已知的或本文所述的测定法(例如通过质谱法)测量这些脂质的浓度。

双(单酰基甘油)磷酸酯(BMP)是指一类阴离子磷脂。BMP富集在多囊泡内体和溶酶体的内膜，并且认为其在鞘糖脂降解和胆固醇转运中起作用(参见Kobayashi等人,Nat.Cell Biol.1(1999)113-118)。本文描述了具体的BMP物质(参见例如实施例和图)。

在某些实施方案中，来自患有LSD的受试者的样品中的至少一种BMP物质的浓度与对照(例如未患LSD的健康对照受试者)相比增加。在某些实施方案中，BMP是本文、例如实施例或图中所述的BMP物质。举例来说，在某些实施方案中，BMP是BMP(44:12)、BMP(36:2)、BMP(di20:4)、BMP(di22:6)或BMP(di18:1)。在某些实施方案中，至少一种BMP的浓度与对照相比增加了至少约1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。在某些实施方案中，在例如脑的组织样品中观测到BMP浓度增加。在某些实施方案中，在CSF中观测到BMP浓度增加。在某些实施方案中，在血清中观测到BMP浓度增加。

在某些其它实施方案中，向患有LSD的受试者施用有效的LSD治疗，这使来自受试者的样品中的至少一种BMP物质的浓度与对照(例如在接受所述治疗之前的同一受试者)相比降低。在某些实施方案中，与对照相比至少一种BMP的浓度降低了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在某些实施方案中，在例如脑的组织样品中观测到BMP浓度降低。在某些实施方案中，在CSF中观测到BMP浓度降低。在某些实施方案中，在血清中观测到BMP浓度降低。

葡萄糖基神经酰胺(GlcCer)是在糖链上连接有一个或多个唾液酸的鞘糖脂(神经酰胺和寡糖)或寡糖基神经酰胺。本文描述了具体的GlcCer物质(参见例如实施例和图)。

在某些实施方案中，来自患有LSD的受试者的样品中的至少一种GlcCer物质的浓度与对照(例如未患LSD的健康对照受试者)相比增加。在某些实施方案中，GlcCer是本文、例如实施例或图中所述的GlcCer物质。举例来说，在某些实施方案中，GlcCer是GlcCer(d34:0)、GlcCer(d34:1)、GlcCer(d36:1)、GlcCer(d42:1)、GlcCer(d18:1，16:0)、GlcCer(d18:1，18:0)、GlcCer(d18:2，18:0)、GlcCer(d18:1，20:0)、GlcCer(d18:2，20:0)、GlcCer(d18:1，22:0)、GlcCer(d18:1，22:1)、GlcCer(d18:2，22:0)、GlcCer(d18:1，24:1)或GlcCer(d18:1，24:0)。在某些实施方案中，GlcCer是GlcCer(d34:1)、GlcCer(d36:1)、GlcCer(d42:1)、GlcCer(d18:1，16:0)或GlcCer(d18:1，22:0)。在某些实施方案中，GlcCer是GlcCer(d34:0)。在某些实施方案中，至少一种GlcCer的浓度与对照相比增加了至少约1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。在某些实施方案中，在例如脑的组织样品中观测到GlcCer浓度增加。在某些实施方案中，在CSF中观测到GlcCer浓度增加。在某些实施方案中，在血清中观测到GlcCer浓度增加。

在某些其它实施方案中，向患有LSD的受试者施用有效的LSD治疗，这使来自受试者的样品中的至少一种GlcCer物质的浓度与对照(例如在接受所述治疗之前的同一受试者)相比降低。在某些实施方案中，与对照相比至少一种GlcCer的浓度降低了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在某些实施方案中，在例如脑的组织样品中观测到GlcCer浓度降低。在某些实施方案中，在CSF中观测到GlcCer浓度降低。在某些实施方案中，在血清中观测到GlcCer浓度降低。

神经节苷脂是一类鞘糖脂。本文描述了具体的GD3物质(参见例如实施例和图)。

在某些实施方案中，来自患有LSD的受试者的样品中的至少一种GD3物质的浓度与对照(例如未患LSD的健康对照受试者)相比增加。在某些实施方案中，GD3是本文、例如实施例或图中所述的GD3物质。举例来说，在某些实施方案中，GD3是GD3(d34:1)、GD3(d36:1)、GD3(d38:1)、GD3(d39:1)、GD3(d40:1)、GD3(d42:2)或GD3(d42:1)。在某些实施方案中，GD3是GD3(d34:1)、GD3(d36:1)或GD3(d39:1)。在某些实施方案中，GD3是GD3(d34:1)或GD3(d36:1)。

在某些实施方案中，至少一种GD3的浓度与对照相比增加了至少约1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。在某些实施方案中，在例如脑的组织样品中观测到GD3浓度增加。在某些实施方案中，在CSF中观测到GD3浓度增加。在某些实施方案中，在血清中观测到GD3浓度增加。

在某些其它实施方案中，向患有LSD的受试者施用有效的LSD治疗，这使来自受试者的样品中的至少一种GD3物质的浓度与对照(例如在接受所述治疗之前的同一受试者)相比降低。在某些实施方案中，与对照相比至少一种GD3的浓度降低了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在某些实施方案中，在例如脑的组织样品中观测到GD3浓度降低。在某些实施方案中，在CSF中观测到GD3浓度降低。在某些实施方案中，在血清中观测到GD3浓度降低。

神经节苷脂GD1a和GD1b是鞘糖脂。本文描述了具体的GD1a/b物质(参见例如实施例和图)。

在某些实施方案中，来自患有LSD的受试者的样品中的至少一种GD1a/b物质的浓度与对照(例如未患LSD的健康对照受试者)相比增加。在某些实施方案中，GD1a/b是本文、例如实施例或图中所述的GD1a/b物质。举例来说，在某些实施方案中，GD1a/b是GD1a/b(d36:1)或GD1a/b(d38:1)。

在某些实施方案中，至少一种GD1a/b的浓度与对照相比增加了至少约1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。在某些实施方案中，在例如脑的组织样品中观测到GD1a/b浓度增加。在某些实施方案中，在CSF中观测到GD1a/b浓度增加。在某些实施方案中，在血清中观测到GD1a/b浓度增加。

在某些其它实施方案中，向患有LSD的受试者施用有效的LSD治疗，这使来自受试者的样品中的至少一种GD1a/b物质的浓度与对照(例如在接受所述治疗之前的同一受试者)相比降低。在某些实施方案中，与对照相比至少一种GD1a/b的浓度降低了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在某些实施方案中，在例如脑的组织样品中观测到GD1a/b浓度降低。在某些实施方案中，在CSF中观测到GD1a/b浓度降低。在某些实施方案中，在血清中观测到GD1a/b浓度降低。

单唾液酸神经节苷脂2(GM2)是一种鞘糖脂。本文描述了具体的GM2物质(参见例如实施例和图)。

在某些实施方案中，来自患有LSD的受试者的样品中的至少一种GM2物质的浓度与对照(例如未患LSD的健康对照受试者)相比增加。在某些实施方案中，GM2是本文、例如实施例或图中所述的GM2物质。举例来说，在某些实施方案中，GM2物质是GM2(d38:1)或GM2(d36:1)。在某些实施方案中，至少一种GM2的浓度与对照相比增加了至少约1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。在某些实施方案中，在例如脑的组织样品中观测到GM2浓度增加。在某些实施方案中，在CSF中观测到GM2浓度增加。在某些实施方案中，在血清中观测到GM2浓度增加。

在某些其它实施方案中，向患有LSD的受试者施用有效的LSD治疗，这使来自受试者的样品中的至少一种GM2物质的浓度与对照(例如在接受所述治疗之前的同一受试者)相比降低。在某些实施方案中，与对照相比至少一种GM2的浓度降低了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在某些实施方案中，在例如脑的组织样品中观测到GM2浓度降低。在某些实施方案中，在CSF中观测到GM2浓度降低。在某些实施方案中，在血清中观测到GM2浓度降低。

类似于GM2，单唾液酸神经节苷脂3(GM3)也是一类鞘糖脂。本文描述了具体的GM3物质(参见例如实施例和图)。

在某些实施方案中，来自患有LSD的受试者的样品中的至少一种GM3物质的浓度与对照(例如未患LSD的健康对照受试者)相比增加。在某些实施方案中，GM3是本文、例如实施例或图中所述的GM3物质。举例来说，在某些实施方案中，GM3物质是GM3(d34:1)、GM3(d36:1)、GM3(d38:1)、GM3(d40:1)、GM3(d41:1)、GM3(d42:2)、GM3(d42:1)、GM3(d43:0)、GM3(d44:1)或GM3(d44:2)。在某些实施方案中，GM3物质是GM3(d34:1)、GM3(d36:1)或GM3(d38:1)。在某些实施方案中，至少一种GM3的浓度与对照相比增加了至少约1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。在某些实施方案中，在例如脑的组织样品中观测到GM3浓度增加。在某些实施方案中，在CSF中观测到GM3浓度增加。在某些实施方案中，在血清中观测到GM3浓度增加。

在某些其它实施方案中，向患有LSD的受试者施用有效的LSD治疗，这使来自受试者的样品中的至少一种GM3的浓度与对照相比降低。在某些实施方案中，与对照相比至少一种GM3的浓度降低了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在某些实施方案中，在例如脑的组织样品中观测到GM3浓度降低。在某些实施方案中，在CSF中观测到GM3浓度降低。在某些实施方案中，在血清中观测到GM3浓度降低。

TREM2、Nf-L、脂质和脂质组合的测量

如本文所用，术语“两种或更多种脂质的组合”是指两种或更多种脂质，其中至少两种脂质来自于不同的类别，其中所述类别选自a)BMP；b)GlcCer；c)GD3神经节苷脂；d)GD1a/b神经节苷脂；和e)GM2和/或GM3神经节苷脂。

在某些实施方案中，评估或已经评估了选自由BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3组成的组的两种或更多种脂质的组合。在某些实施方案中，组合包含BMP。在某些实施方案中，组合包含GlcCer。在某些实施方案中，组合包含GD3。在某些实施方案中，组合包含GD1a/b。在某些实施方案中，组合包含GM2。在某些实施方案中，组合包含GM3。在某些实施方案中，组合包含BMP和GlcCer。在某些实施方案中，组合包含BMP和GD3。在某些实施方案中，组合包含BMP和GD1a/b。在某些实施方案中，组合包含BMP和GM2。在某些实施方案中，组合包含BMP和GM3。在某些实施方案中，组合包含GlcCer和GD3。在某些实施方案中，组合包含GlcCer和GD1a/b。在某些实施方案中，组合包含GlcCer和GM2。在某些实施方案中，组合包含GlcCer和GM3。在某些实施方案中，组合包含GD3和GD1a/b。在某些实施方案中，组合包含GD3和GM2。在某些实施方案中，组合包含GD3和GM3。在某些实施方案中，组合包含GD1a/b和GM2。在某些实施方案中，组合包含GD1a/b和GM3。在某些实施方案中，组合不由GM2和GM3组成。

在某些实施方案中，评估或已经评估了选自由BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3组成的组的三种或更多种脂质的组合。在某些实施方案中，组合包含BMP、GlcCer和GD3。在某些实施方案中，组合包含BMP、GlcCer和GD1a/b。在某些实施方案中，组合包含BMP、GlcCer和GM2。在某些实施方案中，组合包含BMP、GlcCer和GM3。在某些实施方案中，组合包含BMP、GD3和GD1a/b。在某些实施方案中，组合包含BMP、GD3和GM2。在某些实施方案中，组合包含BMP、GD3和GM3。在某些实施方案中，组合包含BMP、GD1a/b和GM2。在某些实施方案中，组合包含BMP、GD1a/b和GM3。在某些实施方案中，组合包含BMP、GM2和GM3。在某些实施方案中，组合包含GlcCer、GD3和GD1a/b。在某些实施方案中，组合包含GlcCer、GD3和GM2。在某些实施方案中，组合包含GlcCer、GD3和GM3。在某些实施方案中，组合包含GlcCer、GD1a/b和GM2。在某些实施方案中，组合包含GlcCer、GD1a/b和GM3。在某些实施方案中，组合包含GlcCer、GM2和GM3。在某些实施方案中，组合包含GD3、GD1a/b和GM2。在某些实施方案中，组合包含GD3、GD1a/b和GM3。在某些实施方案中，组合包含GD3、GM2和GM3。在某些实施方案中，组合包含GD1a/b、GM2和GM3。

在某些实施方案中，评估或已经评估了选自由BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3组成的组的四种或更多种脂质的组合。在某些实施方案中，组合包含BMP、GlcCer、GD3和GD1a/b。在某些实施方案中，组合包含BMP、GlcCer、GD3和GM2。在某些实施方案中，组合包含BMP、GlcCer、GD3和GM3。在某些实施方案中，组合包含BMP、GlcCer、GD1a/b和GM2。在某些实施方案中，组合包含BMP、GlcCer、GD1a/b和GM3。在某些实施方案中，组合包含BMP、GlcCer、GM2和GM3。在某些实施方案中，组合包含BMP、GD3、GD1a/b和GM2。在某些实施方案中，组合包含BMP、GD3、GD1a/b和GM3。在某些实施方案中，组合包含BMP、GD3、GM2和GM3。在某些实施方案中，组合包含BMP、GD1a/b、GM2和GM3。在某些实施方案中，组合包含GlcCer、GD3、GD1a/b和GM2。在某些实施方案中，组合包含GlcCer、GD3、GD1a/b和GM3。在某些实施方案中，组合包含GlcCer、GD3、GM2和GM3。在某些实施方案中，组合包含GlcCer、GD1a/b、GM2和GM3。在某些实施方案中，组合包含GD3、GD1a/b、GM2和GM3。

在某些实施方案中，评估或已经评估了选自由BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3组成的组的五种或更多种脂质的组合。在某些实施方案中，组合包含BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b和GM2。在某些实施方案中，组合包含BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b和GM3。在某些实施方案中，组合包含BMP、GD3、GD1a/b、GM2和GM3。在某些实施方案中，组合包含BMP、GlcCer、GD3、GM2和GM3。在某些实施方案中，组合包含BMP、GlcCer、GD1a/b、GM2和GM3。在某些实施方案中，组合包含GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3。

在某些实施方案中，评估或已经评估了BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3的组合。

在某些实施方案中，评估或已经评估了sTREM2。在某些实施方案中，评估或已经评估了sTREM2和一种或多种脂质。在某些实施方案中，脂质是BMP。在某些实施方案中，脂质是GlcCer。在某些实施方案中，脂质是GD3。在某些实施方案中，脂质是GD1a/b。在某些实施方案中，脂质是GM2。在某些实施方案中，脂质是GM3。

在某些实施方案中，评估或已经评估了sTREM2和选自由BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3组成的组的两种或更多种脂质的组合。在某些实施方案中，两种或更多种脂质的组合是本文所述的组合。

在某些实施方案中，评估或已经评估了sTREM2和选自由BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3组成的组的三种或更多种脂质的组合。在某些实施方案中，三种或更多种脂质的组合是本文所述的组合。

在某些实施方案中，评估或已经评估了sTREM2和选自由BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3组成的组的四种或更多种脂质的组合。在某些实施方案中，四种或更多种脂质的组合是本文所述的组合。

在某些实施方案中，评估或已经评估了sTREM2和选自由BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3组成的组的五种或更多种脂质的组合。在某些实施方案中，五种或更多种脂质的组合是本文所述的组合。

在某些实施方案中，评估或已经评估了sTREM2、BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3。

在某些实施方案中，评估或已经评估了Nf-L。

在某些实施方案中，评估或已经评估了Nf-L和sTREM2。

在某些实施方案中，评估或已经评估了Nf-L和一种或多种脂质。在某些实施方案中，脂质是BMP。在某些实施方案中，脂质是GlcCer。在某些实施方案中，脂质是GD3。在某些实施方案中，脂质是GD1a/b。在某些实施方案中，脂质是GM2。在某些实施方案中，脂质是GM3。

在某些实施方案中，评估或已经评估了Nf-L和选自由BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3组成的组的两种或更多种脂质的组合。在某些实施方案中，两种或更多种脂质的组合是本文所述的组合。

在某些实施方案中，评估或已经评估了Nf-L和选自由BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3组成的组的三种或更多种脂质的组合。在某些实施方案中，三种或更多种脂质的组合是本文所述的组合。

在某些实施方案中，评估或已经评估了Nf-L和选自由BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3组成的组的四种或更多种脂质的组合。在某些实施方案中，四种或更多种脂质的组合是本文所述的组合。

在某些实施方案中，评估或已经评估了Nf-L和选自由BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3组成的组的五种或更多种脂质的组合。在某些实施方案中，五种或更多种脂质的组合是本文所述的组合。

在某些实施方案中，评估或已经评估了Nf-L、BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3。

在某些实施方案中，评估或已经评估了sTREM2、Nf-L和一种或多种脂质。在某些实施方案中，评估或已经评估了sTREM2、Nf-L、BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3。

因此，可以针对sTREM2、Nf-L和/或选自BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3的一种或多种脂质的积聚来评估从患有或怀疑患有LSD的受试者获得的样品。具体地说，可以使用本领域中已知的或本文所述的测定法(例如质谱法)测量从受试者获得的样品中的sTREM2蛋白、Nf-L和/或一种或多种脂质的浓度。

在某些实施方案中，蛋白质和/或脂质的浓度与来自对照受试者(例如未患LSD的健康受试者)的样品中的对应的蛋白质和/或脂质的浓度相比。

在一些实施方案中，来自受试者的样品中的每一种所选脂质/蛋白质的量与针对健康对照或健康对照群体(即未罹患LSD)确定的对照值相比。在一些实施方案中，如果来自受试者的样品中的每一种所选脂质/蛋白质的量与对照值相比增加，那么将受试者鉴定为治疗或治疗调整的候选者。在一些实施方案中，如果来自受试者的样品中的每一种所选脂质/蛋白质的量与对照值相比增加了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，那么将受试者鉴定为治疗或治疗调整的候选者。在一些实施方案中，如果来自受试者的样品中的每一种所选脂质/蛋白质的量与对照值相比增加了至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多，那么将受试者鉴定为治疗或治疗调整的候选者。在一些实施方案中，通过评定已知未患LSD的受试者或受试者群体(例如10个、20个、50个、100个、200个、500个、1000个受试者或更多)中的每种脂质/蛋白质的水平来确定每一种所选脂质/蛋白质的健康对照值。

在一些实施方案中，来自受试者的样品中的每一种所选脂质/蛋白质的量与针对疾病对照或疾病对照群体(即罹患LSD)确定的对照值相比。在一些实施方案中，通过评定已知患有LSD的受试者或受试者群体(例如10个、20个、50个、100个、200个、500个、1000个受试者或更多)中的所选脂质/蛋白质的水平来确定每一种所选脂质/蛋白质的疾病对照值。

在一些实施方案中，如果来自受试者的样品中的每一种所选脂质/蛋白质的量至少与疾病对照或疾病对照群体中的每一种所选脂质/蛋白质的量一样高，那么将受试者鉴定为治疗或治疗调整的候选者(例如剂量或频率增加)。在一些实施方案中，如果来自受试者的样品中的每一种所选脂质/蛋白质的量与疾病对照或疾病对照群体中的每一种所选脂质/蛋白质的量可比(例如在20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％内)，那么将受试者鉴定为治疗或治疗调整的候选者(例如剂量或频率增加)。

在一些实施方案中，患有LSD的受试者是已经施用针对LSD的治疗的受试者。在接受治疗之后的受试者中的水平与在治疗的治疗施用之前(例如在第一次施用之前)的同一受试者中的水平相比。治疗的有效性可以通过所选脂质/蛋白质的量的变化(例如减少)来确定。

在某些其它实施方案中，如果来自受试者的样品中的每一种所选脂质/蛋白质的量小于疾病对照或疾病对照群体中的每一种所选脂质/蛋白质的量，那么将受试者鉴定为治疗调整的候选者(例如剂量或频率下降)。

在一些实施方案中，根据一种或多种患者特征，例如年龄、性别、种族或其它标准，将受试者的群体与测试受试者匹配。在一些实施方案中，使用来自受试者群体的与用于评定测试受试者中的脂质/蛋白质水平相同类型的样品(例如包含血液或PBMC的样品)建立对照值。

溶酶体贮积症

如本文所述，已经鉴定了某些与LSD相关的生物标志物。LSD是遗传性代谢疾病，其特征是未消化或部分消化的大分子积聚，最终引起细胞功能障碍和临床异常。传统地，LSD已经被定义为一般通过积聚的底物分类的溶酶体功能缺乏并且包括粘多糖贮积病。近来，这些病症的分类已经扩大为包括引起大分子积聚的其它蛋白质缺乏或缺陷，例如溶酶体酶的正常翻译后修饰所必需的蛋白质，或对于适当溶酶体运输来说重要的蛋白质。

