一种组织活检病理切片免疫荧光染色试剂盒及方法

技术领域

本发明总体涉及病理学检验和分析领域，具体涉及一种组织活检病理切片免疫荧光染色试剂盒及方法。

背景技术

组织病理学检验是确定组织病理改变的主要方法。传统病理学检验病理切片用HE染色，可见整个细胞的基本结构如细胞膜、细胞桨和细胞核的细胞形态学结构，显现恶性细胞的核大、核畸形和核浆比失调的癌细胞之部分细胞病理学特征。它的主要技术缺点是不能清晰的显现核仁的形态与结构，不能明确标定核仁、不能分辨核仁与核浆。

细胞核仁是细胞的核心细胞器，在电子显微镜下，细胞核中的核仁的结构分为：(1)纤维中心：纤维中心是核仁的最内层结构，占核仁总体积的5％。是核仁标志物的核仁纤维蛋白、核仁蛋白、核仁磷酸蛋白、RNA聚合酶I等的分布区域和所在地。纤维中心的数量、面积大小、形态等与细胞代谢活动、生长速度等密切相关，纤维中心实际上等同于细胞核的核仁中心，因而其数量、面积大小、形态及分布与细胞的恶性病理变化密切相关。(2)纤维组份:由4-10nm的纤维细丝构成，大约占核仁总体积的15％。它在核仁发生时首先形成与纤维中心紧密相连并环绕纤维中心。(3)颗粒组份：围绕着纤维组份，在致密型核仁中占75％左右。核仁是细胞发育、分化和增殖的关键，组织的病理改变恰是细胞的分化和增殖出了问题，所以组织病理改变必然从细胞核仁开始，在组织病理学检验时注重细胞核仁的病理改变是不可或缺的重要内容，也是解决传统病理检验经常遇到不好下结论的病例重要途径，是鉴定恶性细胞病理形态学的基础和核心证据。

发明内容

本发明的目的是提供一种组织活检病理切片免疫荧光染色试剂盒及方法。本发明使用荧光标记的核仁纤维蛋白等单克隆抗体对核仁进行特征性染色，将细胞的核仁染成红色；用DAPI荧光染料将细胞核染成蓝色；再用伊红染料复染，将细胞浆或细胞表面染成绿色，并将弹力纤维或胶原纤维染成绿色或黄绿色。

本发明的基本原理：

传统组织病理学检查，主要用HE化学染色检测和鉴定组织病理改变，HE染色液组成成分为苏木素和伊红溶液，苏木素呈碱性,可和细胞中的酸性物质结合染成蓝色，细胞核中DNA两个磷酸基向外，呈酸性，所以被苏木素染成蓝色。而伊红染料为酸性，可与细胞中的碱性物质结合染成红色，红细胞等细胞浆中的蛋白质氨基呈碱性，所以被伊红染成红色，光学显微镜下可以看到细胞的细胞膜、细胞桨和细胞核的整个细胞形态结构，病理情况下显现恶性细胞的核大、核畸形和核浆比失调等部分细胞病理学特征；用于病理学检查，它的主要技术缺点是不能清晰的显现核仁的形态与结构，不能明确标定核仁数目。恶性肿瘤组织病理改变恰是由于分化和增殖出了问题，所以首先是细胞核仁发生了病理改变，病理检验中观察核仁的病理改变，为病理检验提供一个新的诊断依据，为克服病理检验中偶尔出现的结论困难提供一个新证据。本发明使用荧光标记的核仁纤维蛋白等单克隆抗体对核仁进行特征性染色，将细胞的核仁染成红色；用DAPI荧光染料将细胞核染成蓝色；再用伊红染料复染，将细胞浆或细胞表面染成绿色，并将弹力纤维或胶原纤维染成绿色或黄绿色。荧光显微镜下除了可以清楚看到细胞核和细胞浆完整结构和病理改变时细胞的体积大小、细胞核的体积大小、核浆比例等病理改变外，还可清楚看到核仁的结构、核仁的形态大小、核仁的分布和数量多少，从而为病理诊断提供了一个恶性病理特征性分析的可靠方法与试剂。。

