一种DNA条形码二代测序文库的构建方法及其应用

文献发布时间：2024-04-18 19:53:33

技术领域

本发明属于生物信息学领域，具体涉及一种DNA条形码二代测序文库的构建方法及其应用。

背景技术

DNA条形码(DNA barcoding)技术是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，被广泛应用于不同生物类群的鉴定中，是传统形态鉴别方法的辅助手段和有效补充。该方法通过筛选通用条形码，建立条形码数据库和鉴定平台，运用生物信息学方法分析比对DNA数据，进而对物种进行鉴定。例如线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(CO Ⅰ)基因片段是常用的动物类群鉴定标记序列，进化速率较快的Cytb等基因可用于亚种、姊妹种或不同地理种群间的分子溯源；通过分析16S rRNA基因可得到各细菌的分类学特征，常用于微生物群落菌种组成分析；我国首次提出将ITS2序列作为药用植物鉴定的通用序列，并建立以ITS2为核心、psbA-trnH为补充序列的植物类药材分子鉴定体系。

对DNA条形码的鉴定通常是基于条形码DNA两端的保守序列设计引物进行PCR扩增，然后将进行Sanger测序或者二代测序，再将DNA序列比对数据库进行物种鉴定。但Sanger测序的通量比较低且只能对单一物种进行分析，不适用于混合样本类型。基于二代测序的一般建库实验流程包括目的片段的扩增、扩增产物的纯化、纯化产物的片段化(包括超声波打断、酶法打断等)、末端修复、3端加A和连接接头等，整个建库流程比较繁琐，成本相对比较高，且由于种之间的序列差异比较小、序列包含保守区域，数据利用率比较低，对于混样的鉴定也相对比较困难，无法确定混样比例。

发明内容

本发明的目的是构建可以适用于混合样本分析或多物种分析的DNA条形码二代测序文库。

本发明首次保护一种DNA条形码二代测序文库的构建方法，包括如下步骤：

(1)以待测DNA为模板，采用引物对进行第一轮PCR扩增，获得第一轮扩增子；

所述引物对由正向引物和反向引物组成；

所述正向引物从5’端至3’端依次为第一通用序列、随机序列标签和第一特异性序列；所述反向引物为第二特异性序列；

(2)完成步骤(1)后，采用引物组合对所述第一轮扩增子进行第二轮PCR扩增，获得第二轮扩增子；

所述引物组合由引物1、引物2和引物3组成；

所述引物1包括所述第一通用序列；所述引物2从5’端至3’端依次为所述第二特异性序列、第二通用序列和随机序列；所述引物3从5’端至3’端依次为文库标签测序引物结合序列、文库标签序列和所述第二通用序列；

(3)完成步骤(2)后，取所述第二轮扩增子，纯化，得到DNA条形码二代测序文库。

上述方法中，进行第一轮PCR扩增用于加随机序列标签特异性扩增。第二轮PCR扩增用于文库扩增。

上述方法中，所述正向引物和所述反向引物通过第一特异性序列和第二特异性序列特异性扩增模板中的DNA条形码区域(在每个扩增子5’端通过随机序列标签加上唯一标签)。

上述方法中，第二轮PCR扩增时，引物2通过第二特异性序列锚定在第一轮扩增子的第二特异性序列的反向链上，基于DNA链在三维空间上的可折叠性，随机序列分别与DNA条形码区域的任意位置碱基互补配对并延伸；引物1通过第一通用序列锚定在第一轮扩增子的第一通用序列的反向链上进行延伸；通过引物1和引物2扩增得到不均等片段大小的产物，每个扩增产物均在5’端带有第一通用序列和来源与不同模板的唯一标签，在3’端带有第二通用序列；引物3通过第二通用序列锚定在上述产物的第二通用序列的反向链上进行延伸，为上述产物加上文库标签序列和文库标签测序引物结合序列。

上述方法中，所述第一通用序列和所述第二通用序列均为测序通用接头序列且与模板不同源。

上述方法中，所述步骤(1)中，随机序列标签可为长度10-20bp(如10-15bp、15-20bp、10bp、15bp或20bp)的碱基N，N为A、T、G和C中的任一种。