在某些实施方案中，LSD是MPS病症(例如亨特综合征)。

治疗剂

本文所述的某些方法包括向受试者施用溶酶体贮积症治疗。

如本文所用，“溶酶体贮积症治疗”可以是能够减少一种或多种与LSD相关的症状(例如神经症状)的任何治疗剂或疗法。已知某些溶酶体贮积症治疗。举例来说，这类治疗包括例如造血干细胞移植(HSCT)、酶替代疗法(ERT)、底物减少疗法、伴侣疗法和基因疗法(例如体内或离体)。

在某些实施方案中，LSD治疗包含ERT。在某些实施方案中，ERT可以是被设计成能治疗一种或多种神经症状的疗法。如下所述，某些ERT LSD疗法可以使用酶转运载体(ETV)靶向脑。举例来说，以下论述包含可以在本文所述的方法中使用的ERT酶的某些融合蛋白并且在WO 2019/070577(以引用的方式并入本文中以达成所有目的)中描述。

包含ERT酶的某些融合蛋白

以下描述了融合蛋白的某些实施方案，所述融合蛋白包括连接于Fc多肽的酶替代疗法(ERT)酶；这些融合蛋白可以作为LSD治疗用于本文所述的某些方法中。在一些情况下，蛋白质包括二聚Fc多肽，其中Fc多肽单体中的一种连接于ERT酶。Fc多肽可以增加酶半衰期，并且在一些情况下，可以被修饰以赋予蛋白质另外的功能性。本文还描述了促进ERT酶跨越血脑屏障(BBB)递送的融合蛋白。这些蛋白质包含形成二聚体的Fc多肽和修饰Fc多肽，和连接于Fc区和/或修饰Fc区的ERT酶。修饰Fc区可以特异性结合于BBB受体，例如转铁蛋白受体(TfR)。在一些实施方案中，ERT酶是艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)，或野生型IDS、例如野生型人IDS的催化活性变体或片段。这些融合蛋白的某些实施方案在本文中可以作为与具体的酶结合的酶转运载体(ETV)提及，例如ETV:IDS。

ERT酶

在一些方面，本文所述的融合蛋白包含：(i)可以含有修饰(例如一种或多种促进异二聚的修饰)或者可以是野生型Fc多肽的Fc多肽，和ERT酶；以及(ii)可以含有修饰(例如一种或多种促进异二聚的修饰)或者可以是野生型Fc多肽的Fc多肽，和任选地ERT酶。在一些实施方案中，一种或两种Fc多肽可以含有引起结合于血脑屏障(BBB)受体如TfR的修饰。ERT酶可以是LSD中缺乏的任何酶。掺入融合蛋白中的ERT酶是催化活性的，即保留在LSD中缺乏的酶活性。在一些实施方案中，ERT酶是在亨特综合征中缺乏的IDS。

在一些实施方案中，包含ERT酶并且任选地包含结合于BBB受体的修饰Fc多肽(例如结合TfR的Fc多肽)的融合蛋白包含野生型IDS的催化活性片段或变体。在一些实施方案中，IDS酶是包含SEQ ID NO:91、92、112、192和196中的任一个的氨基酸序列的IDS蛋白的变体或催化活性片段。在一些实施方案中，IDS酶的催化活性变体或片段具有野生型IDS酶的活性的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更大。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的ERT酶(例如IDS)或其催化活性变体或片段与它不接合于Fc多肽或结合TfR的Fc多肽时的活性相比保留它的活性的至少25％。在一些实施方案中，ERT酶或其催化活性变体或片段与它不接合于Fc多肽或结合TfR的Fc多肽时的活性相比保留它的活性的至少10％，或至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，ERT酶或其催化活性变体或片段与它不接合于Fc多肽或结合TfR的Fc多肽时的活性相比保留它的活性的至少80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，与Fc多肽融合不降低ERT酶如IDS或其催化活性变体或片段的活性。在一些实施方案中，与结合TfR的Fc多肽融合不降低ERT酶的活性。

I.用于结合血脑屏障(BBB)受体的Fc多肽修饰

在一些方面，融合蛋白能够跨越血脑屏障(BBB)转运。这种蛋白质包含结合于BBB受体的修饰Fc多肽。BBB受体在BBB内皮以及其它细胞和组织类型上表达。在一些实施方案中，BBB受体是转铁蛋白受体(TfR)。

本文中使用EU索引编号对多种Fc修饰，包括在结合于BBB受体如TfR的修饰Fc多肽中引入的修饰中表示的氨基酸残基进行编号。任何Fc多肽，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽，可以在如本文所述的一个或多个位置处具有修饰，例如氨基酸取代。

本文所述的融合蛋白中存在的修饰(例如增强异二聚和/或BBB受体结合)Fc多肽可以与天然Fc区序列或其片段，例如至少50个氨基酸或至少100个氨基酸或更长的片段具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，天然Fc氨基酸序列是SEQ ID NO:1的Fc区序列。在一些实施方案中，修饰Fc多肽与SEQ ID NO:1的氨基酸1-110，或与SEQ ID NO:1的氨基酸111-217，或其片段，例如至少50个氨基酸或至少100个氨基酸或更长的片段具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。

在一些实施方案中，修饰(例如增强异二聚和/或BBB受体结合)Fc多肽包含与天然Fc区氨基酸序列对应的至少50个氨基酸，或至少60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个或95个或更多个或至少100个氨基酸或更多个。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含与例如SEQ ID NO:1的天然Fc区氨基酸序列对应的至少25个相连氨基酸，或至少30个、35个、40个或45个相连氨基酸，或50个相连氨基酸，或至少60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个或95个或更多个相连氨基酸，或100个或更多个相连氨基酸。

在一些实施方案中，针对BBB受体结合活性进行修饰的结构域是人Ig CH3结构域，例如IgG1 CH3结构域。CH3结构域可能属于任何IgG亚型，即IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在IgG1抗体的上下文中，CH3结构域是指如根据EU编号方案编号，从约位置341至约位置447的氨基酸区段。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的修饰(例如BBB受体结合)Fc多肽在根据EU编号方案的氨基酸位置384、386、387、388、389、390、413、416和421处包含至少一个、两个或三个取代；和在一些实施方案中，至少四个、五个、六个、七个、八个或九个取代。

FcRn结合位点

在某些方面，修饰(例如BBB受体结合)Fc多肽或本文所述的融合蛋白中存在的不特异性结合于BBB受体的Fc多肽还可以包含FcRn结合位点。在一些实施方案中，FcRn结合位点在Fc多肽或其片段内。

在一些实施方案中，FcRn结合位点包含天然FcRn结合位点。在一些实施方案中，FcRn结合位点不包含相对于天然FcRn结合位点的氨基酸序列的氨基酸变化。在一些实施方案中，天然FcRn结合位点是IgG结合位点，例如人IgG结合位点。在一些实施方案中，FcRn结合位点包含改变FcRn结合的修饰。

在一些实施方案中，FcRn结合位点具有一个或多个突变，例如被取代的氨基酸残基，其中所述突变增加血清半衰期或基本上不减少血清半衰期(即，当在相同条件下测定时，与在突变位置处具有野生型残基的对应修饰Fc多肽相比血清半衰期减少至多25％)。在一些实施方案中，FcRn结合位点具有一个或多个在根据EU编号方案的位置250-256、307、380、428和433-436处被取代的氨基酸残基。

在一些实施方案中，在FcRn结合位点上或其附近的一个或多个残基相对于天然人IgG序列突变，以延长修饰多肽的血清半衰期。在一些实施方案中，突变引入位置252、254和256的一个、两个或三个中。在一些实施方案中，突变是M252Y、S254T和T256E。在一些实施方案中，修饰Fc多肽还包含突变M252Y、S254T和T256E。在一些实施方案中，修饰Fc多肽在根据EU编号方案的位置T307、E380和N434的一个、两个或全部三个处包含取代。在一些实施方案中，突变是T307Q和N434A。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含突变T307A、E380A和N434A。在一些实施方案中，修饰Fc多肽在根据EU编号方案的位置T250和M428处包含取代。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含突变T250Q和/或M428L。在一些实施方案中，修饰Fc多肽在根据EU编号方案的位置M428和N434处包含取代。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含突变M428L和N434S。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含N434S或N434A突变。

II.结合转铁蛋白受体的Fc多肽

本节描述结合于转铁蛋白受体(TfR)并且能够跨越血脑屏障(BBB)转运的本文所述的修饰Fc多肽的产生。

在CH3结构域中包含突变的结合TfR的Fc多肽

在一些实施方案中，特异性结合于TfR的修饰Fc多肽在CH3结构域中包含取代。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含针对TfR结合活性进行修饰的人Ig CH3结构域，例如IgGCH3结构域。CH3结构域可能属于任何IgG亚型，即IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在IgG抗体的上下文中，CH3结构域是指如根据EU编号方案编号，从约位置341至约位置447的氨基酸区段。

在一些实施方案中，特异性结合于TfR的修饰Fc多肽结合于TfR的顶端结构域并且可以在不阻断或以其它方式抑制转铁蛋白与TfR的结合的情况下结合于TfR。在一些实施方案中，转铁蛋白与TfR的结合基本上不受到抑制。在一些实施方案中，转铁蛋白与TfR的结合被抑制了不到约50％(例如不到约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)。在一些实施方案中，转铁蛋白与TfR的结合被抑制了不到约20％(例如不到约19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)。

在一些实施方案中，特异性结合于TfR的修饰Fc多肽在根据EU编号方案的氨基酸位置384、386、387、388、389、390、413、416和421处包含至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个取代。可以在这些位置处引入的例示性取代在表4和5中示出。在一些实施方案中，在位置388和/或421处的氨基酸是芳香族氨基酸，例如Trp、Phe或Tyr。在一些实施方案中，在位置388处的氨基酸是Trp。在一些实施方案中，在位置421处的芳香族氨基酸是Trp或Phe。

在一些实施方案中，至少一个如下位置被取代：在位置384处的Leu、Tyr、Met或Val；在位置386处的Leu、Thr、His或Pro；在位置387处的Val、Pro或酸性氨基酸；在位置388处的芳香族氨基酸，例如Trp；在位置389处的Val、Ser或Ala；在位置413处的酸性氨基酸、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；在位置416处的Thr或酸性氨基酸；或在位置421处的Trp、Tyr、His或Phe。在一些实施方案中，修饰Fc多肽可以包含保守取代，例如在集合中的一个或多个位置处的指定氨基酸的同一电荷分组、疏水性分组、侧链环状结构分组(例如芳香族氨基酸)或尺寸分组和/或极性或非极性分组中的氨基酸。因此，举例来说，Ile可以存在于位置384、386和/或位置413处。在一些实施方案中，在位置387、413和416中的一个、两个或每个位置处的酸性氨基酸是Glu。在其它实施方案中，在位置387、413和416中的一个、两个或每个位置处的酸性氨基酸是Asp。在一些实施方案中，位置384、386、387、388、389、413、416和421中的两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个位置具有如本段中说明的氨基酸取代。

在一些实施方案中，如前面两段中所述进行修饰的Fc多肽在位置390处包含天然Asn。在一些实施方案中，修饰Fc多肽在位置390处包含Gly、His、Gln、Leu、Lys、Val、Phe、Ser、Ala或Asp。在一些实施方案中，修饰Fc多肽还在根据EU编号方案的包含380、391、392和415的位置处包含一个、两个、三个或四个取代。在一些实施方案中，在位置380处可以存在Trp、Tyr、Leu或Gln。在一些实施方案中，在位置391处可以存在Ser、Thr、Gln或Phe。在一些实施方案中，在位置392处可以存在Gln、Phe或His。在一些实施方案中，在位置415处可以存在Glu。

在某些实施方案中，修饰Fc多肽包含两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个选自以下的位置：在位置380处的Trp、Leu或Glu；在位置384处的Tyr或Phe；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ser、Ala、Val或Asn；在位置390处的Ser或Asn；在位置413处的Thr或Ser；在位置415处的Glu或Ser；在位置416处的Glu；和/或在位置421处的Phe。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含全部十一个如下位置：在位置380处的Trp、Leu或Glu；在位置384处的Tyr或Phe；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ser、Ala、Val或Asn；在位置390处的Ser或Asn；在位置413处的Thr或Ser；在位置415处的Glu或Ser；在位置416处的Glu；和/或在位置421处的Phe。

在某些实施方案中，修饰Fc多肽包含在位置384处的Leu或Met；在位置386处的Leu、His或Pro；在位置387处的Val；在位置388处的Trp；在位置389处的Val或Ala；在位置413处的Pro；在位置416处的Thr；和/或在位置421处的Trp。在一些实施方案中，修饰Fc多肽还包含在位置391处的Ser、Thr、Gln或Phe。在一些实施方案中，修饰Fc多肽还包含在位置380处的Trp、Tyr、Leu或Gln和/或在位置392处的Gln、Phe或His。在一些实施方案中，在位置380处存在Trp和/或在位置392处存在Gln。在一些实施方案中，修饰Fc多肽在位置380处不具有Trp。

在其它实施方案中，修饰Fc多肽包含在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；Glu或Val和位置387；在位置388处的Trp；在位置389处的Ser；在位置413处的Ser或Thr；在位置416处的Glu；和/或在位置421处的Phe。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含在位置390处的天然Asn。在某些实施方案中，修饰Fc多肽还包含在位置380处的Trp、Tyr、Leu或Gln；和/或在位置415处的Glu。在一些实施方案中，修饰Fc多肽还包含在位置380处的Trp和/或在位置415处的Glu。

在另外的实施方案中，修饰Fc多肽还包含在根据EU编号方案的包含414、424和426的位置处的一个、两个或三个取代。在一些实施方案中，位置414是Lys、Arg、Gly或Pro；位置424是Ser、Thr、Glu或Lys；和/或位置426是Ser、Trp或Gly。

在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含以下取代中的一个或多个：根据EU编号方案，在位置380处的Trp；在位置386处的Thr；在位置388处的Trp；在位置389处的Val；在位置413处的Thr或Ser；在位置415处的Glu；和/或在位置421处的Phe。

在一些实施方案中，修饰Fc多肽与SEQ ID NO:4-90、95-98和103-106(例如SEQ IDNO:34-38、58和60-90)中的任一个的氨基酸111-217具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，修饰Fc多肽与SEQ ID NO:4-90、95-98和103-106(例如SEQ ID NO:34-38、58和60-90)中的任一个具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含在SEQ ID NO:4-90、95-98和103-106(例如SEQ ID NO:34-38、58和60-90)中的任一个的EU索引位置384-390和/或413-421处的氨基酸。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含在SEQ ID NO:4-90、95-98和103-106(例如SEQ ID NO:34-38、58和60-90)中的任一个的EU索引位置380-390和/或413-421处的氨基酸。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含在SEQ ID NO:4-90、95-98和103-106(例如SEQ ID NO:34-38、58和60-90)中的任一个的EU索引位置380-392和/或413-426处的氨基酸。

在一些实施方案中，修饰Fc多肽与SEQ ID NO:4-90、95-98和103-106(例如SEQ IDNO:34-38、58和60-90)中的任一个具有至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性，并且还包含根据EU索引编号的如下位置中的至少五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个或十六个：在位置380处的Trp、Tyr、Leu、Gln或Glu；在位置384处的Leu、Tyr、Met或Val；在位置386处的Leu、Thr、His或Pro；在位置387处的Val、Pro或酸性氨基酸；在位置388处的芳香族氨基酸，例如Trp；在位置389处的Val、Ser或Ala；在位置390处的Ser或Asn；在位置391处的Ser、Thr、Gln或Phe；在位置392处的Gln、Phe或His；在位置413处的酸性氨基酸、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；在位置414处的Lys、Arg、Gly或Pro；在位置415处的Glu或Ser；在位置416处的Thr或酸性氨基酸；在位置421处的Trp、Tyr、His或Phe；在位置424处的Ser、Thr、Glu或Lys；以及在位置426处的Ser、Trp或Gly。

在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含SEQ ID NO:34-38、58和60-90中的任一个的氨基酸序列。在其它实施方案中，修饰Fc多肽包含SEQ ID NO:34-38、58和60-90中的任一个的氨基酸序列，但其中一个、两个或三个氨基酸被取代。

在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含另外的突变，例如以下描述的突变，包括(但不限于)杵突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366W)、臼突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366S、L368A和Y407V)、调节效应功能的突变(例如，如参考EU编号进行编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))和/或增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T和T256E，或(ii)如参考EU编号进行编号的N434S，有或者没有M428L)。作为说明，SEQ ID NO:118-191提供包含这些另外的突变中的一个或多个的在CH3结构域中具有突变(例如克隆CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2和CH3C.35.23)的修饰Fc多肽的非限制性实例。

在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含杵突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366W)并且与SEQ ID NO:118、130、142、154、166和178中的任一个的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含SEQ ID NO:118、130、142、154、166和178中的任一个的序列。

在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含杵突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366W)和调节效应功能的突变(例如，如参考EU编号进行编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))，并且与SEQ ID NO:119、120、131、132、143、144、155、156、167、168、179、180、190和191中的任一个的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含SEQ ID NO:119、120、131、132、143、144、155、156、167、168、179和180中的任一个的序列。

在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含杵突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366W)和增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T和T256E，或(ii)如参考EU编号进行编号的N434S，有或者没有M428L)，并且与SEQ IDNO:121、133、145、157、169和181中的任一个的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含SEQ ID NO:121、133、145、157、169和181中的任一个的序列。

在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含杵突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366W)、调节效应功能的突变(例如，如参考EU编号进行编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))和增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T和T256E，或(ii)如参考EU编号进行编号的N434S，有或者没有M428L)，并且与SEQ ID NO:122、123、134、135、146、147、158、159、170、171、182和183中的任一个的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含SEQ ID NO:122、123、134、135、146、147、158、159、170、171、182和183中的任一个的序列。

在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含臼突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366S、L368A和Y407V)并且与SEQ ID NO:124、136、148、160、172和184中的任一个的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含SEQ ID NO:124、136、148、160、172和184中的任一个的序列。

在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含臼突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366S、L368A和Y407V)和调节效应功能的突变(例如，如参考EU编号进行编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))，并且与SEQ ID NO:125、126、137、138、149、150、161、162、173、174、185和186中的任一个的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含SEQ ID NO:125、126、137、138、149、150、161、162、173、174、185和186中的任一个的序列。

在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含臼突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366S、L368A和Y407V)和增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T和T256E，或(ii)如参考EU编号进行编号的N434S，有或者没有M428L)，并且与SEQ ID NO:127、139、151、163、175和187中的任一个的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含SEQ ID NO:127、139、151、163、175和187中的任一个的序列。

在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含臼突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366S、L368A和Y407V)、调节效应功能的突变(例如，如参考EU编号进行编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))和增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T和T256E，或(ii)如参考EU编号进行编号的N434S，有或者没有M428L)，并且与SEQ ID NO:128、129、140、141、152、153、164、165、176、177、188和189中的任一个的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含SEQ ID NO:128、129、140、141、152、153、164、165、176、177、188和189中的任一个的序列。

在一些实施方案中，特异性结合于TfR的修饰Fc多肽在根据EU编号方案的位置345、346、347、349、437、438、439和440处包含至少两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个取代。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含在位置437处的Gly；在位置438处的Phe；和/或在位置440处的Asp。在一些实施方案中，Glu存在于位置440处。在某些实施方案中，修饰Fc多肽包含在如下位置处的至少一个取代：在位置345处的Phe或Ile；在位置346处的Asp、Glu、Gly、Ala或Lys；在位置347处的Tyr、Met、Leu、Ile或Asp；在位置349处的Thr或Ala；在位置437处的Gly；在位置438处的Phe；在位置439处的His Tyr、Ser或Phe；或在位置440处的Asp。在一些实施方案中，如本段中所说明，在位置345、346、347、349、437、438、439和440中的两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个具有取代。在一些实施方案中，修饰Fc多肽可以包含保守取代，例如在集合中的一个或多个位置处的指定氨基酸的同一电荷分组、疏水性分组、侧链环状结构分组(例如芳香族氨基酸)或尺寸分组和/或极性或非极性分组中的氨基酸。

III.另外的Fc多肽突变

在一些方面，本文所述的融合蛋白包含两种Fc多肽，所述Fc多肽可以各自包含独立选择的修饰，或可以是野生型Fc多肽，例如人IgG1 Fc多肽。在一些实施方案中，一种或两种Fc多肽含有一个或多个赋予结合于血脑屏障(BBB)受体、例如转铁蛋白受体(TfR)的修饰。可以引入一种或两种Fc多肽中的其它突变的非限制性实例包括例如增加血清稳定性或血清半衰期、调节效应功能、影响糖基化、降低人中的免疫原性和/或提供Fc多肽的杵臼异二聚的突变。

在一些实施方案中，融合蛋白中存在的Fc多肽独立地与对应野生型Fc多肽(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽)具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。

在一些实施方案中，融合蛋白中存在的Fc多肽包括杵和臼突变以促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。一般地，所述修饰在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并且在第二多肽的界面中引入对应腔(“臼”)，使得突起可以位于腔中以便促进异二聚体形成并因此阻碍同二聚体形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链来构建。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面中产生与突起相同或类似尺寸的补偿腔。在一些实施方案中，这种另外的突变处于Fc多肽中对多肽与BBB受体如TfR的结合无副作用的位置。