根据本发明的第一方面，提供一种组织活检病理切片免疫荧光染色试剂盒，包括细胞固定液、细胞封闭液、洗涤液、稀释液、细胞膜与细胞核膜通透液、细胞核荧光染料DAPI、细胞核仁标志分子的荧光标记单克隆抗体、伊红染料。

具体情况下，所述细胞固定液选自甲醇、丙酮、多聚甲醛中的一种或多种。

具体情况下，所述细胞封闭液为含0.5-10.0％BSA或小牛血清的pH7.2-7.4PBS。

具体情况下，所述洗涤液为含吐温-20的pH7.2-7.4PBS。

具体情况下，所述稀释液为含0.1-1.5％BSA或小牛血清的pH7.2-7.4PBS。

具体情况下，所述细胞膜与细胞核膜通透液为曲拉通X-100。

具体情况下，所述细胞核仁标志分子的荧光标记单克隆抗体为标记红色荧光染料。进一步地，红色荧光染料采用Alexa

根据本发明的第二方面，提供一种组织切片免疫荧光染色方法，包括以下步骤：

(1)制备组织切片，包括石蜡切片或冰冻切片；

(2)用细胞固定液固定组织细胞；

(3)用洗涤液清洗1-3次；

(4)用细胞膜与细胞核膜通透液与组织切片温育10-20分钟，弃净液体；

(5)用细胞封闭液封闭10-20分钟，弃净液体；

(6)加红色荧光标记的核仁蛋白单克隆抗体和核仁纤维蛋白单克隆抗体，35-40℃染色30-60分钟；弃净液体，用洗涤液漂洗1-3次；

(7)用荧光染料DAPI复染10-15分钟；

(8)用洗涤液漂洗细胞片1-3次待干；

(9)加伊红染料染5-10分钟，洗涤液漂洗1-3次；

(10)待干、封片、荧光显微镜观察。

本发明使用荧光标记的核仁纤维蛋白等单克隆抗体对核仁进行特征性染色，将细胞的核仁染成红色；用DAPI荧光染料将细胞核染成蓝色；再用伊红染料复染，将细胞浆或细胞表面染成绿色，并将弹力纤维或胶原纤维染成绿色或黄绿色。荧光显微镜下除了可以清楚看到细胞核和细胞浆完整结构和病理改变时细胞的体积大小、细胞核的体积大小、核浆比例等病理改变外，还可清楚看到核仁的结构、核仁的形态大小、核仁的分布和数量多少，从而为病理诊断提供了一个恶性病理特征性分析的可靠方法与试剂。

本发明的关键技术和技术效果：

(1)细胞核仁和细胞核的形态与结构：用荧光标记的细胞核仁标志性分子(如核仁纤维蛋白等)的单克隆抗体将细胞核仁染成红色；用DAPI将细胞核染成蓝色或紫蓝色。在荧光显微镜下将两种颜色重合、将细胞核仁和细胞核染色结构叠加，清晰可见蓝色的细胞核内显示红色的细胞核仁。

(2)细胞浆或细胞表面结构：常规使用的伊红染料可和细胞浆中各种蛋白质结合，所以常规病理切片细胞浆染成红色，而在本发明中，伊红染料在荧光纤维镜下发出绿色荧光，细胞浆或细胞表面显示绿色荧光。

(3)弹力纤维或胶原纤维被伊红染料绿色或黄绿色。

(4)切片组织结构和细胞图像清晰，非恶性细胞体积正常，细胞核规则，核浆比正常，核仁多为1个，少数为2个或不见核仁，核仁形态规则；而恶性细胞的细胞体积大，细胞核大，细胞核浆比失调，核仁畸形，核仁数量为≥3个，与正常细胞形成明显区别。特别是可以清楚看到细胞的核仁体积大小、形态、数目和分布。本染色方法改变了传统病理切片染色和诊断方法。细胞核仁是细胞的核心，是细胞发育、分化和增殖的关键功能部位，而恶性病变的基础是细胞核仁的病理变化，核仁数量增多(≥3个)，核仁大而形态不规则。由本发明染色试剂盒和染色方法染出的病理切片色彩鲜艳，正常细胞和病理细胞区别明显，减少检验者做出监测结果的困扰。