上述方法中，所述步骤(1)中，进行第一轮PCR扩增时，正向引物和反向引物通过2-4个(如2个、3个、4个)循环的扩增，获取DNA条形码区域序列。

上述方法中，所述步骤(2)中，随机序列可为长度6-15bp(如6-10bp、10-15bp、6bp、10bp或15bp)的碱基N，N为A、T、G和C中的任一种。

上述方法中，所述步骤(3)中，所述纯化的目的为去除短的DNA片段。

上述任一所述的方法中，所述二代测序文库适配双端测序。

上述任一所述的方法中，所述待测DNA可为物种或样本的DNA。

本发明还保护一种用于构建物种或样本的DNA条形码二代测序文库的试剂盒，包括上述任一所述正向引物、上述任一所述反向引物、上述任一所述引物1、上述任一所述引物2和上述任一所述引物3。

所述试剂盒具体可由所述正向引物、所述反向引物、所述引物1、所述引物2和所述引物3组成。

上述任一所述的构建方法或上述任一所述试剂盒在鉴定物种或样本中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述的构建方法或上述任一所述试剂盒在检测物种纯度或样本纯度中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述的构建方法或上述任一所述试剂盒在分析混合物种或混合样本的混合比例中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述物种可为单一物种，也可为两种以上的物种。

上述任一所述样本可为单一样本，也可为混合样本。

上述任一所述物种可为植物。所述植物可为药用植物。

当待测DNA为植物DNA时、物种为植物时或样本来源于植物时，内转录间隔区2(ITS2)是鉴别植物常用的DNA条形码序列，位于5.8s、28s rRNA之间。在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性，显示最近的进化特征，具有物种水平上的差异，针对ITS2两侧翼的5.8s rRNA和28s rRNA保守区域，设计一对引物即可扩增获取不同植物物种的ITS2序列，即根据ITS2序列即可鉴定不同物种。ITS2两侧翼的序列在所有植物中都是保守的，第一特异性序列是5.8s rRNA保守区域，第二特异性序列是28s rRNA保守区域，一对引物可以扩增所有植物的ITS2区域。

上述任一所述药用植物可为人参、西洋参和/或三七。此时，正向引物、反向引物、引物1、引物2和引物3的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1—SEQ ID NO:5所示。

实验证明，将人参、西洋参和/或三七按照不同的比例混合制备样本，然后按照本发明提供的方法制备DNA条形码二代测序文库。将该文库上机测序，截取reads1的前10bpUID将reads1和reads2进行分组，然后进行序列的组装，将组装序列比对数据库，鉴定物种正确率100％，组装序列与目标物种相似度100％，根据相同物种的UID数量计算混合样本比例，比例基本正确。由此可见，本发明提供的方法可以准确的鉴定物种并确定混合比例，适用于混合样本的分析。

本发明提供了一种DNA条形码二代测序文库的构建方法，该方法通过两轮PCR完成对条形码DNA的测序文库的制备，方法简单快速，易于组装全长DNA条形码，可以准确的鉴定物种并确定混合比例，尤其适用于混合样本的分析。该测序文库可直接用于二代测序，尤其适用于混合样本的鉴定，操作简单快速，成本低廉。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为DNA条形码二代测序文库的构建方法的流程图。

图2为二轮特异性扩增的正向引物、反向引物、引物1、引物2和引物3的结构。

图3为实施例2中Agilent 2100检测产物片段分布结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、DNA条形码二代测序文库的建立

本发明经过大量实验，建立了一种DNA条形码二代测序文库的构建方法。具体步骤如下：

1、合成第一轮特异性扩增的引物对

第一轮扩增的引物对由正向引物和反向引物组成。

正向引物从5’端至3’端依次为第一通用序列、随机序列标签、第一特异性序列。反向引物为第二特异性序列。正向引物和反向引物通过第一特异性序列和第二特异性序列特异性扩增模板中的DNA条形码区域。随机序列标签为长度10-20bp的碱基N，N为A、T、G和C中的任一种。