在用于二聚的杵臼方法的一个示意性实施方案中，融合蛋白中存在的Fc多肽中的一种的位置366(根据EU编号方案编号)包含色氨酸，代替天然苏氨酸。二聚体中的另一种Fc多肽在位置407处(根据EU编号方案编号)具有缬氨酸，代替天然酪氨酸。另一种Fc多肽还可以包含取代，其中在位置366处(根据EU编号方案编号)的天然苏氨酸经丝氨酸取代并且在位置368处(根据EU编号方案编号)的天然亮氨酸经丙氨酸取代。因此，本文所述的融合蛋白的一种Fc多肽具有T366W杵突变并且另一种Fc多肽具有Y407V突变，其典型地伴有T366S和L368A臼突变。

在一些实施方案中，可以引入增强血清半衰期的修饰。举例来说，在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的一种或两种Fc多肽可以包含在位置252处的酪氨酸、在位置254处的苏氨酸和在位置256处的谷氨酸，如根据EU编号方案编号。因此，一种或两种Fc多肽可具有M252Y、S254T和T256E取代。可替代地，一种或两种Fc多肽可具有M428L和N434S取代，如根据EU编号方案编号。可替代地，一种或两种Fc多肽可具有N434S或N434A取代。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的一种或两种Fc多肽可以包含减少效应功能的修饰，即在结合于在介导效应功能的效应细胞上表达的Fc受体后诱导某些生物功能的能力减少。抗体效应功能的实例包括(但不限于)C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。效应功能可以随抗体类别而变。举例来说，在结合于在免疫系统细胞上存在的适当Fc受体后，天然人IgG1和IgG3抗体可以引起ADCC和CDC活性，并且在结合于在免疫细胞上存在的适当Fc受体后，天然人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4可以引起ADCP功能。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的一种或两种Fc多肽还可以被工程化成含有用于异二聚的其它修饰，例如CH3-CH3界面内接触残基的静电工程化，所述修饰为天然带电或疏水性补丁修饰。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的一种或两种Fc多肽可以包括调节效应功能的另外的修饰。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的一种或两种Fc多肽可以包含减少或消除效应功能的修饰。减少效应功能的例示性Fc多肽突变包括(但不限于)CH2结构域中例如在根据EU编号方案的位置234和235处的取代。举例来说，在一些实施方案中，一种或两种Fc多肽可以在位置234和235处包含丙氨酸残基。因此，一种或两种Fc多肽可具有L234A和L235A(LALA)取代。

调节效应功能的另外的Fc多肽突变包括(但不限于)以下：位置329可以具有如下突变，其中脯氨酸经甘氨酸或精氨酸或足够大以破坏在Fc的脯氨酸329与FcgRIII的色氨酸残基Trp 87和Trp 110之间形成的Fc/Fcg受体界面的氨基酸残基取代。另外的例示性取代包括根据EU编号方案的S228P、E233P、L235E、N297A、N297D和P331S。还可以存在多个取代，例如根据EU编号方案的人IgG1 Fc区的L234A和L235A；人IgG1 Fc区的L234A、L235A和P329G；人IgG4 Fc区的S228P和L235E；人IgG1 Fc区的L234A和G237A；人IgG1 Fc区的L234A、L235A和G237A；人IgG2 Fc区的V234A和G237A；人IgG4 Fc区的L235A、G237A和E318A；以及人IgG4 Fc区的S228P和L236E。在一些实施方案中，一种或两种Fc多肽可以具有一个或多个调节ADCC的氨基酸取代，例如在根据EU编号方案的位置298、333和/或334处的取代。

包含另外的突变的例示性Fc多肽

借助于非限制性实例，本文所述的融合蛋白中存在的一种或两种Fc多肽可以包含另外的突变，包括杵突变(例如，如根据EU编号方案编号的T366W)、臼突变(例如，如根据EU编号方案编号的T366S、L368A和Y407V)、调节效应功能的突变(例如，如根据EU编号方案编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))和/或增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T和T256E，或(ii)如参考EU编号进行编号的N434S，有或者没有M428L)。

在一些实施方案中，Fc多肽可以具有杵突变(例如，如根据EU编号方案编号的T366W)并且与SEQ ID NO:1和4-90中的任一个的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1和4-90中的任一个的序列的Fc多肽可以被修饰成具有杵突变。

在一些实施方案中，Fc多肽可以具有杵突变(例如，如根据EU编号方案编号的T366W)、调节效应功能的突变(例如，如根据EU编号方案编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))，并且与SEQ ID NO:1和4-90中的任一个的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1和4-90中的任一个的序列的Fc多肽可以被修饰成具有杵突变和调节效应功能的突变。

在一些实施方案中，Fc多肽可以具有杵突变(例如，如根据EU编号方案编号的T366W)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T和T256E，或(ii)如参考EU编号进行编号的N434S，有或者没有M428L)，并且与SEQ IDNO:1和4-90中的任一个的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1和4-90中的任一个的序列的Fc多肽可以被修饰成具有杵突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变。

在一些实施方案中，Fc多肽可以具有杵突变(例如，如根据EU编号方案编号的T366W)、调节效应功能的突变(例如，如根据EU编号方案编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T和T256E，或(ii)如参考EU编号进行编号的N434S，有或者没有M428L)，并且与SEQ ID NO:1和4-90中的任一个的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1和4-90中的任一个的序列的Fc多肽可以被修饰成具有杵突变、调节效应功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变。

在一些实施方案中，Fc多肽可以具有臼突变(例如，如根据EU编号方案编号的T366S、L368A和Y407V)并且与SEQ ID NO:1和4-90中的任一个的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1和4-90中的任一个的序列的Fc多肽可以被修饰成具有臼突变。

在一些实施方案中，Fc多肽可以具有臼突变(例如，如根据EU编号方案编号的T366S、L368A和Y407V)、调节效应功能的突变(例如，如根据EU编号方案编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))，并且与SEQ ID NO:1和4-90中的任一个的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1和4-90中的任一个的序列的Fc多肽可以被修饰成具有臼突变和调节效应功能的突变。

在一些实施方案中，Fc多肽可以具有臼突变(例如，如根据EU编号方案编号的T366S、L368A和Y407V)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，(i)如参考EU编号方案编号的M252Y、S254T和T256E，或(ii)如参考EU编号方案编号的N434S，有或者没有M428L)，并且与SEQ ID NO:1和4-90中的任一个的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1和4-90中的任一个的序列的Fc多肽可以被修饰成具有臼突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变。

在一些实施方案中，Fc多肽可以具有臼突变(例如，如根据EU编号方案编号的T366S、L368A和Y407V)、调节效应功能的突变(例如，如根据EU编号方案编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T和T256E，或(ii)如参考EU编号进行编号的N434S，有或者没有M428L)，并且与SEQ ID NO:1和4-90中的任一个的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1和4-90中的任一个的序列的Fc多肽可以被修饰成具有臼突变、调节效应功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变。

IV.包含ERT酶的例示性融合蛋白

在一些方面，本文所述的融合蛋白包含第一Fc多肽，所述第一Fc多肽连接于酶替代疗法(ERT)酶、ERT酶变体或其催化活性片段；和第二Fc多肽，所述第二Fc多肽与第一Fc多肽形成Fc二聚体。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽不包括免疫球蛋白重链和/或轻链可变区序列或其抗原结合部分。在一些实施方案中，ERT酶是IDS。在一些实施方案中，第一Fc多肽是修饰Fc多肽和/或第二Fc多肽是修饰Fc多肽。在一些实施方案中，第二Fc多肽是修饰Fc多肽。在一些实施方案中，修饰Fc多肽含有一个或多个促进其与另一种Fc多肽的异二聚的修饰。在一些实施方案中，修饰Fc多肽含有一个或多个减少效应功能的修饰。在一些实施方案中，修饰Fc多肽含有一个或多个延长血清半衰期的修饰。在一些实施方案中，修饰Fc多肽含有一个或多个赋予结合于血脑屏障(BBB)受体、例如转铁蛋白受体(TfR)的修饰。

在其它方面中，本文所述的融合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含特异性结合于BBB受体如TfR的修饰Fc多肽；和第二多肽链，所述第二多肽链包含与修饰Fc多肽二聚形成Fc二聚体的Fc多肽。ERT酶可以连接于第一或第二多肽链。在一些实施方案中，ERT酶是IDS。在一些实施方案中，ERT酶连接于第二多肽链。在一些实施方案中，蛋白质包含两种ERT酶，每一种连接于多肽链中的一种。在一些实施方案中，Fc多肽可以是结合BBB受体的多肽，其特异性结合于与第一多肽链中的修饰Fc多肽相同的BBB受体。在一些实施方案中，Fc多肽不特异性结合于BBB受体。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含特异性结合于TfR的修饰Fc多肽；和第二多肽链，所述第二多肽链包含Fc多肽，其中所述修饰Fc多肽与所述Fc多肽二聚，形成Fc二聚体。在一些实施方案中，ERT酶是IDS。在一些实施方案中，ERT酶连接于第一多肽链。在一些实施方案中，ERT酶连接于第二多肽链。在一些实施方案中，Fc多肽不特异性结合于BBB受体，例如TfR。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含结合于TfR并且包含T366W(杵)取代的修饰Fc多肽；和第二多肽链，所述第二多肽链包含包括T366S、L368A和Y407V(臼)取代的Fc多肽。在一些实施方案中，修饰Fc多肽和/或Fc多肽还包含L234A和L235A(LALA)取代。在一些实施方案中，修饰Fc多肽和/或Fc多肽还包含M252Y、S254T和T256E(YTE)取代。在一些实施方案中，修饰Fc多肽和/或Fc多肽还包含L234A和L235A(LALA)取代和M252Y、S254T和T256E(YTE)取代。在一些实施方案中，修饰Fc多肽和/或Fc多肽在位置234、235、252、254、256和366处包含人IgG1野生型残基。

在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含如针对SEQ ID NO:95-98、117、118-123、130-135、142-147、154-159、166-171和178-183中的任一个所说明的杵、LALA和YTE突变，并且与相应序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性；或包含SEQ ID NO:95-98、117、118-123、130-135、142-147、154-159、166-171和178-183中的任一个的序列。在一些实施方案中，Fc多肽包含如针对SEQ ID NO:99-102中的任一个所说明的臼、LALA和YTE突变并且与相应序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性；或包含SEQID NO:99-102中的任一个的序列。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含SEQ ID NO:95-98、117、118-123、130-135、142-147、154-159、166-171和178-183中的任一个，并且Fc多肽包含SEQ ID NO:99-102中的任一个。在一些实施方案中，修饰Fc多肽和/或Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:111)。在一些实施方案中，修饰Fc多肽与SEQ ID NO:114、190和191中的任一个具有至少85％、至少90％或至少95％同一性，或包含SEQ ID NO:114、190和191中的任一个的序列。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含结合于TfR并且包含T366S、L368A和Y407V(臼)取代的修饰Fc多肽；和第二多肽链，所述第二多肽链包含包括T366W(杵)取代的Fc多肽。在一些实施方案中，修饰Fc多肽和/或Fc多肽还包含L234A和L235A(LALA)取代。在一些实施方案中，修饰Fc多肽和/或Fc多肽还包含M252Y、S254T和T256E(YTE)取代。在一些实施方案中，修饰Fc多肽和/或Fc多肽还包含L234A和L235A(LALA)取代和M252Y、S254T和T256E(YTE)取代。在一些实施方案中，修饰Fc多肽和/或Fc多肽在位置234、235、252、254、256和366处包含人IgG1野生型残基。

在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含如针对SEQ ID NO:103-106、124-129、136-141、148-153、160-165、172-177和184-189中的任一个所说明的臼、LALA和YTE突变，并且与相应序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性；或包含SEQ ID NO:103-106、124-129、136-141、148-153、160-165、172-177和184-189中的任一个的序列。在一些实施方案中，Fc多肽包含如针对SEQ ID NO:107-110中的任一个所说明的杵、LALA和YTE突变并且与相应序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性；或包含SEQID NO:107-110中的任一个的序列。在一些实施方案中，修饰Fc多肽包含SEQ ID NO:103-106、124-129、136-141、148-153、160-165、172-177和184-189中的任一个，并且Fc多肽包含SEQ ID NO:107-110中的任一个。在一些实施方案中，修饰Fc多肽和/或Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:111)。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的ERT酶如IDS连接于多肽链，所述多肽链包含与SEQ ID NO:99-102中的任一个具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的Fc多肽，或包含SEQ ID NO:99-102中的任一个的序列(例如呈融合多肽)。在一些实施方案中，ERT酶如IDS通过接头(例如柔性接头)和/或铰链区或其部分(例如DKTHTCPPCP；SEQID NO:111)连接于Fc多肽。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:112、192和196中的任一个具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的IDS序列，或包含SEQ ID NO:112、192和196中的任一个的序列。在一些实施方案中，连接于Fc多肽的IDS序列与SEQ ID NO:113、115、193、194、197和198中的任一个具有至少85％、至少90％或至少95％同一性，或包含SEQID NO:113、115、193、194、197和198中的任一个的序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与SEQ ID NO:95-98、117、118-123、130-135、142-147、154-159、166-171和178-183中的任一个具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的修饰Fc多肽，或包含SEQ ID NO:95-98、117、118-123、130-135、142-147、154-159、166-171和178-183中的任一个的序列。在一些实施方案中，Fc多肽和/或修饰Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQID NO:111)。在一些实施方案中，修饰Fc多肽与SEQ ID NO:114、190和191中的任一个具有至少85％、至少90％或至少95％同一性，或包含SEQ ID NO:114、190和191中的任一个的序列。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:113的序列的IDS-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:167和190中的任一个的序列(例如SEQ ID NO:190)的修饰Fc多肽。在其它实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:113的序列的IDS-Fc融合多肽，和包含SEQ IDNO:131和191中的任一个的序列(例如SEQ ID NO:191)的修饰Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:193的序列的IDS-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:167和190中的任一个的序列(例如SEQ ID NO:190)的修饰Fc多肽。在其它实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:193的序列的IDS-Fc融合多肽，和包含SEQ IDNO:131和191中的任一个的序列(例如SEQ ID NO:191)的修饰Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:197的序列的IDS-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:167和190中的任一个的序列(例如SEQ ID NO:190)的修饰Fc多肽。在其它实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:197的序列的IDS-Fc融合多肽，和包含SEQ IDNO:131和191中的任一个的序列(例如SEQ ID NO:191)的修饰Fc多肽。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的ERT酶如IDS连接于多肽链，所述多肽链包含与SEQ ID NO:107-110中的任一个具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的Fc多肽，或包含SEQ ID NO:107-110中的任一个的序列(例如呈融合多肽)。在一些实施方案中，ERT酶如IDS通过接头(例如柔性接头)和/或铰链区或其部分(例如DKTHTCPPCP；SEQID NO:111)连接于Fc多肽。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:112、192和196中的任一个具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的IDS序列，或包含SEQ ID NO:112、192和196中的任一个的序列。在一些实施方案中，连接于Fc多肽的IDS序列与SEQ ID NO:116、195和199中的任一个具有至少85％、至少90％或至少95％同一性，或包含SEQ ID NO:116、195和199中的任一个的序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与SEQ ID NO:103-106、124-129、136-141、148-153、160-165、172-177和184-189中的任一个具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的修饰Fc多肽，或包含SEQ ID NO:103-106、124-129、136-141、148-153、160-165、172-177和184-189中的任一个的序列。在一些实施方案中，Fc多肽和/或修饰Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:111)。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的ERT酶如IDS连接于多肽链，所述多肽链包含与SEQ ID NO:95-98、117、118-123、130-135、142-147、154-159、166-171和178-183中的任一个具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的修饰Fc多肽，或包含SEQID NO:95-98、117、118-123、130-135、142-147、154-159、166-171和178-183中的任一个的序列(例如呈融合多肽)。在一些实施方案中，ERT酶如IDS通过接头(例如柔性接头)和/或铰链区或其部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:111)连接于修饰Fc多肽。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:112、192和196中的任一个具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的IDS序列，或包含SEQ ID NO:112、192和196中的任一个的序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与SEQ ID NO:99-102中的任一个具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的Fc多肽，或包含SEQ ID NO:99-102中的任一个的序列。在一些实施方案中，修饰Fc多肽和/或Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:111)。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的ERT酶如IDS连接于多肽链，所述多肽链包含与SEQ ID NO:103-106、124-129、136-141、148-153、160-165、172-177和184-189中的任一个具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的修饰Fc多肽，或包含SEQ IDNO:103-106、124-129、136-141、148-153、160-165、172-177和184-189中的任一个的序列(例如呈融合多肽)。在一些实施方案中，ERT酶如IDS通过接头(例如柔性接头)和/或铰链区或其部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:111)连接于修饰Fc多肽。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:112、192和196中的任一个具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的IDS序列，或包含SEQ ID NO:112、192和196中的任一个的序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与SEQ ID NO:107-110中的任一个具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的Fc多肽，或包含SEQ ID NO:107-110中的任一个的序列。在一些实施方案中，修饰Fc多肽和/或Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:111)。

V.连接于Fc多肽的ERT酶

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含两种如本文所述的Fc多肽并且所述Fc多肽中的一种或两种还可以包含部分或完全铰链区。铰链区可以来自于任何免疫球蛋白亚类或同型。一种例示性免疫球蛋白铰链是IgG铰链区，例如IgG1铰链区，例如人IgG1铰链氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:93)或其一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:111)。在一些实施方案中，铰链区在Fc多肽的N端区。

在一些实施方案中，Fc多肽通过接头，例如肽接头接合于ERT酶。在一些实施方案中，Fc多肽通过肽键或通过肽接头接合于ERT酶，例如是融合多肽。肽接头可以被配置成允许ERT酶相对于其接合的Fc多肽旋转；和/或抵抗蛋白酶消化。肽接头可以含有天然氨基酸、非天然氨基酸或它们的组合。在一些实施方案中，肽接头可以是柔性接头，例如含有氨基酸，例如Gly、Asn、Ser、Thr、Ala等。这种接头使用已知参数设计并且可以是任何长度并含有任何数目的任何长度的重复单元(例如Gly和Ser残基的重复单元)。举例来说，接头可以具有重复单元，例如两个、三个、四个、五个或更多个Gly

在一些实施方案中，ERT酶例如通过Gly

在一些实施方案中，Fc多肽可以在N端包含接合于接头或直接接合于ERT酶的铰链序列或部分铰链序列。

在一些实施方案中，ERT酶例如通过Gly

在一些实施方案中，ERT酶通过化学交联剂接合于Fc多肽。这种缀合物可以使用众所周知的化学交联试剂和方案产生。举例来说，存在本领域的技术人员已知并且可用于使多肽与所关注剂交联的大量化学交联剂。举例来说，交联剂是杂双官能交联剂，其可以用于以逐步方式连接分子。杂双官能交联剂能够针对缀合蛋白质设计更特定的偶合方法，从而减少如同型蛋白质聚合物的不必要的副反应的发生。多种杂双官能交联剂是本领域已知的，包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或其水溶性类似物N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)；N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)；4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(SMPT)、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)和琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯]己酸酯(LC-SPDP)。那些具有N-羟基琥珀酰亚胺部分的交联剂可以作为N-羟基磺基琥珀酰亚胺类似物获得，其通常具有更大的水溶性。另外，那些在连接链内具有二硫键的交联剂可以作为烷基衍生物替代地合成，以降低体内接头的裂解量。除了杂双官能交联剂外，还存在许多其它交联剂，包括同双官能交联剂和光反应性交联剂。辛二酸二琥珀酰亚胺基酯(DSS)、双马来酰亚胺基己烷(BMH)和庚二亚氨酸二甲酯.2HCl(DMP)是有用的同双官能交联剂的实例，并且双-[B-(4-叠氮基水杨酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)和N-琥珀酰亚胺基-6(4'-叠氮基2'-硝基苯基氨基)己酸酯(SANPAH)是有用的光反应性交联剂的实例。

筛选方法

本文所述的某些实施方案还提供了一种针对作为LSD治疗的活性筛选测试剂的方法，所述方法包括：

1)使细胞与所述测试剂接触，其中所述细胞的溶酶体贮积受损；以及

2)测量以下的浓度：

a)所述细胞中的两种或更多种脂质的组合，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

i)BMP；

ii)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

iii)GD3；

iv)GD1a/b；以及

v)GlcCer；

b)所述细胞中的GlcCer，条件是针对作为MPS治疗的活性筛选所述测试剂；和/或

c)所述细胞中的sTREM2，

其中与对照细胞(例如健康细胞，例如不具有LSD突变的细胞)中的对应脂质/蛋白质的浓度相比所述细胞中的所选脂质/蛋白质的浓度下降表明所述测试剂具有作为LSD治疗的活性。