附图说明

图1为实施例1的组织病理切片染色结果荧光显微照片。

图2为实施例2的组织病理切片染色结果荧光显微照片。

具体实施方式

具体实施例中所使用的试剂包括：

细胞固定液：甲醇、丙酮、多聚甲醛。

细胞封闭液包括：pH7.2-7.4PBS(含0.5-10.0％BSA或小牛血清)。

洗涤液包括：pH7.2-7.4PBS(含吐温-20)。

稀释液包括：pH7.2-7.4PBS(含0.1-1.5％BSA或小牛血清)。

细胞膜与细胞核膜通透液包括：曲拉通X-100。

标记红色荧光(Alexa

细胞核荧光染料DAPI。

伊红溶液。

其它试剂：磷酸缓冲液(PBS)、小牛血清白蛋白(BSA)、驴血浆(清)、吐温-20、Tris-Hcl等。

实施例1：常规石蜡病理切片

(1)60℃烤片2小时。

(2)二甲苯浸泡两次，各10分钟。

(3)100％、90％、80％、70％酒精各5分钟，自来水冲洗5分钟×3。自然干燥备用。

(4)组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复(中火10min)。自然冷却后将玻片置于PBS中晃动洗涤3次，每次5min。

(5)用甲醇和4％多聚甲醛分别固定组织细胞，各10分钟。

(6)用洗涤液(pH7.2-7.4PBS(含吐温-20))清洗1-3次。

(7)用0.05％曲拉通X-100与组织切片温育(37℃)10-20分钟，弃净液体。

(8)用含0.5％BSA的pH7.2-7.4PBS封闭10-20分钟(37℃)，弃净液体。

(9)加红色荧光标记的核仁蛋白单克隆抗体和核仁纤维蛋白单克隆抗体，37℃染色30-60分钟。弃净液体，用洗涤液pH7.2-7.4PBS(含吐温-20)漂洗3次。

(10)用荧光染料DAPI复染10分钟。

(11)用洗涤液pH7.2-7.4PBS(含吐温-20)，漂洗细胞片3次待干。

(12)加伊红染料染5-10分钟，pH7.2-7.4PBS漂洗3次。

(13)待干、封片、荧光显微镜观察。

(14)荧光显微镜下：组织结构清晰，细胞核仁显红色、细胞核显蓝色、细胞浆和细胞膜(或细胞表面)显绿色；组织纤维(弹力纤维、胶原纤维)显绿色或黄绿色。

实施例2：冰冻切片染色

(1)新鲜组织处理后，立即在恒冷冰冻切片机内切片，厚度为5～6微米。

(2)将切片组织贴在防脱玻片上，待干。

(3)甲醇固定10min。

(4)4％多聚甲醛固定10min。

(5)PBS漂洗3次×5min。

(6)用0.5％曲拉通X-100与组织切片温育(37℃)10-20分钟，弃净液体。

(7)用含10％BSA的pH7.2-7.4PBS封闭10-20分钟(37℃)，弃净液体。

(8)加红色荧光标记的核仁蛋白单克隆抗体和核仁纤维蛋白单克隆抗体，37℃染色30-60分钟。弃净液体，用洗涤液pH7.2-7.4PBS(含吐温-20)漂洗3次。

(9)用荧光染料DAPI复染10分钟。

(10)用洗涤液pH7.2-7.4PBS(含吐温-20)，漂洗细胞片3次待干，

(11)加伊红染料染5分钟，pH7.2-7.4PBS漂洗3次。

(12)待干、封片、荧光显微镜观察。

(13)荧光显微镜下：组织结构清晰，细胞核仁显红色、细胞核显蓝色、细胞浆(或细胞表面)显绿色；组织纤维(弹力纤维、胶原纤维)显绿色或黄绿色。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。