2、进行第一轮PCR扩增

对模板进行第一轮PCR扩增，获得第一轮扩增子。第一轮PCR扩增时，正向引物与反向引物通过2个循环的扩增，获取DNA条形码区域序列，并在每个扩增子5’端通过随机序列标签加上唯一标签。

第一轮PCR扩增用于加随机序列标签特异性扩增。

3、合成第二轮扩增的引物组合

第二轮扩增的引物组合由引物1、引物2和引物3组成。

引物1包括第一通用序列。引物2从5’端至3’端依次为第二特异性序列、第二通用序列和随机序列。引物3从5’端至3’端依次为文库标签测序引物结合序列、文库标签序列和第二通用序列。

第一通用序列和第二通用序列均为完整测序通用接头序列(如MGI/Illumina、proton平台接头)，与未知序列(即模板)不同源。随机序列为长度6-15bp的碱基N，N为A、T、G和C中的任一种。

引物2通过第二特异性序列锚定在第一轮扩增子第二特异性序列的反向链上，基于DNA链在三维空间上的可折叠性，随机序列分别与DNA条形码区域的任意位置碱基互补配对并延伸，与引物1同时扩增得到不均等片段大小的产物，每个扩增产物均在5’端带有第一通用序列和与模板相同的标签序列，在3’端带有第二通用序列；引物3通过第二通用序列，为上述产物加上文库标签和文库标签测序引物结合序列，得到测序文库。

4、进行第二轮PCR扩增

对第一轮扩增子进行第二轮PCR扩增，获得第二轮扩增子。

第二轮PCR扩增时，引物2通过第二特异性序列锚定在第一轮扩增子的第二特异性序列的反向链上，基于DNA链在三维空间上的可折叠性，随机序列分别与DNA条形码区域的任意位置碱基互补配对并延伸；引物1通过第一通用序列锚定在第一轮扩增子的第一通用序列的反向链上进行延伸；通过引物1和引物2扩增得到不均等片段大小的产物，每个扩增产物均在5’端带有第一通用序列和来源与不同模板的唯一标签，在3’端带有第二通用序列；引物3通过第二通用序列锚定在上述产物的第二通用序列的反向链上进行延伸，为上述产物加上文库标签序列和文库标签测序引物结合序列。

第二轮PCR扩增用于文库扩增。

5、对第二轮扩增子进行纯化去除长度过短的片段，得到DNA条形码二代测序文库。

该二代测序文库适配双端测序。

构建上述DNA条形码二代测序文库的流程图见图1。

第一轮特异性扩增的引物对的正向引物和反向引物的结构见图2中左图。

第二轮扩增的引物组合的引物1、引物2和引物3的结构见图2中右图。

实施例2、采用实施例1建立的方法鉴定药用植物混合样本

一、引物的设计与合成

内转录间隔区2(ITS 2)是鉴别植物常用的DNA条形码序列，位于5.8s、28s rRNA之间，由于ITS 2不加入成熟核糖体，在进化过程中承受的自然选择压力非常小，因此能容忍更多的变异，在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性，显示最近的进化特征，具有物种水平上的差异，针对ITS 2两侧翼的5.8s rRNA和28s rRNA保守区域，设计一对引物即可扩增获取不同植物物种的ITS2序列，即根据ITS2序列即可鉴定不同物种。ITS2两侧翼的序列在所有植物中都是保守的，第一特异性序列是5.8s rRNA保守区域，第二特异性序列是28s rRNA保守区域，一对引物可以扩增所有植物的ITS2区域。按照实施例1的方法设计并合成第一轮特异性扩增ITS 2片段的引物对和第二轮扩增的引物组合。引物的具体核苷酸序列见表1。

表1

注：单下划线为第一通用序列，双下划线为第一特异性序列，波浪线为第二特异性序列，虚线为第二通用序列，N为A、T、G和C中的任一种、可以组成随机序列标签、随机序列和文库标签序列。

二、采用实施例1建立的方法鉴定不同药用植物混合的混合样本

1、混合样本基因组DNA的制备

(1)分别取40mg市售人参、西洋参和三七的中药饮片，用TissueLyser II仪器(Qiagen公司，Cat No./ID:85300)进行粉碎，得到人参粉末、西洋参粉末和三七粉末。