本文所述的某些实施方案提供了一种针对作为LSD治疗的活性筛选测试剂的方法，所述方法包括：

1)使细胞与所述测试剂接触，其中所述细胞的溶酶体贮积受损；以及

2)测量以下的浓度：

a)所述细胞中的两种或更多种脂质的组合，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

i)BMP；

ii)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

iii)GD3；

iv)GD1a/b；以及

v)GlcCer；

b)所述细胞中的GlcCer，条件是针对作为MPS治疗的活性筛选所述测试剂；

c)所述细胞中的Nf-L；和/或

d)所述细胞中的sTREM2，

其中与对照细胞(例如健康细胞，例如不具有LSD突变的细胞)中的对应脂质/蛋白质的浓度相比所述细胞中的所选脂质/蛋白质的浓度下降表明所述测试剂具有作为LSD治疗的活性。

在某些实施方案中，所述方法包括测量sTREM2的浓度。

在某些实施方案中，所述方法包括测量Nf-L的浓度。

在某些实施方案中，所述方法包括测量GlcCer的浓度，其中针对作为MPS治疗的活性筛选所述测试剂。

在某些实施方案中，所述方法包括测量两种或更多种脂质的组合，例如本文所述的组合的浓度。

在某些实施方案中，所述方法包括测量一种或多种脂质的浓度和sTREM2的浓度。

在某些实施方案中，所述方法包括测量一种或多种脂质的浓度和Nf-L的浓度。

在某些实施方案中，所述方法包括测量sTREM2的浓度和Nf-L的浓度。

在某些实施方案中，所述方法包括测量一种或多种脂质的浓度、sTREM2的浓度和Nf-L的浓度。

在某些实施方案中，细胞来自于组织。举例来说，在某些实施方案中，细胞是来自脑、肝、肾、肺或脾的细胞。在某些实施方案中，细胞是脑细胞或源自于脑细胞的细胞。在实施方案中，细胞是从CSF获得的细胞。在实施方案中，细胞是从血清获得的细胞。

在某些实施方案中，脂质/蛋白质的浓度使用本文所述的测定法(例如质谱法)测量。

分离富集的CNS细胞群体的方法

本文提供了从脑组织中分离富集的CNS细胞类型的群体(例如富集的神经元、星形胶质细胞或小胶质细胞的群体)的方法。

因此，某些实施方案提供了一种从组织样品中分选CNS细胞群体的方法，所述方法包括：

(a)使所述组织样品与神经元标志物一抗、星形胶质细胞标志物一抗、小胶质标志物一抗、内皮标志物一抗以及少突胶质细胞标志物一抗接触，其中每种一抗被独特地标记，以提供被标记的组织样品；以及

(b)通过流式细胞术对所述被标记的组织样品中的所述细胞进行分选，

其中所述方法提供神经元、星形胶质细胞以及小胶质细胞的独特细胞群体。

如本文所用，术语“独特细胞群体”是指在物理上分离的细胞群体，其富含特定的CNS细胞类型(例如神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞)。

如本文所用，术语“神经元标志物”是指神经元优先在CNS中表达的蛋白质或肽。在某些实施方案中，CNS中存在的至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.5％的神经元细胞表达神经元标志物。在某些实施方案中，CNS中存在的非神经元细胞中少于约35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％表达神经元标志物。在某些实施方案中，CNS中存在的非神经元细胞类型不表达神经元标志物。在某些实施方案中，神经元标志物是Thy1(参见例如UniProtKB P01831(小鼠))。

如本文所用，术语“神经元标志物一抗”或“抗神经元标志物抗体”是指能够以足够的亲和力结合神经元标志物的抗体，使得该抗体可用于使用流式细胞术从混合细胞群体中对神经元进行分选。在一个实施方案中，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量，抗神经元标志物抗体与无关蛋白质的结合程度小于所述抗体与神经元标志物的结合的约10％。在某些实施方案中，与神经元标志物结合的抗体的解离常数(Kd)≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM或≤0.001nM(例如10

如本文所用，术语“星形胶质细胞标志物”是指星形胶质细胞优先在CNS中表达的蛋白质或肽。在某些实施方案中，CNS中存在的至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.5％的星形胶质细胞表达星形胶质细胞标志物。在某些实施方案中，CNS中存在的非星形胶质细胞中少于约35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％表达星形胶质细胞标志物。在某些实施方案中，CNS中存在的非星形胶质细胞类型不表达星形胶质细胞标志物。在某些实施方案中，星形胶质细胞标志物是兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)(参见例如UniProtKB P43006(小鼠))。在某些实施方案中，星形胶质细胞标志物是被抗星形胶质细胞表面抗原2(ACSA-2)抗体识别的糖基化表面分子(参见例如Kantzer等人,2017,Glia,65:990-1004)。

如本文所用，术语“星形胶质细胞标志物一抗”或“抗星形胶质细胞标志物抗体”是指能够以足够的亲和力结合星形胶质细胞标志物的抗体，使得该抗体可用于使用流式细胞术从混合细胞群体中对星形胶质细胞进行分选。在一个实施方案中，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量，抗星形胶质细胞标志物抗体与无关蛋白质的结合程度小于所述抗体与星形胶质细胞标志物的结合的约10％。在某些实施方案中，抗体与星形胶质细胞标志物的结合的解离常数(Kd)≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM或≤0.001nM(例如10

如本文所用，术语“小胶质标志物”是指小胶质细胞优先在CNS内表达的蛋白质或肽。在某些实施方案中，CNS中存在的至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.5％的小胶质细胞表达小胶质标志物。在某些实施方案中，CNS中存在的非小胶质细胞中少于约35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％表达小胶质标志物。在某些实施方案中，CNS中存在的非小胶质细胞类型不表达小胶质标志物。在某些实施方案中，小胶质标志物是CD11b(参见例如UniProtKB P05555(小鼠))。

如本文所用，术语“小胶质标志物一抗”或“抗小胶质标志物抗体”是指能够以足够的亲和力结合小胶质标志物的抗体，使得该抗体可用于使用流式细胞术从混合细胞群体中对小胶质细胞进行分选。在一个实施方案中，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量，抗小胶质标志物抗体与无关蛋白质的结合程度小于所述抗体与小胶质标志物的结合的约10％。在某些实施方案中，抗体与小胶质标志物的结合的解离常数(Kd)≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM或≤0.001nM(例如10

如本文所用，术语“内皮标志物”是指内皮细胞优先在CNS内表达的蛋白质或肽。在某些实施方案中，CNS中存在的至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.5％的内皮细胞表达内皮细胞标志物。在某些实施方案中，CNS中存在的非内皮细胞中少于约35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％表达内皮细胞标志物。在某些实施方案中，CNS中存在的非内皮细胞类型不表达内皮细胞标志物。在某些实施方案中，内皮细胞标志物是CD31(参见例如UniProtKB Q08481(小鼠))。

如本文所用，术语“内皮标志物一抗”或“抗内皮细胞标志物抗体”是指能够以足够的亲和力结合内皮细胞标志物的抗体，使得该抗体可用于使用流式细胞术从混合细胞群体中对内皮细胞进行分选。在一个实施方案中，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量，抗内皮细胞标志物抗体与无关蛋白质的结合程度小于所述抗体与内皮细胞标志物的结合的约10％。在某些实施方案中，抗体与内皮细胞标志物的结合的解离常数(Kd)≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM或≤0.001nM(例如10

如本文所用，术语“少突胶质细胞标志物”是指少突胶质细胞优先在CNS内表达的蛋白质或肽。在某些实施方案中，CNS中存在的至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.5％的少突胶质细胞表达少突胶质细胞标志物。在某些实施方案中，CNS中存在的非少突胶质细胞中少于约35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％表达少突胶质细胞标志物。在某些实施方案中，CNS中存在的非少突胶质类型不表达少突胶质细胞标志物。在某些实施方案中，少突胶质细胞标志物是膜脂标志物。在某些实施方案中，少突胶质细胞标志物是在成熟少突胶质细胞上富集的一种脂质，例如半乳糖脑苷脂(GalCer)。

如本文所用，术语“少突胶质细胞标志物一抗”或“抗少突胶质细胞标志物抗体”是指能够以足够的亲和力结合少突胶质细胞标志物的抗体，使得该抗体可用于使用流式细胞术从混合细胞群体中对少突胶质细胞进行分选。在一个实施方案中，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量，抗少突胶质细胞标志物抗体与无关蛋白质的结合程度小于所述抗体与少突胶质细胞标志物的结合的约10％。在某些实施方案中，抗体与少突胶质细胞标志物的结合的解离常数(Kd)≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM或≤0.001nM(例如10

在某些实施方案中，使组织样品与抗Thy1抗体、抗EAAT2抗体、抗CD11b抗体、抗CD31抗体和抗O1抗体接触。在某些实施方案中，使组织样品与抗Thy1抗体、抗ACSA-2抗体、抗CD11b抗体、抗CD31抗体和抗O1抗体接触。在某些实施方案中，一抗包含在组合物内，并使所述组织样品与所述组合物接触。在某些实施方案中，每一种一抗都用适合于通过流式细胞术分选的标记(例如荧光标记)独特地标记(即，每一种抗体包含不同的标记)。在某些实施方案中，使组织样品进一步与活性染料接触，所述染料可以用于通过流式细胞术区别活细胞与非活细胞(例如固定型活性染剂BV510)。在某些实施方案中，与一抗同时或依序使组织样品与活性染料接触。在某些其它实施方案中，活性染料包含在包含一抗的组合物内，并且使组织样品与包含一抗和活性染料的组合物接触。

在某些实施方案中，在与活性染料、一抗和/或包含一抗的有或者没有活性染料的组合物接触之前使组织样品内存在的细胞解离。

在某些实施方案中，在适合于抗体与其对应的标志物结合并标记细胞的条件下使组织样品与一抗接触。在某些实施方案中，在通过流式细胞术分选之前被标记的组织样品包含标记的Thy1

在某些实施方案中，组织样品内存在的细胞通过流式细胞术分选成非活细胞群体和活细胞群体(例如用活性染料)。

在某些实施方案中，组织样品内存在的细胞通过流式细胞术分选成O1

在某些实施方案中，组织样品内存在的细胞通过流式细胞术分选成CD31

在某些实施方案中，组织样品内存在的细胞通过流式细胞术分选成Thy

在某些实施方案中，组织样品内存在的细胞通过流式细胞术分选成EAAT2

在某些实施方案中，组织样品内存在的细胞通过流式细胞术分选成ACSA-2

在某些实施方案中，组织样品内存在的细胞通过流式细胞术分选成CD11b

在某些实施方案中，组织样品内存在的细胞通过流式细胞术分选成活的、O1

在某些实施方案中，组织样品内存在的细胞通过流式细胞术分选成活的、O1

在某些实施方案中，组织样品内存在的细胞通过流式细胞术分选成活的、O1

在某些实施方案中，组织样品内存在的细胞通过流式细胞术分选成活的、O1

在某些实施方案中，组织样品内存在的细胞通过流式细胞术分选成活的、O1

在某些实施方案中，组织样品内存在的细胞通过流式细胞术分选成活的、O1

在某些实施方案中，组织样品内存在的细胞通过流式细胞术分选成非活细胞群体与活细胞群体(例如用活性染料)。在某些实施方案中，活细胞群体被进一步分选成O1

在某些实施方案中，组织样品内存在的细胞通过流式细胞术分选成非活细胞群体与活细胞群体(例如用活性染料)。在某些实施方案中，活细胞群体被进一步分选成O1

在某些实施方案中，组织样品内存在的细胞通过流式细胞术分选成非活细胞群体与活细胞群体(例如用活性染料)。在某些实施方案中，活细胞群体被进一步分选成CD31

在某些实施方案中，组织样品内存在的细胞通过流式细胞术分选成非活细胞群体与活细胞群体(例如用活性染料)。在某些实施方案中，活细胞群体被进一步分选成CD31

在某些实施方案中，小胶质细胞群体基于标志物概况O1

在某些实施方案中，星形胶质细胞群体基于标志物概况O1

在某些实施方案中，神经元群体基于标志物概况O1

在某些实施方案中，经过分选的富集的神经元细胞(例如活的、O1

在某些实施方案中，经过分选的富集的星形胶质细胞(例如活的、O1

在某些实施方案中，经过分选的富集的小胶质细胞(例如活的、O1

在某些实施方案中，分析富集的细胞群体中的一个或多个(例如，富集的细胞群体中的1个、2个或3个)以定量代谢物质或核酸物质。在某些实施方案中，分析富集的神经元细胞群体以定量代谢物质或核酸物质。在某些实施方案中，分析富集的星形胶质细胞群体以定量代谢物质或核酸物质。在某些实施方案中，分析富集的小胶质细胞群体以定量代谢物质或核酸物质。在某些实施方案中，分析富集的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞群体以定量代谢物质或核酸物质。在某些实施方案中，分析一个或多个富集的细胞群体以定量代谢物质。在某些实施方案中，分析一个或多个富集的细胞群体以定量超过一种代谢物质(例如2种、3种、4种、5种、10种、25种、50种或更多种)。在某些实施方案中，分析一个或多个富集的细胞群体以定量核酸物质。在某些实施方案中，分析一个或多个富集的细胞群体以定量超过一种核酸物质(例如2种、3种、4种、5种、10种、25种、50种或更多种)。在某些实施方案中，分析一个或多个富集的细胞群体以定量代谢物质和核酸物质。在某些实施方案中，分析一个或多个富集的细胞群体以定量超过一种代谢物质和超过一种核酸物质。

如本文所用，术语代谢物质包括通常由溶酶体分解的大分子。举例来说，在某些实施方案中，代谢物质是糖胺聚糖(GAG)物质，例如本文所述的GAG物质(例如D0S0、D0A0或D0a4)。在某些实施方案中，代谢物质是脂质物质，例如神经节苷脂、糖基神经酰胺(例如葡萄糖基神经酰胺)、半乳糖基神经酰胺和双(单酰基甘油)磷酸酯(BMP)物质(例如本文所述的物质)。在某些实施方案中，代谢物质是BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和/或GM3物质(例如如本文所述)。在某些实施方案中，定量代谢物质的组合，例如本文所述的脂质的组合。可以使用本领域中已知的方法定量代谢物质。举例来说，可以使用液相色谱质谱(LCMS)测定法(参见例如实施例)定量代谢物质。

核酸可以是例如RNA或DNA，例如基因组DNA、从基因组DNA转录的RNA或从RNA产生的cDNA。在某些实施方案中，核酸物质是RNA。在某些实施方案中，核酸物质是DNA。在某些实施方案中，核酸物质是基因组DNA。定量核酸物质的方法是本领域中已知的。例如，这类方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)，包括定量PCR(qPCR)和实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)；RNAseq；RNA印迹分析、表达微阵列分析；下一代测序(NGS)；和荧光原位杂交(FISH)。在某些实施方案中，使用本文所述的测定法定量核酸物质。

在某些实施方案中，分析一个或多个富集的细胞群体以定量sTREM2。在某些实施方案中，分析富集的小胶质细胞群体以定量sTREM2。可以使用本领域中已知的方法定量sTREM2。举例来说，可以使用实施例中所述的测定法定量sTREM2。

在某些实施方案中，分析一个或多个富集的细胞群体以定量Nf-L。在某些实施方案中，分析富集的神经元细胞群体以定量Nf-L。可以使用本领域中已知的方法定量Nf-L。举例来说，可以使用实施例中所述的测定法定量Nf-L。

在某些实施方案中，分析一个或多个富集的细胞群体以定量施用的治疗剂。在某些实施方案中，分析富集的神经元细胞群体以定量施用的治疗剂。在某些实施方案中，分析富集的星形胶质细胞群体以定量施用的治疗剂。在某些实施方案中，分析富集的小胶质细胞群体以定量施用的治疗剂。在某些实施方案中，分析富集的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞群体以定量施用的治疗剂。在某些实施方案中，治疗剂是能够减少与LSD相关的一种或多种症状的剂。在某些实施方案中，治疗剂是ETV:IDS。用于定量治疗剂的方法是本领域中已知的并且在本文中描述。举例来说，可以通过实施例中所述的测定法定量治疗剂。

某些实施方案提供了包含三个在物理上分离的细胞群体的许多CNS细胞，其中：

1)第一细胞群体包含富集的O1

2)第二细胞群体包含富集的O1

3)第三细胞群体包含富集的O1

校正的细胞以及相关方法

如本文所述，LSD是由某些溶酶体酶缺乏，导致某些细胞类型(例如某些CNS细胞)内代谢物质积聚而引起的。可以通过使受影响的细胞与某些治疗剂(例如本文所述的治疗剂)接触来校正这种积聚。例如，具有溶酶体酶缺乏的细胞(例如CNS细胞)内的代谢物质的积聚可以通过使细胞与融合蛋白接触而减少，所述融合蛋白包括连接于Fc多肽的酶替代疗法(ERT)酶。

因此，某些实施方案提供了一种校正的CNS细胞，所述CNS细胞包含引起所述细胞内代谢物质积聚的溶酶体酶缺乏，其中通过使所述细胞与包含以下的蛋白质接触而进行校正：(i)第一Fc多肽，其连接于所述溶酶体酶，和(ii)第二Fc多肽，其与所述第一Fc多肽形成Fc二聚体，其中所述蛋白质能够结合于转铁蛋白受体(TfR)，并且其中所述校正是减少所述代谢物质的积聚。在某些实施方案中，校正的CNS细胞是人细胞。在某些实施方案中，校正的CNS细胞是非人细胞。在某些实施方案中，细胞是经过分离的或经过纯化的校正的CNS细胞。

某些实施方案还提供了一种校正的CNS细胞，所述CNS细胞包含减少的代谢物质的积聚，其中使包含引起所述细胞内所述代谢物质积聚的溶酶体酶缺乏的CNS细胞与包含以下的蛋白质接触：

(i)连接于所述溶酶体酶的第一Fc多肽；以及

(ii)第二Fc多肽，其与所述第一Fc多肽形成Fc二聚体，其中所述蛋白质能够结合于转铁蛋白受体(TfR)，

以提供包含减少的所述代谢物质积聚的所述校正的CNS细胞。

某些实施方案还提供了一种校正的CNS细胞，其通过本文所述的方法，例如以下描述的方法产生。

某些实施方案还提供了一种校正CNS细胞的方法，所述CNS细胞具有引起细胞中代谢物质积聚的溶酶体酶缺乏，所述方法包括使所述细胞与包含以下的蛋白质接触：(i)连接于所述溶酶体酶的第一Fc多肽；以及(ii)第二Fc多肽，其与所述第一Fc多肽形成Fc二聚体，其中所述蛋白质能够结合于转铁蛋白受体(TfR)，以提供具有减少的所述代谢物质积聚的校正的CNS细胞。

某些实施方案还提供了一种减少代谢物质在具有溶酶体酶缺乏的CNS细胞中的积聚的方法，所述方法包括使所述细胞与包含以下的蛋白质接触：(i)连接于所述溶酶体酶的第一Fc多肽；以及(ii)第二Fc多肽，其与所述第一Fc多肽形成Fc二聚体，其中所述蛋白质能够结合于转铁蛋白受体(TfR)。

在某些实施方案中，在体外、离体或体内使细胞与蛋白质接触。在某些实施方案中，在体外使细胞与蛋白质接触。在某些实施方案中，离体使细胞与蛋白质接触。在某些实施方案中，在体内使细胞与蛋白质接触(即，经由施用蛋白质)。在某些实施方案中，细胞来自于组织样品并且已经通过本文所述的方法分选。在某些实施方案中，在体内并且在分选之前使细胞与蛋白质接触。在某些其它实施方案中，在体外在分选之前或之后使细胞与蛋白质接触。

在某些实施方案中，连接于溶酶体酶的第一Fc多肽是本文所述的Fc多肽。在某些实施方案中，溶酶体酶是艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)，或野生型IDS、例如野生型人IDS的催化活性变体或片段。在某些实施方案中，第二Fc多肽是本文所述的多肽。在某些实施方案中，蛋白质是ETV:IDS。

在某些实施方案中，当在相同的亲和力测定条件下测定时，与无关靶标相比，蛋白质对TfR的亲和力为至少5倍、10倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更大。在某些实施方案中，蛋白质以约50nM至约350nM的亲和力结合于TfR。在某些实施方案中，蛋白质以约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM、约100nM、约110nM、约120nM、约130nM、约140nM、约150nM、约160nM、约170nM、约180nM、约190nM、约200nM、约210nM、约220nM、约230nM、约240nM、约250nM、约275nM、约300nM、约325nM或约350nM的亲和力结合于TfR。

在某些实施方案中，代谢物质是GAG物质，例如本文所述的GAG物质(例如D0S0、D0A0或D0a4)。在某些实施方案中，代谢物质是脂质物质，例如神经节苷脂、糖基神经酰胺(例如葡萄糖基神经酰胺)、半乳糖基神经酰胺和双(单酰基甘油)磷酸酯(BMP)物质(例如本文所述的物质)。在某些实施方案中，代谢物质是BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和/或GM3物质(例如如本文所述)。在某些实施方案中，代谢物质的组合的积聚减少，例如本文所述的脂质的组合。可以使用本领域中已知的方法对细胞中代谢物质的积聚的量进行定量。举例来说，可以使用液相色谱质谱(LCMS)测定法(参见例如实施例)定量代谢物质。

在某些实施方案中，细胞中至少一种代谢物质的积聚减少了至少约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在某些实施方案中，细胞中至少一种代谢物质的积聚减少至对照细胞(例如不包含溶酶体酶缺乏的对应细胞)中的水平。在某些实施方案中，多种代谢物质的积聚减少(例如2种或更多种代谢物质，例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、25种、50种或更多种)。

在某些实施方案中，CNS细胞选自由以下组成的组：神经元、星形胶质细胞以及小胶质细胞。在某些实施方案中，CNS细胞是神经元。在某些实施方案中，CNS细胞是星形胶质细胞。在某些实施方案中，CNS细胞是小胶质细胞。

某些实施方案

实施方案1.一种检测患有溶酶体贮积症(LSD)的受试者中的一种或多种生物标志物的方法，所述方法包括：

1)测量来自所述受试者的样品中的两种或更多种脂质的组合的浓度，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

a)双(单酰基甘油)磷酸酯(BMP)；

b)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

c)GD3神经节苷脂；

d)GD1a/b神经节苷脂；以及

e)葡萄糖基神经酰胺(GlcCer)；

2)测量来自所述受试者的样品中的GlcCer的浓度，条件是所述LSD是粘多糖贮积病(MPS)病症；

3)测量来自所述受试者的样品中的神经丝轻链(Nf-L)的浓度；和/或

4)测量来自所述受试者的样品中的在髓样细胞上表达的可溶性触发受体2(sTREM2)的浓度。

实施方案2.一种评估患有LSD的受试者中的治疗功效的方法，所述方法包括：

1)测量在施用所述治疗之后从所述受试者获得的样品中的两种或更多种脂质的组合的浓度，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

a)BMP；

b)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

c)GD3；

d)GD1a/b；以及

e)GlcCer；

2)测量在施用所述治疗之后从所述受试者获得的样品中的GlcCer的浓度，条件是所述LSD是MPS病症；

3)测量在施用所述治疗之后从所述受试者获得的样品中的Nf-L的浓度；和/或

4)测量在施用所述治疗之后从所述受试者获得的样品中的sTREM2的浓度；

其中与在施用所述治疗之前从所述受试者获得的样品中的所选脂质/蛋白质的浓度相比，在施用所述治疗之后从所述受试者获得的所述样品中的所述脂质/蛋白质的浓度下降与治疗功效相关。

实施方案3.一种鉴定患有LSD的受试者为治疗候选者的方法，所述方法包括：

1)测量来自所述受试者的样品中的两种或更多种脂质的组合的浓度，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

a)BMP；

b)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

c)GD3；

d)GD1a/b；以及

e)GlcCer；

2)测量来自所述受试者的样品中的GlcCer的浓度，条件是所述LSD是MPS病症；

3)测量来自所述受试者的样品中的Nf-L的浓度；和/或

4)测量来自所述受试者的样品中的sTREM2的浓度；

其中来自所述受试者的样品中的所选脂质/蛋白质的浓度至少与对照值一样高方可鉴定所述受试者为治疗候选者。

实施方案4.实施方案1-3中的任一项的方法，所述方法还包括向所述受试者施用LSD治疗。

实施方案5.实施方案1-4中的任一项的方法，所述方法还包括调整所述受试者的治疗方案。

实施方案6.一种治疗受试者的LSD的方法，所述方法包括：

1)向所述受试者施用LSD治疗；

2)测量以下的浓度：

a)来自所述受试者的样品中的两种或更多种脂质的组合，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

i)BMP；

ii)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

iii)GD3；

iv)GD1a/b；以及

v)GlcCer；

b)来自所述受试者的样品中的GlcCer，条件是所述LSD是MPS病症；

c)来自所述受试者的样品中的Nf-L；和/或

d)来自所述受试者的样品中的sTREM2；以及

3)基于与对照值相比来自所述受试者的所述样品中的所选脂质/蛋白质的浓度，调整所述LSD治疗的剂量。

实施方案7.实施方案1-6中的任一项的方法，所述方法包括测量sTREM2的浓度。

实施方案8.实施方案1-6中的任一项的方法，所述方法包括测量Nf-L的浓度。

实施方案9.实施方案1-6中的任一项的方法，所述方法包括测量GlcCer的浓度，其中所述LSD是MPS病症。

实施方案10.实施方案1-6中的任一项的方法，所述方法包括测量两种或更多种脂质的组合的浓度。

实施方案11.实施方案1-6中的任一项的方法，所述方法包括测量一种或多种脂质的浓度和sTREM2的浓度。

实施方案12.实施方案1-6中的任一项的方法，所述方法包括测量一种或多种脂质的浓度和Nf-L的浓度。

实施方案13.实施方案1-12中的任一项的方法，其中所述样品是组织样品、血清样品或脑脊髓液样品。

实施方案14.实施方案13的方法，其中所述样品是组织样品。

实施方案15.实施方案14的方法，其中所述组织是脑、肝、肾、肺或脾。

实施方案16.实施方案13的方法，其中所述样品是血清样品。

实施方案17.实施方案13的方法，其中所述样品是脑脊髓液样品。

实施方案18.一种治疗受试者的LSD的方法，所述方法包括向所述受试者施用LSD治疗，其中所述受试者具有或经确定具有：

1)与对照相比浓度增加的两种或更多种脂质的组合，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

a)BMP；

b)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

c)GD3；

d)GD1a/b；以及

e)GlcCer；

2)浓度增加的GlcCer，条件是所述LSD是MPS病症；

3)浓度增加的Nf-L；和/或

4)浓度增加的sTREM2。

实施方案19.实施方案18的方法，其中所述受试者具有或经确定具有浓度增加的sTREM2。

实施方案20.实施方案18的方法，其中所述受试者具有或经确定具有浓度增加的Nf-L。

实施方案21.实施方案18的方法，其中所述受试者具有或经确定具有浓度增加的GlcCer，并且其中所述LSD是MPS病症。

实施方案22.实施方案18的方法，其中所述受试者具有或经确定具有浓度增加的两种或更多种脂质的组合。

实施方案23.实施方案18的方法，其中所述受试者具有或经确定具有浓度增加的一种或多种脂质和浓度增加的sTREM2。

实施方案24.实施方案18的方法，其中所述受试者具有或经确定具有浓度增加的一种或多种脂质和浓度增加的Nf-L。

实施方案25.实施方案1-24中的任一项的方法，其中所述组合包含BMP。

实施方案26.实施方案1-25中的任一项的方法，其中所述组合包含GlcCer。

实施方案27.实施方案1-26中的任一项的方法，其中所述组合包含GD3。

实施方案28.实施方案1-27中的任一项的方法，其中所述组合包含GD1a/b。

实施方案29.实施方案1-28中的任一项的方法，其中所述组合包含GM2。

实施方案30.实施方案1-29中的任一项的方法，其中所述组合包含GM3。

实施方案31.实施方案1-24中的任一项的方法，其中所述组合包含：BMP和GlcCer；BMP和GD3；BMP和GD1a/b；BMP和GM2；BMP和GM3；GlcCer和GD3；GlcCer和GD1a/b；GlcCer和GM2；GlcCer和GM3；GD3和GD1a/b；GD3和GM2；GD3和GM3；GD1a/b和GM2；GD1a/b和GM3；BMP、GlcCer和GD3；BMP、GlcCer和GD1a/b；BMP、GlcCer和GM2；BMP、GlcCer和GM3；BMP、GD3和GD1a/b；BMP、GD3和GM2；BMP、GD3和GM3；BMP、GD1a/b和GM2；BMP、GD1a/b和GM3；BMP、GM2和GM3；GlcCer、GD3和GD1a/b；GlcCer、GD3和GM2；GlcCer、GD3和GM3；GlcCer、GD1a/b和GM2；GlcCer、GD1a/b和GM3；GlcCer、GM2和GM3；GD3、GD1a/b和GM2；GD3、GD1a/b和GM3；GD3、GM2和GM3；GD1a/b、GM2和GM3；BMP、GlcCer、GD3和GD1a/b；BMP、GlcCer、GD3和GM2；BMP、GlcCer、GD3和GM3；BMP、GlcCer、GD1a/b和GM2；BMP、GlcCer、GD1a/b和GM3；BMP、GlcCer、GM2和GM3；BMP、GD3、GD1a/b和GM2；BMP、GD3、GD1a/b和GM3；BMP、GD3、GM2和GM3；BMP、GD1a/b、GM2和GM3；GlcCer、GD3、GD1a/b和GM2；GlcCer、GD3、GD1a/b和GM3；GlcCer、GD3、GM2和GM3；GlcCer、GD1a/b、GM2和GM3；GD3、GD1a/b、GM2和GM3；BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b和GM2；BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b和GM3；BMP、GD3、GD1a/b、GM2和GM3；BMP、GlcCer、GD3、GM2和GM3；BMP、GlcCer、GD1a/b、GM2和GM3；GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3；或BMP、GlcCer、GD3、GD1/b、GM2和GM3。

实施方案32.实施方案1-24中的任一项的方法，其中所述组合包含：BMP和GlcCer；BMP和GD3；BMP和GD1a/b；BMP和GM2；BMP和GM3；GlcCer和GD3；GlcCer和GD1a/b；GlcCer和GM2；GlcCer和GM3；GD3和GD1a/b；GD3和GM2；GD3和GM3；GD1a/b和GM2；或GD1a/b和GM3。

实施方案33.实施方案1-24中的任一项的方法，其中所述组合包含：BMP、GlcCer和GD3；BMP、GlcCer和GD1a/b；BMP、GlcCer和GM2；BMP、GlcCer和GM3；BMP、GD3和GD1a/b；BMP、GD3和GM2；BMP、GD3和GM3；BMP、GD1a/b和GM2；BMP、GD1a/b和GM3；BMP、GM2和GM3；GlcCer、GD3和GD1a/b；GlcCer、GD3和GM2；GlcCer、GD3和GM3；GlcCer、GD1a/b和GM2；GlcCer、GD1a/b和GM3；GlcCer、GM2和GM3；GD3、GD1a/b和GM2；GD3、GD1a/b和GM3；GD3、GM2和GM3；或GD1a/b、GM2和GM3。

实施方案34.实施方案1-24中的任一项的方法，其中所述组合包含：BMP、GlcCer、GD3和GD1a/b；BMP、GlcCer、GD3和GM2；BMP、GlcCer、GD3和GM3；BMP、GlcCer、GD1a/b和GM2；BMP、GlcCer、GD1a/b和GM3；BMP、GlcCer、GM2和GM3；BMP、GD3、GD1a/b和GM2；BMP、GD3、GD1a/b和GM3；BMP、GD3、GM2和GM3；BMP、GD1a/b、GM2和GM3；GlcCer、GD3、GD1a/b和GM2；GlcCer、GD3、GD1a/b和GM3；GlcCer、GD3、GM2和GM3；GlcCer、GD1a/b、GM2和GM3；或GD3、GD1a/b、GM2和GM3。

实施方案35.实施方案1-24中的任一项的方法，其中所述组合包含：BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b和GM2；BMP、GlcCer、GD3、GD1a/b和GM3；BMP、GD3、GD1a/b、GM2和GM3；BMP、GlcCer、GD3、GM2和GM3；BMP、GlcCer、GD1a/b、GM2和GM3；或GlcCer、GD3、GD1a/b、GM2和GM3。

实施方案36.实施方案1-24中的任一项的方法，其中所述组合包含：BMP、GlcCer、GD3、GD1/b、GM2和GM3。

实施方案37.实施方案1-36中的任一项的方法，其中所述LSD是MPS病症。

实施方案38.实施方案37的方法，其中所述MPS病症是亨特综合征(Hunter’ssyndrome)。

实施方案39.实施方案2-38中的任一项的方法，其中所述LSD治疗包含造血干细胞移植(HSCT)、酶替代疗法(ERT)、底物减少疗法、伴侣疗法和/或基因疗法。

实施方案40.实施方案39的方法，其中所述LSD治疗包含ERT。

实施方案41.实施方案40的方法，其中所述ERT靶向脑。

实施方案42.实施方案40的方法，其中所述LSD治疗是包含以下的蛋白质：

(a)第一Fc多肽，其连接于酶替代疗法(ERT)酶、ERT酶变体或它们的催化活性片段；和

(b)第二Fc多肽，其与所述第一Fc多肽形成Fc二聚体，

其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽不包括免疫球蛋白重链和/或轻链可变区序列或它们的抗原结合部分。

实施方案43.实施方案42的方法，其中所述ERT酶是艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、IDS变体或它们的催化活性片段。

实施方案44.实施方案42的方法，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:113、193和197中的任一个的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:114。

实施方案45.实施方案42的方法，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:113、193和197中的任一个的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。

实施方案46.实施方案42的方法，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:113、193和197中的任一个的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列。

实施方案47.实施方案42的方法，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:113、193和197中的任一个的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列。

实施方案48.实施方案42的方法，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:113、193和197中的任一个的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列。

实施方案49.实施方案42的方法，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:113、193和197中的任一个的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列。

实施方案50.实施方案42的方法，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:113、193和197中的任一个的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。

实施方案51.实施方案42的方法，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:113、193和197中的任一个的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列。

实施方案52.实施方案42的方法，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:113、193和197中的任一个的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列。

实施方案53.实施方案42的方法，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:113、193和197中的任一个的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列。

实施方案54.一种针对作为LSD治疗的活性筛选测试剂的方法，所述方法包括：

1)使细胞与所述测试剂接触，其中所述细胞的溶酶体贮积受损；以及

2)测量以下的浓度：

a)所述细胞中的两种或更多种脂质的组合，其中所述脂质的组合选自由以下组成的组：

i)BMP；

ii)GM2神经节苷脂和/或GM3神经节苷脂；

iii)GD3；

iv)GD1a/b；以及

v)GlcCer；

b)所述细胞中的GlcCer，条件是针对作为MPS治疗的活性筛选所述测试剂；

c)所述细胞中的Nf-L；和/或

d)所述细胞中的sTREM2；

其中与对照细胞中的对应脂质/蛋白质的浓度相比，所述细胞中的所选脂质/蛋白质的浓度下降表明所述测试剂具有作为LSD治疗的活性。

实施方案55.实施方案54的方法，所述方法包括测量sTREM2的浓度。

实施方案56.实施方案54的方法，所述方法包括测量Nf-L的浓度。

实施方案57.实施方案54的方法，所述方法包括测量GlcCer的浓度。

实施方案58.实施方案54的方法，所述方法包括测量两种或更多种脂质的组合的浓度。

实施方案59.实施方案54的方法，所述方法包括测量一种或多种脂质的浓度和sTREM2的浓度。

实施方案60.实施方案54的方法，所述方法包括测量一种或多种脂质的浓度和Nf-L的浓度。

实施方案61.实施方案54-60中的任一项的方法，其中所述细胞是脑细胞。

实施方案62.一种校正的CNS细胞，所述CNS细胞包含引起所述细胞内代谢物质积聚的溶酶体酶缺乏，其中使所述细胞与包含以下的蛋白质接触：(i)第一Fc多肽，其连接于所述溶酶体酶，和(ii)第二Fc多肽，其与所述第一Fc多肽形成Fc二聚体，其中所述蛋白质能够结合于转铁蛋白受体(TfR)，并且其中所述校正是减少所述代谢物质的积聚。

实施方案63.一种校正的CNS细胞，所述CNS细胞包含减少的代谢物质的积聚，其中使包含引起所述细胞内所述代谢物质积聚的溶酶体酶缺乏的CNS细胞与包含以下的蛋白质接触：

(i)第一Fc多肽，其连接于所述溶酶体酶；以及

(ii)第二Fc多肽，其与所述第一Fc多肽形成Fc二聚体，其中所述蛋白质能够结合于转铁蛋白受体(TfR)，

以提供包含减少的所述代谢物质积聚的所述校正的CNS细胞。

实施方案64.实施方案62或63的CNS细胞，其中所述蛋白质以约50nM至约350nM的亲和力结合于TfR。

实施方案65.实施方案62-64中的任一项的CNS细胞，其中所述酶是艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)或它的催化活性变体。

实施方案66.实施方案62-65中的任一项的CNS细胞，其中所述代谢物质是糖胺聚糖(GAG)和/或溶酶体脂质。

实施方案67.实施方案62-65中的任一项的CNS细胞，其中所述代谢物质是糖胺聚糖(GAG)。

实施方案68.实施方案62-65中的任一项的CNS细胞，其中所述代谢物质是溶酶体脂质。

实施方案69.实施方案68的CNS细胞，其中所述溶酶体脂质选自由以下组成的组：神经节苷脂、葡萄糖基神经酰胺、半乳糖基神经酰胺和双(单酰基甘油)磷酸酯(BMP)。

实施方案70.实施方案62-69中的任一项的CNS细胞，其中所述CNS细胞选自由以下组成的组：神经元、星形胶质细胞以及小胶质细胞。

实施方案71.一种从组织样品中分选CNS细胞群体的方法，所述方法包括：

(a)使所述组织样品与神经元标志物一抗、星形胶质细胞标志物一抗、小胶质标志物一抗、内皮标志物一抗以及少突胶质细胞标志物一抗接触，其中每种一抗被独特地标记，以提供被标记的组织样品；以及

(b)通过流式细胞术对所述被标记的组织样品中的所述细胞进行分选，

其中所述方法提供神经元、星形胶质细胞以及小胶质细胞的独特细胞群体。

实施方案72.实施方案71的方法，其中所述神经元标志物一抗是抗Thy1抗体。

实施方案73.实施方案71或72的方法，其中所述小胶质标志物一抗是抗CD11b抗体。

实施方案74.实施方案71-73中的任一项的方法，其中所述星形胶质细胞标志物一抗选自由抗EAAT2抗体和抗星形胶质细胞表面抗原-2(ACSA-2)抗体组成的组。

实施方案75.实施方案71-74中的任一项的方法，其中所述内皮标志物一抗是抗CD31抗体。

实施方案76.实施方案71-75中的任一项的方法，其中所述少突胶质细胞标志物一抗是抗O1抗体。

实施方案77.实施方案71-76中的任一项的方法，所述方法还包括使所述组织样品与活性染料接触。

实施方案78.实施方案71-77中的任一项的方法，所述方法提供包含少于约20％非小胶质细胞的小胶质细胞的独特群体、包含少于约20％非星形胶质细胞的星形胶质细胞的独特群体和/或包含少于约20％非神经元细胞的神经元的独特群体。

实施方案79.实施方案78的方法，所述方法提供包含少于约20％非小胶质细胞的小胶质细胞的独特群体。

实施方案80.实施方案78或79的方法，所述方法提供包含少于约20％非星形胶质细胞的星形胶质细胞的独特群体。

实施方案81.实施方案78-80中的任一项的方法，所述方法提供包含少于约20％非神经元细胞的神经元的独特群体。

实施方案82.实施方案71-81中的任一项的方法，其中所述小胶质细胞群体基于标志物概况O1

实施方案83.实施方案82的方法，其中所述小胶质细胞群体基于标志物概况O1

实施方案84.实施方案82或83的方法，其中所述星形胶质细胞群体基于标志物概况O1

实施方案85.实施方案82-84中的任一项的方法，其中所述神经元群体基于标志物概况O1

实施方案86.实施方案71-85中的任一项的方法，其中分析所富集的细胞群体以定量sTREM2、Nf-L、代谢物质和/或核酸物质。

实施方案87.实施方案71-85中的任一项的方法，其中分析所富集的细胞群体以定量代谢物质或核酸物质。

实施方案88.实施方案87的方法，其中所述代谢物质是糖胺聚糖(GAG)物质。

实施方案89.实施方案87的方法，其中所述代谢物质是脂质物质。

实施方案90.实施方案89的方法，其中所述脂质物质选自由以下组成的组：神经节苷脂、葡萄糖基神经酰胺、半乳糖基神经酰胺和双(单酰基甘油)磷酸酯(BMP)。

实施方案91.实施方案87的方法，其中所述核酸物质选自RNA、DNA和基因组DNA。

实施方案92.实施方案71-91中的任一项的方法，其中分析所富集的细胞群体以定量sTREM2。

实施方案93.实施方案71-92中的任一项的方法，其中分析所富集的细胞群体以定量Nf-L。

实施方案94.实施方案71-93中的任一项的方法，其中分析所富集的细胞群体以定量施用的治疗剂。

实施方案95.实施方案94的方法，其中所述施用的治疗剂是ETV:IDS。

某些定义

术语“对照”或“对照样品”是指适合于所采用的检测技术的任何样品。对照样品可以含有所采用的检测技术的产品或要测试的材料。此外，对照可以是阳性或阴性对照。

如本文中可互换使用的术语“受试者”、“个体”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物(例如大鼠、小鼠和豚鼠)、兔子、母牛、猪、马和其它哺乳动物物种。在一个实施方案中，受试者是人。