(2)将人参粉末和三七粉末分别按质量比3：1、1：1和1：3进行混合，依次得到混合样本1、混合样本2和混合样本3。将西洋参粉末和三七粉末分别按质量比3：1、1：1和1：3进行混合，依次得到混合样本4、混合样本5和混合样本6。

(3)用美基植物样品DNA快速提取试剂(Cat No./ID:MD5118)提取混合样本(混合样本1、混合样本2、混合样本3、混合样本4、混合样本5或混合样本6)的基因组DNA，得到混合样本基因组DNA。

2、混合样本DNA条形码二代测序文库的建立

(1)配制第一轮PCR反应体系。第一轮PCR反应体系为50μl，由5μl混合样本基因组DNA(混合样本1基因组DNA、混合样本2基因组DNA、混合样本3基因组DNA、混合样本4基因组DNA、混合样本5基因组DNA或混合样本6基因组DNA)、25μl KAPA 2G Multiplex PCR Kit(Cat No./ID为KK5802)、2.5μl表1所示的正向引物水溶液(浓度为10μM)、2.5μl表1所示的反向引物水溶液(浓度为10μM)和15μl分子级水组成。

(2)完成步骤(1)后，取第一轮PCR反应体系，进行第一轮PCR扩增，得到PCR扩增产物1。

反应程序为：95℃3min，1个循环；98℃20s，60℃1min，72℃30s，2个循环；72℃5min，1个循环。

(3)完成步骤(2)后，向PCR扩增产物1中加入60μl的XP beads(beckman公司的AgencourtAMPureXP磁珠，货号为A63881)进行纯化，之后用19μlTE缓冲液溶解，得到反应物。

(4)配制第二轮PCR反应体系。第二轮PCR反应体系为50μl，由19μl反应物、25μlKAPA 2G Multiplex PCR Kit、2.5μl表1所示的引物1水溶液(浓度为10μM)、1μl表1所示的引物2水溶液(浓度为10μM)和2.5μl表1所示的引物3水溶液(浓度为10μM)组成。

(5)完成步骤(4)后，取第二轮PCR反应体系，进行第二轮PCR扩增，得到PCR扩增产物2。

反应程序为：95℃3min，1个循环；98℃20s，60℃15s，72℃30s，30个循环；72℃5min，1个循环。

(6)完成步骤(5)后，向PCR扩增产物2中加入40μl的XP beads进行纯化，之后用20μl TE缓冲液溶解，得到产物。该产物即为混合样本DNA条形码二代测序文库。

每个混合样本重复3次。即每个混合样本获得3个DNA条形码二代测序文库。

采用agilent2100分别对产物的大小进行检测。部分结果见图3。结果表明，扩增产物为弥散条带，主峰为350bp左右，符合预期。。

采用qubit 2.0分别对产物的浓度进行质检。结果表明，第二轮PCR扩增产物浓度均大于10ng/μL，浓度合格，符合预期。

3、上机测序

将步骤2获得的所有产物进行标准化，等量混合，得到混合文库。将混合文库进行平行测序，得到测序结果；测序平台MGISEQ-2000，测序类型PE100。分析reads测序结果，分析步骤包括过滤接头引物序列、通过标签对paired-end reads进行分组、组装、比对等，鉴定物种，并按其混合比例进行检测。

分析结果见表2和表3(混合样本1-1、混合样本1-2和混合样本1-3为混合样本1的三次重复，混合样本2-1、混合样本2-2和混合样本2-3为混合样本2的三次重复，以此类推)。结果表明，实施例1建立的方法能够制备长短不一的DNA条形码二代测序文库，该文库可以直接上机测序，截取reads1的前10bp UID将reads1和reads2进行分组，然后进行序列的组装，将组装序列比对数据库，鉴定物种正确率100％，组装序列与目标物种相似度100％，根据相同物种的UID数量计算混合样本比例，比例正确。由此可见，采用实施例1建立的方法制备的DNA条形码二代测序文库可以准确的鉴定物种并确定混合比例，适用于混合样本的分析。

表2

表3.组装序列

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 深圳华大智造科技股份有限公司

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