术语“药学上可接受的赋形剂”是指在生物学或药理学上适宜用于人或动物的非活性药物成分，例如但不限于缓冲剂、载体或防腐剂。

术语“施用”是指将剂(例如LSD治疗剂，例如本文所述的ETV疗法)、化合物或组合物(例如药物组合物)递送至所需的生物作用部位的方法。这些方法包括但不限于口服、局部递送、肠胃外递送、静脉内递送、皮内递送、肌内递送、鞘内递送、结肠递送、直肠递送或腹膜内递送。在一个实施方案中，本文所述的多肽是静脉内施用的。

如本文所用的“治疗(treatment)”(和其语法变形如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指改变被治疗的个体的自然进程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学过程期间进行。理想的治疗效果包括但不限于：防止疾病的发生或复发、缓解症状、减小疾病的任何直接或间接的病理学后果、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。

短语“有效量”意指本文所述的化合物实现以下的量：(i)治疗或预防特定的疾病、疾患或病症；(ii)减轻、改善或消除特定的疾病、疾患或病症的一种或多种症状；或(iii)预防或延迟本文所述的特定的疾病、疾患或病症的一种或多种症状的发作。

本文所公开的物质/分子的“治疗有效量”可能会根据各种因素而变化，例如疾病状态、个体的年龄、性别和体重以及该物质/分子在个体中引起期望的反应的能力。治疗有效量涵盖使治疗有益作用远远超过物质/分子的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”是指在必需的剂量下和必需的时间段内能有效获得所需的预防结果的量。通常但不一定，因为预防剂量是在疾病之前或疾病的较早阶段在受试者中使用，所以预防有效量将小于治疗有效量。

术语“从患者获得样品”、“从患者获得”和类似的措词用于指直接从患者获得样品，以及通过中间人间接从患者获得样品(例如，从快递员那里获取样品，而快递员是从护士那里获取样品的，护士则是从患者那里获取样品的)。

“酶替代疗法酶”或“ERT酶”是指在溶酶体贮积症中缺乏的酶。“ERT酶变体”是指野生型ERT酶或其片段的功能变体，包括等位基因和剪接变体，其中例如在相同条件下测定时，ERT酶变体具有它的相应野生型ERT酶或其片段的活性的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。ERT酶的“催化活性片段”是指全长ERT酶或其变体的一部分，其中例如在相同条件下测定时，催化活性片段具有相应全长ERT酶或其变体的活性的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

如本文所用的“艾杜糖醛酸硫酸酯酶”、“艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶”或“IDS”是指艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(EC 3.1.6.13)，它是参与糖胺聚糖硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素的溶酶体降解的酶。IDS缺乏与粘多糖贮积病II(也称为亨特综合征)有关。如本文所用的作为包含Fc多肽的蛋白质的组分的术语“IDS”具有催化活性，并且涵盖野生型IDS或其片段的功能性变体，包括等位基因和剪接变体。人IDS同工型I的序列，即被指定为规范序列的人序列，可在UniProt条目P22304下获得，并由位于Xq28的人IDS基因编码。全长序列作为SEQ IDNO:91提供。如本文所用，“成熟的”IDS序列是指缺少天然存在的全长多肽链的信号和前肽序列的多肽链形式。成熟的人IDS多肽的氨基酸序列作为SEQ ID NO:92提供，其对应于全长人序列的氨基酸34-550。如本文所用，“截短的”IDS序列是指天然存在的全长多肽链的催化活性片段。示例性的截短的人IDS多肽的氨基酸序列作为SEQ ID NO:112提供，其对应于全长人序列的氨基酸26-550。人IDS的结构已被很好地表征。例示性结构可在PDB登录号5FQL下获得。该结构也描述在Nat.Comm.8:15786doi:10.1038/ncomms15786,2017中。还已经描述了非人灵长类动物IDS序列，包括黑猩猩(UniProt条目K7BKV4)和恒河猴(UniProt条目H9FTX2)。小鼠IDS序列可在Uniprot条目Q08890下获得。例如在相同条件下测定时，IDS变体具有相应野生型IDS或其片段的活性的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。例如在相同条件下测定时，催化活性IDS片段具有相应全长IDS或其变体的活性的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

如本文所用的“转铁蛋白受体”或“TfR”是指转铁蛋白受体蛋白1。人转铁蛋白受体1多肽序列如SEQ ID NO:94中所示。来自其它物种的转铁蛋白受体蛋白1序列也是已知的(例如黑猩猩，登录号XP_003310238.1；恒河猴，NP_001244232.1；狗，NP_001003111.1；牛，NP_001193506.1；小鼠，NP_035768.1；大鼠，NP_073203.1；和鸡NP_990587.1)。术语“转铁蛋白受体”还涵盖示例性参考序列，例如人序列的等位基因变体，其由在转铁蛋白受体蛋白1的染色体位点处的基因编码。全长转铁蛋白受体蛋白包括短的N端胞内区、跨膜区和大的胞外结构域。胞外结构域的特征在于三个结构域：蛋白酶样结构域、螺旋结构域和顶端结构域。人转铁蛋白受体1的顶端结构域序列如SEQ ID NO:200所示。

如本文所用的“融合蛋白”或“[ERT酶]-Fc融合蛋白”是指一种二聚蛋白，它包含与ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段连接(例如融合)的第一Fc多肽(即，“[ERT]-Fc融合多肽”)；及与第一Fc多肽形成Fc二聚体的第二Fc多肽。第二Fc多肽也可以与ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段连接(例如融合)。第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可以通过肽键或通过多肽接头与ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段连接。第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可以是含有一个或多个促进与另一Fc多肽的异二聚的修饰的修饰Fc多肽。第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可以是含有一个或多个赋予与转铁蛋白受体结合的修饰的修饰Fc多肽。第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可以是含有一个或多个减少效应功能的修饰的修饰Fc多肽。第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可以是含有一个或多个延长血清半衰期的修饰的修饰Fc多肽。

如本文所用的“融合多肽”或“[ERT酶]-Fc融合多肽”是指与ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段连接(例如融合)的Fc多肽。Fc多肽可以通过肽键或通过多肽接头与ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段连接。Fc多肽可以是含有一个或多个促进与另一Fc多肽的异二聚的修饰的修饰Fc多肽。Fc多肽可以是含有一个或多个赋予与转铁蛋白受体结合的修饰的修饰Fc多肽。Fc多肽可以是含有一个或多个减少效应功能的修饰的修饰Fc多肽。Fc多肽可以是含有一个或多个延长血清半衰期的修饰的修饰Fc多肽。

如本文所用，术语“Fc多肽”是指天然存在的免疫球蛋白重链多肽的C端区域，其特征在于Ig折叠为结构域。Fc多肽含有至少包括CH2结构域和/或CH3结构域的恒定区序列，并且可以含有铰链区的至少一部分。通常，Fc多肽不含可变区。

“修饰Fc多肽”是指与野生型免疫球蛋白重链Fc多肽序列相比具有至少一个突变(例如取代、缺失或插入)，但保留天然Fc多肽的总Ig折叠或结构的Fc多肽。

术语“FcRn”是指新生儿Fc受体。Fc多肽与FcRn的结合降低Fc多肽的清除率并增加其血清半衰期。人FcRn蛋白是一种异二聚体，由大小约为50kDa的类似于主要组织相容性(MHC)I类蛋白的蛋白质和大小约为15kDa的β2-微球蛋白构成。

如本文所用，“FcRn结合位点”是指Fc多肽的与FcRn结合的区域。在人IgG中，如使用EU索引编号，FcRn结合位点包括T250、L251、M252、I253、S254、R255、T256、T307、E380、M428、H433、N434、H435和Y436。这些位置对应于SEQ ID NO:1的位置20至26、77、150、198和203至206。

如本文所用，“天然FcRn结合位点”是指与FcRn结合，并且氨基酸序列与天然存在的Fc多肽的结合于FcRn的区域相同的Fc多肽的区域。

如本文所用的术语“CH3结构域”和“CH2结构域”是指免疫球蛋白恒定区结构域多肽。为了本申请的目的，CH3结构域多肽是指如根据EU编号从约位置341到约位置447的氨基酸区段，并且CH2结构域多肽是指如根据EU编号方案编号从约位置231到约位置340并且不包括铰链区序列的氨基酸区段。CH2和CH3结构域多肽也可以通过IMGT(ImMunoGeneTics)编号方案编号，其中根据IMGT Scientific chart编号(IMGT网站)，CH2结构域编号为1-110，并且CH3结构域编号为1-107。CH2和CH3结构域是免疫球蛋白Fc区的一部分。Fc区是指如根据EU编号方案编号的从约位置231到约位置447的氨基酸区段，但是如本文所用，可以包括抗体的铰链区的至少一部分。一种例示性铰链区序列是人IgG1铰链序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:93)。

“天然存在”、“天然”或“野生型”用于描述可以在自然界发现的与人工产生不同的物体。例如，可以从自然界中的来源分离并且不在实验室中有意修饰的存在于生物体(包括病毒)中的核苷酸序列是天然存在的。此外，“野生型”是指在自然界中发现的没有任何已知突变的正常基因或生物体。例如，关于CH3或CH2结构域的术语“野生型”、“天然”和“天然存在”在本文中用于指具有天然存在的序列的结构域。

如本文所用，关于突变体多肽或突变体多核苷酸的术语“突变体”与“变体”可互换使用。关于给定的野生型CH3或CH2结构域参考序列的变体可以包括天然存在的等位基因变体。“非天然”存在的CH3或CH2结构域是指在自然界中的细胞中不存在，并且通过对天然CH3结构域或CH2结构域多核苷酸或多肽的遗传修饰(例如使用基因工程技术或诱变技术)而产生的变异或突变结构域。“变体”包括相对于野生型包含至少一个氨基酸突变的任何结构域。突变可包括取代、插入和缺失。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。

天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后期修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即，α-碳结合于氢、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指结构与氨基酸的一般化学结构不同，但作用方式类似于天然存在的氨基酸的化合物。

天然存在的α-氨基酸包括但不限于丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、蛋氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和它们的组合。天然存在的α-氨基酸的立体异构体包括但不限于D-丙氨酸(D-Ala)、D-半胱氨酸(D-Cys)、D-天冬氨酸(D-Asp)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-组氨酸(D-His)、D-异亮氨酸(D-Ile)、D-精氨酸(D-Arg)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-蛋氨酸(D-Met)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-谷氨酰胺(D-Gln)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-苏氨酸(D-Thr)、D-缬氨酸(D-Val)、D-色氨酸(D-Trp)、D-酪氨酸(D-Tyr)和它们的组合。

氨基酸在本文中可以由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。

术语“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，是指呈单链的氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸聚合物可包含完全L-氨基酸、完全D-氨基酸或L与D氨基酸的混合物。

如本文所用的术语“蛋白质”是指多肽或单链多肽的二聚体(即，两个)或多聚体(即，三个或更多个)。蛋白质的单链多肽可以通过共价键，例如二硫键或非共价相互作用接合。

术语“保守取代”、“保守突变”或“保守修饰的变体”是指导致氨基酸被另一种可以被分类为具有相似的特征的氨基酸取代的改变。以这种方式定义的保守氨基酸组的类别的实例可以包括：“带电荷/极性组”，包括Glu(谷氨酸或E)、Asp(天冬氨酸或D)、Asn(天冬酰胺或N)、Gln(谷氨酰胺或Q)、Lys(赖氨酸或K)、Arg(精氨酸或R)和His(组氨酸或H)；“芳香族组”，包括Phe(苯丙氨酸或F)、Tyr(酪氨酸或Y)、Trp(色氨酸或W)和(组氨酸或H)；和“脂肪族组”，包括Gly(甘氨酸或G)、Ala(丙氨酸或A)、Val(缬氨酸或V)、Leu(亮氨酸或L)、Ile(异亮氨酸或I)、Met(蛋氨酸或M)、Ser(丝氨酸或S)、Thr(苏氨酸或T)和Cys(半胱氨酸或C)。在每个组中，也可以标识亚组。例如，带电荷或极性氨基酸的组可以细分为亚组，包括：包含Lys、Arg和His的“带正电荷的亚组”；包含Glu和Asp的“带负电荷的亚组”；以及包含Asn和Gln的“极性亚组”。在另一个实例中，芳香族或环状组可以细分为亚组，包括：包含Pro、His和Trp的“氮环亚组”；以及包含Phe和Tyr的“苯基亚组”。在另一个实例中，脂肪族组可以细分为亚组，例如包含Val、Leu、Gly和Ala的“脂肪族非极性亚组”；以及包含Met、Ser、Thr和Cys的“脂肪族弱极性亚组”。保守突变的类别的实例包括上述亚组内的氨基酸的氨基酸取代，例如但不限于：Lys取代Arg，反之亦然，因此可以保持正电荷；Glu取代Asp，反之亦然，因此可以保持负电荷；Ser取代Thr，反之亦然，因此可以保持游离的-OH；以及Gln取代Asn，反之亦然，因此可以保持游离的-NH

在两个或更多个多肽序列的上下文中，术语“同一性”或“同一性百分比”是指如使用序列比较算法或通过手工比对和目测所测量，两个或更多个序列或子序列在比较窗口或指定区域上为了最大对应性进行比较和比对时在特定区域上是相同的或具有特定百分比的相同氨基酸残基(例如，至少60％同一性、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或更大)。

为了进行多肽的序列比较，通常一个氨基酸序列用作参考序列，候选序列与之进行比较。比对可以使用本领域的技术人员可利用的各种方法，例如视觉比对或使用公开可用的软件使用已知算法来进行以实现最大比对。这样的程序包括BLAST程序、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,Calif.)或Megalign(DNASTAR)。用于比对以实现最大比对的参数可以由本领域的技术人员来确定。出于本申请的目的，为了进行多肽序列的序列比较，使用BLASTP算法标准蛋白BLAST以默认参数，将两个蛋白质序列进行比对。

当在鉴定多肽序列中所给定的氨基酸残基的上下文中使用时，术语“对应于”、“参考……确定”或“参考...编号”是指当将所给定的氨基酸序列与参考序列最大程度地比对和比较时，指定参考序列的残基的位置。因此，例如，当与SEQ ID NO:1最佳比对时在修饰Fc多肽中的氨基酸残基与SEQ ID NO:1中的氨基酸比对时，该残基“对应于”SEQ ID NO:1中的氨基酸。与参考序列比对的多肽不必是与参考序列长度相同。

术语“多核苷酸”和“核酸”可互换，是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶掺入链中的任何底物。多核苷酸可以包含修饰核苷酸，例如甲基化核苷酸和其类似物。本文考虑的多核苷酸的实例包括单链和双链DNA、单链和双链RNA、以及具有单链和双链DNA与RNA的混合物的杂混分子。

如本文所用的“结合亲和力”是指两个分子之间的非共价相互作用的强度，例如，多肽上的单个结合位点与其结合的靶标，例如转铁蛋白受体。因此，例如，除非另有指示或从上下文中清楚，否则该术语可以指多肽与其靶标之间的1:1相互作用。结合亲和力可以通过测量平衡解离常数(K

如本文所用的术语“特异性结合”或“选择性结合”于靶标如TfR在提及如本文所述的工程化的TfR结合多肽、TfR结合肽或TfR结合抗体时是指一种结合反应，其中工程化的TfR结合多肽、TfR结合肽或TfR结合抗体以比其与结构不同的靶标结合更大的亲和力、更大的亲合力和/或更长的持续时间与靶标结合。在典型的实施方案中，当在相同的亲和力测定条件下进行测定时，工程化的TfR结合多肽、TfR结合肽或TfR结合抗体对特定靶标(如TfR)的亲和力比不相关的靶标大至少5倍、10倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更大。如本文所用的术语“特异性结合”、“特异性结合于”特定靶标(如TfR)或“对特定靶标(如TfR)具有特异性”可以例如由对所结合的靶标的平衡解离常数K

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中衍生自种系可变(V)基因、多样性(D)基因或连接(J)基因(而非衍生自恒定(Cμ和Cδ)基因区段)，并赋予抗体与抗原结合的特异性的结构域。通常，抗体可变区包括四个保守的“构架”区，其间散布着三个高变的“互补决定区”。

术语“抗原结合部分”和“抗原结合片段”在本文可互换使用，并且是指抗体的一个或多个片段，其保留通过其可变区特异性结合抗原的能力。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab片段(由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段)、F(ab')

以下实施例意图是非限制性的。

实施例1：外周施用ETV:IDS对IDS KO×TfR

如下所述，研究外周施用ETV:IDS对IDS KO×TfR

材料与方法

动物护理

小鼠被圈养在12小时亮/暗循环下并随意取用水和标准啮齿动物饮食(

小鼠品系

从The Jackson Laboratories(JAX品系024744)获得先前描述的B6N背景的IDSKO小鼠。先前已经描述了带有敲入小鼠受体中的人TfR顶端结构域的TfR

施用和组织收集

向2月龄的IDS KO×TfR

为了收集最终样品，通过腹膜内(i.p.)注射2.5％的Avertin对动物进行深度麻醉。为了收集CSF，在动物头骨的后部做矢状切开，分离皮下组织和肌肉以暴露枕大池，并使用预拉的玻璃毛细管刺穿枕大池以收集CSF。将CSF转移至低蛋白LoBind Eppendorf管中，并在4℃下以12,700rpm离心10分钟。将CSF转移至新的管中，并在干冰上速冻。通过测量样品在420nm下的吸光度，可以确认小鼠CSF中没有血液污染。通过心脏穿刺收集血液以收集血清。为了收集血清，使血液在室温下凝结至少30分钟。然后将管在4℃下以12,700rpm离心7分钟。将血清转移至新的管中，并在干冰上速冻。使用蠕动泵(Gilson公司MinipulsEvolution)用冰冷的PBS对动物经心灌注。解剖脑和肝脏，并在干冰上速冻。

组织制备：GAG提取和加工

如上所述收集脑和肝组织样品以及CSF。使用来自Qiagen的TissueLyser将脑和肝组织均质化。然后将组织匀浆转移至96孔深板中，并使用96尖端超声波仪(Q Sonica)进行超声处理。进行BCA蛋白测定以定量总蛋白，并且使每个样品20μg肝脏和100μg脑进行LC-MS/MS样品制备。对于CSF，每个样品使用3μL。简单地说，硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素衍生的二糖是通过使用肝素酶I、II、III和软骨素酶B的组合消化组织匀浆而产生的。将消化液与乙腈混合，然后进行如下所述的LC-MS/MS。

GAG的LCMS测定

通过将液相色谱法(Shimadzu Nexera X2系统，Shimadzu ScientificInstrument,Columbia,MD,USA)与电喷雾质谱法(Sciex QTRAP 6500+,Sciex,Framingham,MA,USA)相结合来执行GAG定量。对于每次分析，使用0.55毫升/分钟的流速将样品注入ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7mm 2.1×150mm柱(Waters公司)，柱温为55℃。流动相A和B分别由含10mM甲酸铵和0.1％甲酸的水和含0.1％甲酸的乙腈组成。梯度编程如下：在0.0-0.5分钟，80％B；0.5-3.5分钟，80％B至50％B；3.5-4.0分钟，50％B至80％B；保持在80％B下4.0-4.5分钟。采用以下设定，以负离子模式进行电喷雾电离：25的帘气；碰撞气体设定为中等；离子喷雾电压为-4500；温度在600℃下；离子源气体1在50下；离子源气体2在60下。使用Analyst 1.6.3(Sciex)以多反应监测模式(MRM)进行数据采集，每种物质的停留时间为50(毫秒)。碰撞能量(CE)设定为-30；去簇电位(DP)为-80；进入电位(EP)为-10；碰撞池出口电位(CXP)为-10。使用以下MRM转换将GAG检测为[M-H]-：D0A0在m/z 378.1>87.0下；D0S0在m/z 416.1>138.0下；D0a4在m/z 458.1>300.0下；D4UA-2S-GlcNCOEt-6S(Iduron有限公司,Manchester,UK)在m/z 472.0(源片段离子)>97.0下用作内标。使用市售参考标准品(Iduron有限公司)，根据个别二糖物质的保留时间和MRM转换来鉴定个别二糖物质。使用MultiQuant 3.0.2(Sciex)通过D0A0、D0S0和D0a4与内标的峰面积比对GAG进行定量。将报告的GAG量归一化为总蛋白水平，如通过BCA测定法(Pierce)测得。

组织制备：从脑组织中提取脂质

将冷冻的脑组织(20±2mg)转移至干冰2mL的Safe-Lock Eppendorf管(Eppendorf目录号022600044)中并放在装有5mm不锈钢珠(QIAGEN目录号69989)和含有内标的400μlMS级甲醇的干冰中。将组织用Tissuelyser在25Hz下(在冷室中)均质化30秒。然后将样品在4℃下以21,000×g离心20分钟。将甲醇上清液转移至新的eppendorf小瓶中，并在-20℃下放置1小时以允许蛋白质进一步沉淀。然后将样品在4℃下以21,000×g离心10分钟。将200uL的甲醇上清液转移至LCMS 96孔板中，并在氮气下干燥，然后重悬于100uL的具有5mM甲酸铵和0.5％甲酸的ACN/IPA/H2O(92.5/5/2.5)中以用于GlcCer分析。在不干扰团粒的情况下将其余的上清液转移至单独的LCMS 96孔板中，以分析BMP和神经节苷脂物质。样品可以直接在LCMS上运行，或储存在-80℃下。

BMP和神经节苷脂的LCMS测定

通过将液相色谱法(Shimadzu Nexera X2系统，Shimadzu ScientificInstrument,Columbia,MD,USA)与电喷雾质谱法(Sciex QTRAP 6500+,Sciex,Framingham,MA,USA)相结合来执行BMP和神经节苷脂分析。对于每次分析，在55℃下使用0.25mL/min的流速将5μL样品注入BEH C18 1.7μm 2.1×100mm柱(Waters公司,Milford,Massachusetts,USA)上。流动相A由含10mM醋酸铵的60:40乙腈/水(v/v)组成，流动相B由含10mM醋酸铵的90:10异丙醇/乙腈(v/v)组成。梯度编程如下：0.0-0.01分钟，45％B至99％B；0.1-3.0分钟，99％B；3.0-3.01分钟，至45％B；以及3.01-3.50分钟，在45％B下。采用以下设定，以负离子模式执行电喷雾电离：帘气为30；碰撞气体设定为中等；离子喷雾电压为-4500；温度为600℃；离子源气体1为50；离子源气体2为60。使用Analyst 1.6.3(Sciex)以多反应监测模式(MRM)进行数据采集，参数如下：表A中报告的每种物质的停留时间(毫秒)，碰撞能量(CE)为-50，去簇电位(DP)为-80；进入电位(EP)为-10；以及碰撞池出口(CXP)电位为-15。使用非内源性内标BMP di14:0和GM3(d36:1(d5))对BMP和神经节苷脂物质进行定量。使用MultiQuant 3.02(Sciex)执行定量。将BMP和神经节苷脂浓度相对于总蛋白量、组织重量或体积归一化。使用二辛可宁酸(BCA)测定法(Pierce,Rockford,IL,USA)测量蛋白质浓度。

表A.BMP和神经节苷脂测定的采集参数信息。

GlcCer和GalCer的LCMS测定

通过将液相色谱法(Shimadzu Nexera X2系统，Shimadzu ScientificInstrument,Columbia,MD,USA)与电喷雾质谱法(Sciex QTRAP 6500+Sciex,Framingham,MA,USA)相结合来执行葡萄糖基神经酰胺和半乳糖基神经酰胺分析。对于每次分析，在45℃下使用0.45mL/min的流速将10μL样品注入HALO HILIC 2.0μm 3.0×150mm柱(AdvancedMaterials Technology,PN 91813-701)上。流动相A由含5mM甲酸铵和0.5％甲酸的92.5/5/2.5ACN/IPA/H2O组成。流动相B由含5mM甲酸铵和0.5％甲酸的92.5/5/2.5H2O/IPA/ACN组成。梯度编程如下：0.0-3.1分钟，100％B；3.2分钟，95％B；5.7分钟，85％B；保持至7.1分钟，85％B；7.25分钟降至0％B并保持至8.75分钟；10.65分钟升回至100％并保持至11分钟。采用以下设定，以正离子模式执行电喷雾电离：帘气为25；碰撞气体设定为中等；离子喷雾电压为5500；温度为350℃；离子源气体1为55；离子源气体2为60。使用Analyst 1.6(Sciex)以多反应监测模式(MRM)进行数据采集，参数如下：表B中报告的每种物质的停留时间(毫秒)和碰撞能量(CE)；去簇电位(DP)为45；进入电位(EP)为10；以及碰撞池出口电位(CXP)为12.5。使用如表B中报告的同位素标记的内标的混合物对脂质进行定量。根据葡萄糖基神经酰胺和半乳糖基神经酰胺的保留时间和市售参考标准品(Avanti Polar Lipids,Birmingham,AL,USA)的MRM特性鉴定葡萄糖基神经酰胺和半乳糖基神经酰胺。使用MultiQuant 3.02(Sciex)执行定量。将代谢物相对于总蛋白量、组织重量或体积归一化。

表B：GlcCer和GalCer测定的采集参数信息。

类花生酸的质谱分析

通过将液相色谱法(Shimadzu Nexera X2系统,Shimadzu ScientificInstrument,Columbia,MD,USA)与电喷雾质谱法(Sciex QTRAP 6500+,Sciex,Framingham,MA,USA)相结合来执行类花生酸分析。对于每次分析，在40℃下使用0.6mL/min的流速将5μL样品注入BEH C18 1.7μm 2.1×100mm柱(Waters公司,Milford,Massachusetts,USA)上。流动相如下构成：A＝水+0.1％乙酸，和B＝90:10乙腈/异丙醇(v/v)。梯度编程如下：0.0-1.0分钟，25％B；1.0-8.5分钟至95％B；8.50-8.51分钟，95％B；8.51-10.00分钟，25％B。采用以下设定，以负离子模式执行电喷雾电离：帘气为30；碰撞气体设定为中等；离子喷雾电压为-4500；温度为600℃；离子源气体1为50；离子源气体2为60。使用Analyst 1.6.3(Sciex)以多反应监测模式(MRM)进行数据采集，参数如下：表C中报告的每种物质的停留时间(毫秒)、碰撞能量(CE)和去簇电位(DP)；进入电位(EP)为-10；以及碰撞池出口电位(CXP)为-12。使用如表C中报告的非内源性氘化内标的混合物对类花生酸进行定量。根据类花生酸的保留时间和市售参考标准品(Avanti Polar Lipids,Birmingham,AL,USA)的MRM特性鉴定类花生酸。使用MultiQuant3.02(Sciex)和Skyline执行定量。将代谢物相对于总蛋白量、组织重量或体积归一化。使用二辛可宁酸(BCA)测定法(Pierce,Rockford,IL,USA)测量蛋白质浓度。

表C.类花生酸测定的采集参数信息。

脂质组学分析

通过将液相色谱法(Shimadzu Nexera X2系统，Shimadzu ScientificInstrument,Columbia,MD,USA)与电喷雾质谱法(QTRAP 6500+,Sciex,Framingham,MA,USA)相结合来执行脂质分析。对于每次分析，在55℃下使用0.25mL/min的流速将5μL样品注入BEH C18 1.7μm 2.1×100mm柱(Waters公司,Milford,Massachusetts,USA)上。对于正电离模式，流动相A由含10mM甲酸铵+0.1％甲酸的60:40乙腈/水(v/v)组成；流动相B由含10mM甲酸铵+0.1％甲酸的90:10异丙醇/乙腈(v/v)组成。对于负电离模式，流动相A由含10mM醋酸铵的60:40乙腈/水(v/v)组成；流动相B由含10mM醋酸铵的90:10异丙醇/乙腈(v/v)组成。梯度编程如下：0.0-8.0分钟，45％B至99％B；8.0-9.0分钟，99％B；9.0-9.1分钟，至45％B；以及9.1-10.0分钟，45％B。采用以下设定，以正离子或负离子模式执行电喷雾电离：帘气为30；碰撞气体设定为中等；离子喷雾电压为5500(正模式)或4500(负模式)；温度为250℃(正模式)或600℃(负模式)；离子源气体1为50；离子源气体2为60。使用Analyst 1.6.3(Sciex)以多反应监测模式(MRM)进行数据采集，参数如下：表D(负模式)或表E(正模式)中报告的每种物质的停留时间(毫秒)和碰撞能量(CE)；去簇电位(DP)为80(正模式)和-80(负模式)；进入电位(EP)为10(正模式)或-10(负模式)；以及碰撞池出口电位(CXP)为12.5(正模式)或-12.5(负模式)。使用如表D和E中报告的非内源性内标的混合物对脂质进行定量。根据脂质的保留时间和市售参考标准品(Avanti Polar Lipids,Birmingham,AL,USA)的MRM特性鉴定脂质。使用MultiQuant 3.02(Sciex)执行定量。将代谢物相对于总蛋白量或细胞数目归一化。

表D.负模式下脂质组学测定的采集参数信息。

表E.正模式下脂质组学测定的采集参数信息。

ETV:IDS脑组织的均质化以及ETV:IDS脑组织和CSF的Trem2分析

使用Qiagen TissueLyzer II(目录号/ID：85300)将50mg组织在500μL用完全蛋白酶抑制剂(Roche#04693132001)和PhosStop(Roche04906837001)制成的1X CST缓冲液(Cell Signaling Technology 9803S)中在30Hz下均质化，进行2轮3分钟。将匀浆在冰上孵育20分钟，并在4℃下以21,100g旋转30分钟。随后将裂解液转移至干净的96孔深板中，并进行BCA以定量总蛋白量。将样品储存在-80℃直至测定使用。

为了在脑组织中进行Trem2分析并在CSF中进行可溶性Trem2(sTrem2)分析，通过在4℃下用1ug/mL生物素化绵羊抗小鼠抗体(R&D Systems BAF1729)包被过夜，制备MSDGOLD 96w小斑点链霉亲和素板(MSD L45SA)用于Trem2测定。次日，将MSD板用含triton的tris缓冲盐水(TBST)冲洗，并使用含3％牛血清白蛋白的TBST封闭两小时，同时以600rpm震荡。再次用TBST冲洗MSD板，并将脑裂解液在封闭溶液中稀释5倍，然后加入到MSD板中，以600rpm的速度孵育1小时。在下一次TBST冲洗之后，将磺基标记的绵羊抗小鼠抗体(R&DSystems AF1729)加入到板中，并再次以600rpm孵育1小时，并进行最后冲洗，然后加入在水中稀释的2X MSD读取缓冲液。然后使用MSD Meso Sector S600读取板。将Trem2信号相对于蛋白质浓度归一化，并用GraphPad Prism作图。

缩写

BMP＝双(单酰基甘油)磷酸酯；ETV:IDS＝酶转运载体:艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶；GlcCer＝葡萄糖基神经酰胺；GalCer＝半乳糖基神经酰胺；IDS＝艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶；KI＝敲入；KO＝敲除；TfR

结果

要确定在脑中观察到的强烈的GAG降低是否转化为对下游疾病相关病理的校正，评估ETV:IDS校正次级溶酶体贮积的能力。每周一次持续四周向IDS KO；TfR

具体地说，图5A-5B显示了ETV:IDS的外周施用(4周处理)校正了IDS KO小鼠中的(图5A)脑和(图5B)CSF GAG积聚。与活性等效剂量的Elaprase下降低14％相比，外周施用ETV:IDS时，脑GAG降低了58％。此外，与活性等效剂量的Elaprase下降低27％相比，外周施用ETV:IDS时，观察到CSF GAG降低了66％(ETV:IDS组的一个离群值略去)。图14A-14B示出了脑和CSF中单个GAG物质(D00S0、D00A0、D00a4)的降低。在一项后续研究中，ETV:IDS剂量为40mg/kg时，CSF GAG较WT减少了三倍。

图6显示了ETV:IDS的外周施用(4周处理)校正了IDS KO脑中的溶酶体脂质(神经节苷脂)积聚。

图7A-7B显示了ETV:IDS的外周施用(4周处理)校正了IDS KO脑中的溶酶体脂质(GlcCer)积聚。在外周施用ETV:IDS下观察到对脑GlcCer积聚的校正，而未观察到半乳糖基神经酰胺(GalCer)的变化。

图8显示了ETV:IDS的外周施用(4周处理)校正了IDS KO脑中的溶酶体脂质(BMP)积聚。

图9显示了示出用媒介物、ETV:IDS或Elaprase(艾杜硫酶)处理的IDS KO小鼠的脑中的脂质水平的热图。此热图是使用表2的修改后的数据生成的。具体来说，使用截止值对表2中的数据进行了修改，将0.9与1.1之间的值转换为1，以显示大于10％的差异。

图10显示了外周施用ETV:IDS校正了IDS KO脑中的TREM2积聚。

图11示出了在IDS KO；TfR

表1总结了所分析的GlcCer物质，其水平表示为WT的倍数。

表2提供了用媒介物、ETV:IDS或Elaprase处理的IDS KO小鼠的脑中的脂质水平的数据(相对于WT的变化倍数)。

实施例2.测量3月龄、6月龄和9月龄的IDS KO小鼠中的脑GAG、溶酶体脂质和神经丝轻链(Nf-L)

如下所述，在3月龄、6月龄和9月龄的WT和IDS KO小鼠中研究脑GAG、溶酶体脂质和神经丝轻链(Nf-L)的水平。

材料与方法

如本文所述(实施例1)，对用于本研究的动物进行护理。对组织进行采样，并使用本文所述的方法(实施例1)测量脂质和GAG水平。如下所述测量Nf-L水平。

Nf-L的CSF和血清分析的方法

使用Quanterix Simoa神经丝轻链(NF-L)样品稀释液(Quanterix102252)，将脑脊髓液(CSF)稀释100倍，并将血清稀释4倍，然后再加入到Simoa 96孔微孔板(Quanterix101457)中。根据Simoa NF-Light Advantage试剂盒(Quanterix 1031086)的说明书，使用Simoa检测试剂和微珠试剂(分别为Quanterix 103159和102246)进行NF-light测定。将样品与检测剂和微珠试剂在30℃、800rpm下孵育30分钟后，根据Quanterix两步方案，在Simoa微孔板洗涤器上用Simoa洗涤缓冲液A(Quanterix 103078)洗涤样品板。随后加入SBG试剂(Quanterix102250)，并将样品在30℃、800rpm下孵育10分钟。继续进行2步洗涤器方案，将样品微珠两次重悬在Simoa洗涤缓冲液B(Quanterix103079)中，然后最终吸出缓冲液。在Quanterix SR-X仪器上使用NF-Light分析方案测量样品NF-L水平，并根据Quanterix测定试剂盒提供的校准曲线进行内推。

结果

测量IDS KO小鼠中相对于年龄匹配的WT对照在3月龄、6月龄和9月龄时脑HS/DS(GAG)的积聚(图1)。在所有测试年龄的IDS KO小鼠中，GAG积聚均显著较高。

还测量了相对于年龄匹配的WT对照，IDS KO小鼠脑中的溶酶体脂质积聚(GM1、GM2、GM3、BMP、GlcCer和GD3)(图2A-2D)。GM1(d36:1)在IDS KO和WT小鼠中显示相似的水平(图2A和2B)，而GM2(36:1)、GM3(36:1)、BMP(36:2)、GlcCer(34:1)和GD(39:1)的水平与WT动物相比，均显示出1.7至5.5倍的增加(图2A-2D)。类似于GD3(39:1)，IDS KO中GD3(36:1)也增加(平均2倍)。

还观察到相对于年龄匹配的对照，IDS KO小鼠血清中的BMP水平升高。具体地说，在IDS KO小鼠中采集的9月龄血清样品中，与WT对照相比，BMP(36:2)和BMP(44:12)尤其增加(图3)。

观察到相对于WT年龄匹配的对照，9月龄的IDS KO小鼠的CSF中溶酶体脂质水平升高(Gd1a/b、GM3、BMP和GlcCer)(图4)。

Nf-L是神经变性的有用标志物(Norgren等人2003.Brain Research 987(1):25-31)，但以前没有与亨特综合征/MPSII相关联。相对于同龄的野生型小鼠队列，9月龄的IDSKO小鼠的血清和CSF中的Nf-L浓度升高(图26A、26B)。CSF中Nf-L水平的相对差异随小鼠队列的年龄而增加，其中在9月龄的小鼠队列组中观察到Nf-L水平的最大差异(图26C)。这些结果表明，Nf-L还可以在亨特综合征小鼠模型中用作疾病相关和治疗反应性生物标志物。

实施例3.外周施用ETV:IDS对IDS KO×TfR

检查变化剂量的ETV:IDS对IDS KO×TfR

材料与方法

动物护理

小鼠被圈养在12小时亮/暗循环下并随意取用水和标准啮齿动物饮食(

小鼠品系

在上面的实施例1中描述了用于本研究的IDS KO×TfR

施用和样品收集

向2-3月龄的IDS KO×TfR

为了收集最终样品，通过腹膜内(i.p.)注射2.5％的Avertin对动物进行深度麻醉。为了收集CSF，在动物头骨的后部做矢状切开，分离皮下组织和肌肉以暴露枕大池，并使用预拉的玻璃毛细管刺穿枕大池以收集CSF。将CSF转移至低蛋白LoBind Eppendorf管中，并在4℃下以12,700rpm离心10分钟。将CSF转移至新的管中，并在干冰上速冻。通过测量样品在420nm下的吸光度，可以确认小鼠CSF中没有血液污染。通过心脏穿刺收集血液以收集血清。为了收集血清，使血液在室温下凝结至少30分钟。然后将管在4℃下以12,700rpm离心7分钟。将血清转移至新的管中，并在干冰上速冻。使用蠕动泵(Gilson公司MinipulsEvolution)用冰冷的PBS对动物经心灌注。解剖脑，并在干冰上速冻。

组织制备和LCMS测定

使用类似于实施例1中所述的方法进行组织制备和LCMS测定。

结果

对于接受ETV:IDS的小鼠，观察到血清脑和CSF GAG呈剂量依赖性降低(图12A-12C)。值得注意的是，血清GAG已校正至野生型水平。

重要的是，即使在测试的最低ETV:IDS剂量(3mg/kg)时，脑溶酶体脂质(GM3、GlcCer和BMP)也显著降低(图13A-13C)。因为IDS缺乏小鼠中的脂质积聚被认为是GAG积聚的功能性结果，所以这些结果可能表明，即使相对于WT小鼠GAG水平升高，也可以实现脑中溶酶体功能的功能性恢复。

实施例4.从脑组织中分选特定的CNS细胞类型

开发出一项方案，从脑组织中分离出富集的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞群体。然后将富集的群体用于研究施用ETV:IDS在IDS KO×TfR

材料与方法

动物护理

小鼠被圈养在12小时亮/暗循环下并随意取用水和标准啮齿动物饮食(

CNS细胞类型分离

为了制备用于分选CNS细胞的单细胞悬浮液，给小鼠灌注PBS，将脑解剖，并根据制造商的方案使用成人脑解离试剂盒(Miltenyi Biotec 130-107-677)加工成单细胞悬浮液。细胞被Fc封闭(Biolegend#101320，1:100)并用固定型活性染剂BV510(BDBiosciences#564406，1:100)(以排除死细胞)、CD11b-BV421(BD Biosciences 562605，1:100)、CD31-PerCP Cy5.5(BD Biosciences#562861，1:100)、O1-488(Thermo/eBio#14-6506-82，1:37.5)、Thy1-PE(R&D#FAB7335P，1:100)和EAAT2-633(Alomone#AGC-022-FR，1:50)染色以进行流式细胞仪分析。细胞用PBS/1％BSA洗涤并通过100μm过滤器过滤，然后在带有100μm喷嘴的FACS Aria III(BD Biosciences)上对CD11b+小胶质细胞、EAAT2+星形胶质细胞和Thy1+神经元进行分选。为了获得纯的星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元群体，设置负门以去除分别主要为少突胶质细胞和内皮细胞的O1+和CD31+细胞。将分选的细胞团粒化或直接收集到裂解缓冲液中，以准备进行下游分析，包括qRT-PCR、RNAseq或糖组学，如本文所公开的相关方法中所述。细胞数目用于计算pg GAG/细胞。

图15A是用于分离纯的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞群体的CNS细胞分选方案的示意图以及针对向小鼠施用ETV:IDS而分析的下游终点(实施例5)。图15B是用于分离富集细胞群体的门控方案的流程图。图15C包括用于分选程序的代表性FACS门控。从左上方开始到右下方：前向(FSC)和侧向(SSC)散射确定碎片中的细胞；活细胞正门控；确认排除了CD31阳性内皮细胞；EAAT2阳性星形胶质细胞从CD11b小胶质细胞亚门控；Thy1阳性神经元从EAAT2阳性星形胶质细胞亚门控；并且最终去除CD11b小胶质细胞、EAAT2星形胶质细胞和Thy1神经元细胞群体中的O1少突胶质细胞决定了最终的分选标准。

分离的CNS细胞类型的基因表达的RNAseq和qPCR分析

为了验证分选方法，通过RNAseq和qPCR分析分选的细胞群体的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞基因的表达。活细胞直接在350μL含有1:100β-巯基乙醇的RLT-plus缓冲液(Qiagen,Hilden,Germany)中分选。使用RNeasy Plus Micro Kit(Qiagen，74034)提取RNA，并将其重悬于14μL无核酸酶的水中。在2100Bioanalyzer(Agilent)上使用RNA6000Pico芯片(Agilent 5067-1513)评估RNA的数量和质量。为了进行qPCR验证，使用SuperScript IV(Invitrogen)将1-2μL RNA转录为cDNA。使用Taqman探针在QuantStudio6Flex(Applied Biosystems)上评估靶基因的基因表达，并相对于Gapdh归一化。对于QuantSeq文库制备，遵循制造商所定义的‘低输入’方案，使用Illumina的QuantSeq 3'mRNAseq文库制备试剂盒FWD(Lexogen)，使用UMI第二链合成模块处理RNA，以鉴定和去除PCR重复片段。使用Illumina的NEBNext文库定量试剂盒(NEB，E7630S)对条形码化的样品进行定量。将所有样品以等摩尔比汇合到一个测序文库中，在带有高灵敏度DNA芯片的Bioanalyzer(Agilent，5067-4626)上进行定量。在UCSF先进技术中心(UCSF Center forAdvanced Technology)的Illumina HiSeq 4000泳道上生成50bp的单端读数。

对于RNAseq原始数据处理，使用umi2index(Lexogen)从原始测序读数中提取UMI，并用skewer修剪测序适配器(Jiang等人2014.BMC Bioinformatics 15:182)。将读数与小鼠基因组版本GRCm38_p6比对。STAR索引(版本2.5.3a)是使用–sjdbOverhang＝50自变量(argument)(Dobin等人2013.Bioinformatics 29:15-21)建立的。通过–sjdbGTFfile自变量提供Gencode基因模型(发布版M17)的剪接接合点。STAR比对是使用以下参数生成：-outFilterType BySJout、-quantMode TranscriptomeSAM、-outFilterIntronMotifsRemoveNoncanonicalUnannotated、-outSAMstrandField intronMotif、-outSAMattributes NH HI AS nM MD XS和-outSAMunmapped Within。使用以下参数获得比对：-readFilesCommand zcat-outFilterType BySJout-outFilterMultimapNmax 20-alignSJoverhangMin 8-alignSJDBoverhangMin 1-outFilterMismatchNmax 999-outFilterMismatchNoverLmax 0.6-alignIntronMin 20-alignIntronMax 1000000-alignMatesGapMax 1000000-quantMode GeneCounts-outSAMunmapped Within-outSAMattributes NH HI AS nM MD XS-outSAMstrandField intronMotif-outSAMtypeBAM SortedByCoordinate-outBAMcompression 6。使用collapse_UMI_bam工具(Lexogen)将映射至共享相同UMI的相同基因组位置的比对瓦解。基因水平计数是使用子阅读包(版本1.6.2)中的特征计数获得的(Liao等人2013.Bioinformatics 30:923-930)。基因符号和生物型信息是从Gencode GTF文件中提取的。

所有的RNA-seq表达分析均使用R(R Core Team 2018；版本3.2)，使用来自limma软件包(Ritchie等人2015.Nucleic Acids Research 43:e47)的voom分析框架(Law等人2014.Genome biology 15:R29)进行。基因表达谱经过TMM归一化(Robinson和Oshlack.2010.Genome Biology 11:R25)并且在下游分析之前，先鉴定并去除低丰度基因。低丰度基因定义为在至少四个样本中表达不高于百万分之10(十)个计数(CPM)的基因。

对于为了确定哪些变量解释样本之间的主要差异的主成分分析，将来自具有最高方差的前500个基因的对数转换后的CPM表达值用于主成分分析。样本在前两个主成分上的投影如图16所示。主成分1和2分别占数据方差的48％和26％。

通过组合自身与其它两种细胞类型之间的单独的成对差异表达测试的结果，为每种细胞类型鉴定了标志物基因。每个基因的标志物基因p值是通过使用Simes方法(Simes,R.J.1986.Biometrika73:751-754)将来自两个“外群”差异表达测试的标称p值组合而计算得出的。假发现率(FDR)是使用Benjamini-Hochberg方法(Benjamini和Hochberg.1995.Journal of the Royal Statistical Society.Series B(Methodological)57:289-300)由组合的p值计算得出的。通过降低与其它两种细胞类型相比的平均对数变化倍数来对基因进行分选，并且FDR<0.01的前20种基因用作细胞的标志物基因。使用limma/voom进行单独的成对差异表达测试。为了鉴定相对于其余细胞在靶细胞类型中具有强表达富集的基因，使用limma的处理框架(treat framework)来测试相对于五倍变化阈值的统计显著性(Robinson和Oshlack，同上)。

结果

为了确认分离的细胞群体的富集和纯度，使用RNA-Seq和qRT-PCR分析了每个分选群体的基因表达谱，并将其与已知谱进行比较(图16、图17A-17C和图25)。观察到分离的群体中相应细胞类型特异性基因的强富集，以及内皮细胞和少突胶质细胞的基因标志物减少。该集合数据表明，获得了神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的高纯度群体。

图17A示出了通过RNA-Seq确定的纯化的神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和输入细胞悬浮液中的由文献鉴定的经典细胞特异性标志物的表达。行是细胞类型所特定的基因组：(endo.)内皮，(oligo.)少突胶质细胞；每个基因的表达值被描绘为偏离其平均值的标准偏差数(z评分)；n＝4只小鼠。

图17B列出并示出了通过每种细胞类型的富集倍数>5.0和FDR<0.01所确定的前20种富集基因的表达。热图表达值被绘制为基因水平z评分。输入细胞是来自解离的脑的单细胞悬浮液。

图17C包括从分离的细胞群体中生成的代表性qRT-PCR数据，证实了这些群体已成功富集了神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。基因类别在x轴上分组：(Astro)星形胶质细胞，(MG)小胶质细胞，(Neu)神经元，(Oligo)少突胶质细胞和(Endo)内皮细胞；n＝5只小鼠。图表显示平均值±SEM。

图25是细胞类型特异性的富集基因集的表；表中的信息与图17B的热图相对应。通过每个细胞类型的富集倍数>5.0和FDR<0.01确定的前20种基因的表达以p值的升序列出。平均对数变化倍数(logFC.avg)是相对于另外两个“外群”群体，并且最右侧三列示出每个细胞群体内的基因的平均表达；n＝4只小鼠。

实施例5.外周施用ETV:IDS对IDS KO×TfR

检查变化剂量的ETV:IDS对IDS KO×TfR

材料与方法

动物护理

小鼠被圈养在12小时亮/暗循环下并随意取用水和标准啮齿动物饮食(

小鼠品系

在上面的实施例1中描述了用于本研究的TfR

施用和样品收集

向2-3月龄的IDS KO×TfR

为了收集最终样品，通过腹膜内(i.p.)注射2.5％的Avertin对动物进行深度麻醉。为了收集CSF，在动物头骨的后部做矢状切开，分离皮下组织和肌肉以暴露枕大池，并使用预拉的玻璃毛细管刺穿枕大池以收集CSF。将CSF转移至低蛋白LoBind Eppendorf管中，并在4℃下以12,700rpm离心10分钟。将CSF转移至新的管中，并在干冰上速冻。通过测量样品在420nm下的吸光度，可以确认小鼠CSF中没有血液污染。通过心脏穿刺收集血液以收集血清。为了收集血清，使血液在室温下凝结至少30分钟。然后将管在4℃下以12,700rpm离心7分钟。将血清转移至新的管中，并在干冰上速冻。使用蠕动泵(Gilson公司MinipulsEvolution)用冰冷的PBS对动物经心灌注。解剖脑，并在干冰上速冻。

CNS细胞类型分离

如所述对CNS细胞进行分选以实现纯的星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元群体(实施例4)。将分选的细胞团粒化或直接收集到裂解缓冲液中，然后进行处理以用于下游分析，包括qRT-PCR、RNAseq或糖组学，如相关方法中所述。细胞数目用于计算pg GAG/细胞。

使用类似于实施例1中所述的方法进行细胞裂解物制备和用于测量GAG、BMP、神经节苷脂、GlcCer和GalCer的LCMS测定。

ETV:IDS在整个CNS细胞类型中的分布分析

将鞘液(约1.5ml)中的活细胞直接分选至150μL 5％CHAPS裂解缓冲液中，CHAPS最终浓度为0.5％。将样品用Amicon Ultra 30KDa过滤器浓缩。五(5)μL样品或重组ETV:IDS系列稀释液使用IgG(人)AlphaLISA检测试剂盒(PerkinElmer#AL205C)按照制造商的说明书进行，并在EnVision

结果

评估ETV:IDS在IDS KO；TfR

富集的CNS细胞群体中的GAG水平如所述通过LC-MS/MS进行定量。图18A示出了相对于TfR

接下来，向IDS KO；TfR

ETV:IDS处理还减少了所关注的CNS细胞类型(例如神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞)中溶酶体脂质的次级积聚，包括神经节苷脂(图20)、葡萄糖基神经酰胺(图21)和双(单酰基甘油)磷酸酯(BMP)(图22)。这些数据说明用ETV:IDS处理除了在CNS细胞类型中的主要GAG贮积之外，还可以校正继发性溶酶体功能障碍。

实施例6.积聚的脂质物质的空间分布和ETV:IDS对脂质积聚的校正

检查变化剂量的ETV:IDS对IDS KO×TfR

小鼠品系和施用

在上面的实施例1中描述了用于本研究的TfR

基于质谱法的神经节苷脂水平成像

将脑组织在铝箔上快速冷冻，然后将其缓慢降低至液氮中约10秒钟。将冷冻的脑储存在-80℃下直至准备使用。切片前，将脑置于低温恒温室中以使组织平衡至-20℃。在低温恒温器(Leica Biosystems,Buffalo Grove,IL)上将脑切成12μm厚的切片，并解冻封固到涂有氧化铟锡(ITO)的载玻片(Delta Technologies,Loveland,CO)上。距离前囟点大约+0.72mm和-1.82mm处收集两个脑水平。将具有指定用于IMS的切片的板用冷却的(约4℃)50mM甲酸铵洗涤3次，并在室温下干燥，然后施加基质。获得另外的切片用于H&E染色。染色后，通过载玻片扫描仪(Leica Biosystems,Buffalo Grove,IL)获得数字显微照片。对于基质施加，通过升华将板用1,5-二氨基萘(DAN)MALDI基质包被(Hankin等人2007.Journal ofthe American Society for Mass Spectrometry 18:1646-1652；Thomas等人2012.Analytical Chemistry 84:2048-2054)。简单地说，将100mg重结晶的DAN置于玻璃升华装置(Chemglass Life Sciences,Vineland,NJ)的底部。将装置放置在设置为130℃的金属加热块上，并将DAN在小于25毫托的压力下升华到组织表面上，历时4分钟。通过在基质施加前后称量载玻片重量来确定将大约1.8mg DAN施加到每个载玻片上。然后将包被的板放在皮氏培养皿(Petri dish)中，用氮气冲洗，并在MS分析之前在-80℃下储存两天(Yang等人2019.International Journal of Mass Spectrometry437:3-9)。

对于质谱成像，在从密封的皮氏培养皿中取出之前，让板平衡至室温。脑切片在配备了SmartBeam II 2kHz频率三重Nd:YAG激光(355nm)的Solarix 15T FT-ICR MS(BrukerDaltonics,Billerica,MA)上成像。在负离子模式下以100μm空间分辨率获取图像。使用较小的激光聚焦设置并在100μm像素内随机游走，每个像素是1000次激光发射的平均值。质谱仪使用一系列磷团簇进行外部校准(Sládková等人2009.Rapid Communications in MassSpectrometry 23:3114-3118)。从m/z 600-3,000收集数据，时域文件大小为1M(FID长度＝1.3631秒)，从而获得了m/z 1041下153,000的分辨力。使用FlexImaging 3.0(BrukerDaltonics,Billerica,MA)生成图像。神经节苷脂通过准确的质量鉴定，其中质量准确度通常优于1ppm。

免疫组织化学

使用Leica低温恒温器(Leica CM 1950)将新鲜冷冻的小鼠脑组织冠状切成10微米厚。将切片直接封固至Fisherbrand Superfrost Plus显微镜载玻片上，并储存在-80℃下直至处理用于免疫组织化学。将切片在1x PBS中冲洗3轮，每次5分钟，然后固定在4％多聚甲醛中15分钟。然后将切片在1x PBS中冲洗3轮，每次5分钟，然后在封闭溶液(1x PBS/5％普通山羊血清/0.3％Triton X-100)中在室温下孵育1小时。然后将切片在于封闭溶液中制备的一抗(BioRad：大鼠抗Cd68，1:500)中在室温下孵育2小时。切片在1x PBS/0.3％Triton X-100中冲洗3轮，每次5分钟，然后在于封闭溶液中制备的二抗(Invitrogen：山羊抗大鼠Alexa Fluor 488，1:500)和DAPI(Invitrogen Molecular Probes D1306：从5mg/mL储备液起，1:10,000)中在室温下于黑暗中孵育1小时。然后将切片在1x PBS/0.3％TritonX-100中冲洗3轮，每次5分钟，在1X PBS中快速冲洗，然后盖上带有DABCO抗褪色剂的聚乙烯醇封固介质(Sigma 10981)。使用Zeiss Axio Scan Z1以20倍的放大倍数拍摄荧光图像。每个荧光团分别使用合适的单通道滤光片组成像，在成像的所有组织样品中每个荧光团的曝光时间相同。然后使用Zeiss Zen软件对单个图像进行平铺和拼接，并进行阴影校正。

结果

进行质谱成像(IMS)来确定IDS KO；TfR

如图23所示，观察到与野生型对照相比，IDS KO；TfR

神经炎症代表了许多神经病性LSD的共同特征，并且已经出现了一个共识，即在MPS II疾病的小鼠模型以及MPS患者中普遍报告的神经胶质激活可能导致MPS病症中整个脑中的进行性变性。分别通过脑组织切片的免疫组织化学分析或脑裂解物的生化分析来评估小胶质细胞活性的两种标志物，即CD68和在髓样细胞上表达的触发受体2(Trem2)的水平。图24是来自用媒介物、ETV:IDS或艾杜硫酶处理的TfR

与TfR

实施例7.包含IDS的融合蛋白的构建。

设计和克隆

设计IDS-Fc融合蛋白，所述融合蛋白含有(i)将成熟的人IDS酶与包括Fc区的人IgG1片段融合的融合多肽(“IDS-Fc融合多肽”)，和(ii)修饰的人IgG1片段，其在Fc区中含有赋予转铁蛋白受体(TfR)结合的突变(“修饰的Fc多肽”)。具体地说，创建IDS-Fc融合多肽，其中将IDS片段融合至人IgG1 Fc区的N端或C端。在一些情况下，将接头置于IDS与IgG1片段之间以减轻两个片段之间的任何空间位阻。在所有构建体中，来自κ链V-III的信号肽，氨基酸1-20(UniProtKB ID–P01661)插入融合体的上游以促进分泌，并且IDS被截短，由氨基酸S26-P550(UniProtKB ID–P22304)组成。所使用的人IgG1 Fc区的片段对应于UniProtKB ID P01857中的序列的氨基酸D104-K330(位置221-447，EU编号，包括铰链的10个氨基酸(位置221-230))。在一些实施方案中，将源自人IgG1残基D104-K330但缺乏IDS融合体的第二Fc多肽与IDS-Fc融合多肽共转染，以产生具有一种IDS酶的异二聚体融合蛋白(“单酶”)。在一些构建体中，IgG1片段含有另外的突变，以促进两个Fc区的异二聚。类似地设计和构建缺少赋予TfR结合的突变的对照IDS-Fc融合蛋白，不同之处在于这些蛋白质缺少赋予TfR结合的突变。作为一个额外的对照，生成了带有C端六组氨酸标签(SEQ ID NO:203)的IDS(氨基酸S26-P550)以方便检测和纯化。

实施例中使用的结合TfR的IDS-Fc融合蛋白是由IDS-Fc融合多肽和与TfR结合的修饰的Fc多肽形成的二聚体。对于IDS酶连接于Fc区N端的二聚体，IDS-Fc融合多肽可具有SEQ ID NO:113、193和197中的任一个的序列。在这些序列中，IDS序列带有下划线，并在位置59处含有修饰为甲酰基甘氨酸的半胱氨酸(双下划线)。IDS通过GGGGS接头(SEQ ID NO:201)接合于Fc多肽。IgG1铰链区的一部分(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:111)包括在Fc多肽的N端。CH2结构域序列始于SEQ ID NO:113、193和197的位置541处。

IDS-Fc融合蛋白ETV:IDS 35.21是由具有SEQ ID NO:113、193和197中的任一个的序列的IDS-Fc融合多肽与具有SEQ ID NO:114的序列的与TfR结合的修饰的Fc多肽形成的二聚体。前10个氨基酸是IgG1铰链区的一部分。CH2结构域序列始于SEQ ID NO:114的位置11处。

IDS-Fc融合蛋白ETV:IDS 35.21.17.2是由具有SEQ ID NO:113、193和197中的任一个的序列的IDS-Fc融合多肽与具有SEQ ID NO:190的序列的与TfR结合的修饰的Fc多肽形成的二聚体。前10个氨基酸是IgG1铰链区的一部分。CH2结构域序列始于SEQ ID NO:190的位置11处。

IDS-Fc融合蛋白ETV:IDS 35.23.2是由具有SEQ ID NO:113、193和197中的任一个的序列的IDS-Fc融合多肽与具有SEQ ID NO:191的序列的与TfR结合的修饰的Fc多肽形成的二聚体。前10个氨基酸是IgG1铰链区的一部分。CH2结构域序列始于SEQ ID NO:191的位置11处。

IDS-Fc融合蛋白ETV:IDS 35.21.17是由具有SEQ ID NO:113、193和197中的任一个的序列的IDS-Fc融合多肽与具有SEQ ID NO:117的序列的与TfR结合的修饰的Fc多肽形成的二聚体。修饰的Fc多肽的N端可包括IgG1铰链区的一部分(例如SEQ ID NO:111)。

重组蛋白表达与纯化

为了表达与Fc区融合的重组IDS酶，根据制造商的说明书(Thermo FisherScientific)，使用Expifectamine

使用蛋白A亲和色谱法从细胞培养物上清液中纯化具有(或不具有)赋予TfR结合的工程化Fc区的IDS-Fc融合蛋白。将上清液加载到HiTrap MabSelect SuRe蛋白A亲和柱(GE Healthcare Life Sciences，使用Akta Pure系统)上。然后将柱用>20柱体积(CV)的PBS洗涤。使用100mM柠檬酸盐/NaOH缓冲液pH 3.0(含有150mM NaCl)洗脱结合的蛋白质。洗脱后，立即使用1M精氨酸-670mM琥珀酸盐缓冲液pH 5.0(以1:5稀释)中和级分。通过还原和非还原SDS-PAGE评估洗脱的级分中IDS-Fc融合蛋白的均质性。

为了纯化带有六组氨酸标签(SEQ ID NO:203)的IDS酶，将转染的上清液对着15L的含100mM NaCl的20mM HEPES pH 7.4彻底透析过夜。将透析过的上清液结合于HisTrap柱(GE Healthcare Life Sciences，使用Akta Pure系统)上。结合后，将柱用20CV PBS洗涤。使用含有500mM咪唑的PBS洗脱结合的蛋白质。通过还原和非还原SDS-PAGE评估洗脱的级分中IDS酶的均质性。在50mM Tris pH 7.5中1:10稀释含有IDS酶的汇集级分，并使用QSepharose High Performance(GE Healthcare)进一步纯化。结合后，将柱用10CV的50mMTris pH 7.5洗涤。使用线性梯度至50mM Tris pH 7.5和0.5MNaCl洗脱结合的蛋白质，并收集在1CV级分中。通过非还原SDS-PAGE评估级分纯度。纯化产生均质的IDS-Fc融合蛋白和带有六组氨酸标签(SEQ ID NO:203)的IDS酶。

实施例8.外周施用ETV:IDS对IDS KO×TfR

检查每周一次静脉内给与ETV:IDS对IDS KO×TfR

材料与方法

动物护理

小鼠被圈养在12小时亮/暗循环下并随意取用水和标准啮齿动物饮食(

小鼠品系

在上面的实施例1中描述了用于本研究的IDS KO×TfR

施用和样品收集

通过尾静脉向8周龄的IDS KO；TfR

如实施例1中所述收集生活中血清和终末CSF样品。还如实施例1中所述收集脑和肝组织样品。此外，在终止前立即收集尿液并冷却。然后将尿液样品储存在冰箱中，设定成保持在-60℃至-80℃，以进行尿液生物标志物分析。

GAG的定量

如实施例1所述制备脑和肝组织以定量GAG(例如硫酸乙酰肝素(HS)和硫酸皮肤素(DS))。在LCMS测定以定量GAG之前，将蛋白质裂解物(来自组织)或CSF、尿液或血清与肝素酶I、II、III和软骨素酶B的组合混合。将消化物与乙腈混合，并通过LCMS分析。如实施例1中所述进行LCMS测定以定量GAG。

Nf-L的CSF和血清分析的方法

如实施例2中所述测量血清和CSF中的Nf-L水平。

结果

脑、CSF、肝和尿液中的GAG。在最后一剂ETV:IDS后7天测量来自IDS KO；TfR

CSF神经丝轻链(Nf-L).如图26A-26C所示，在亨特综合征的小鼠模型中观察到CSF和血清中Nf-L水平升高。每周剂量的ETV:IDS在13周的时间内能够逆转这些变化，并且在用ETV:IDS处理的IDS KO；TfR

表

表1.用ETV:IDS处理的IDS KO小鼠脑内GlcCer水平的总结(相对于WT的倍数)

表2.用媒介物、ETV:IDS或Elaprase处理的IDS KO小鼠脑内的脂质水平(相对于WT的倍数)

非正式序列表

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