一种半夏白术天麻汤中挥发性成分的气相特征图谱的构建方法

技术领域

本发明属于中药质量检测技术领域，具体涉及一种半夏白术天麻汤中挥发性成分的气相特征图谱的构建方法。

背景技术

半夏白术天麻汤出自《医学心悟》，由半夏、天麻、白术、橘红、茯苓、甘草、生姜、大枣8味药组成，具有祛风化痰、健脾止晕之效，是治疗眩晕的经典方，主要适用于风痰上扰证、痰浊中阻证所致眩晕。方中以半夏燥湿化痰，降逆止呕；天麻平肝熄风而止眩晕，二者合用为君，乃治疗风痰眩晕头痛之要药。白术健脾燥湿；茯苓健脾渗湿，佐治生痰之本，与半夏、天麻配伍，加强化痰息风之力，共为臣药。橘红理气化痰，使气顺痰消，为佐药。使以甘草调和诸药，煎加生姜、大枣调和脾胃。诸药相合，共奏化痰熄风、健脾祛湿之功效。

根据文献调研判断，半夏白术天麻汤中挥发性成分与该方理气化痰、健脾的功效直接相关。中药特征图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其中各种组分群特征的共有峰的图谱，是一种新的中药质量控制模式。通过特征图谱所具有的特征性，能有效鉴别中药的真伪；通过特征图谱主要特征峰的面积和占比的规定，能有效控制中药质量。随着《中国药典》版本的逐步更新，已增加收录多个品种的特征图谱检测方法，将特征图谱作为控制指标后，可保证中药、中成药整体质量的相对稳定。

经文献检索，关于半夏白术天麻汤中各药味化学成分控制的相关报道较少，其中以HPLC法对半夏白术天麻汤中的各化学成分含量或整体质量(指纹图谱)的控制为主，缺少对半夏白术天麻汤中挥发性成分的控制方法。半夏白术天麻汤由半夏、白术、橘红、甘草、天麻、茯苓、生姜、大枣8味中药组成，本处方中含挥发性成分药味较多，挥发性成分组成复杂，且极性较大，紫外吸收较弱，沸点较低。其中3个药味含有挥发性成分，白术含苍术酮等成分，橘红和生姜均含柠檬烯等成分，因此，目前亟需建立一种对半夏白术天麻汤中的挥发性成分进行检测或控制的方法。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供一种半夏白术天麻汤中挥发性成分的特征图谱及其建立方法，该方法根据半夏白术天麻汤的特点，建立该品种的特征图谱，实现挥发性成分对应的各特征峰的有效分离，为全面建立半夏白术天麻汤的质量控制标准提供科学依据。

本发明提供了一种半夏白术天麻汤中挥发性成分的气相特征图谱的构建方法，包括如下步骤：

供试品溶液的制备；

气相色谱法检测：采用气相色谱法利用程序升温的方式测定供试品溶液，得到特征图谱；所述程序升温方式包括：

1)初始温度35～80℃保持6～10min；

2)以2.8～3.2℃/min升至110～130℃，保持9～11min；

3)以1～2℃/min升至140～180℃，保持0～20min；或者，以1～3℃/min升至135～140℃，保持10～20min；再以0.5～4℃/min升至150～200℃，保持0～10min；

4)以2-5℃/min升至210-230℃，保持5-10min。

进一步地，所述供试品溶液的制备方法为采用萃取剂对供试品进行萃取，取萃取剂层，即得供试品溶液；优选的，萃取剂选自乙酸乙酯或者正己烷，优选的，萃取剂与供试品的体积比为5:30-80。

进一步地，所述供试品溶液的制备方法包括：取供试品和乙酸乙酯混合，利用水蒸气蒸馏法提取挥发油，收集乙酸乙酯层，即得；

为了提高特征峰个数，丰富特征图谱信息，优选的，所述供试品和乙酸乙酯的体积比为200～2600：0.5～1.5；更优选为400～600：0.5～1.5；

优选的，水蒸气蒸馏时连接回流冷凝管，将溶液加热至微沸，并保持4-6小时；

优选的，收集乙酸乙酯层后还包括加乙酸乙酯稀释和/或滤过的步骤。

进一步地，所述程序升温方式包括：所述程序升温方式包括：

初始温度70℃保持8min；以3℃/min升至120℃，保持10min；以2℃/min升至135～140℃，保持15～20min；以0.5-4℃/min升至155-200℃，保持0-10min，再以2-5℃/min升至220℃，保持5-10min；或者，所述程序升温方式包括：初始温度70℃保持8min；以3℃/min升至120℃，保持10min；以1～2℃/min升至140～180℃，保持0～20min；以3.2-5℃/min升至220℃，保持10min。

进一步地，所述程序升温方式包括：

初始温度70℃保持8min；以3℃/min升至120℃，保持10min；以2℃/min升至140℃，保持15min；以4℃/min升至200℃，保持10min，再以2℃/min升至220℃，保持5min。

进一步地，气相色谱检测过程中，进样口温度为235～245℃，检测器温度为295～305℃，载体流速为1.4～1.6ml/min。

进一步地，所述的构建方法还包括采用溶剂溶解柠檬烯、苍术酮中的至少一种制备对照品溶液的步骤，以及按照上述任一所述的构建方法中的气相色谱法检测对照品溶液得到对照品参照图谱的步骤，优选地，所述溶剂选自甲醇、乙醇和水中的至少一种；每毫升所述对照品溶液中含50-70μg的柠檬烯和/或80-120μg的苍术酮。

进一步地，所述气相特征图谱具有8个特征峰，与柠檬烯参照物峰相应的峰为S1峰，与苍术酮参照物峰相应的峰为S2峰，峰1-峰4与S1峰的相对保留时间以及峰5-峰6与S2峰的相对保留时间均在规定值的±10％的范围之内，规定值为：0.43(峰1)、0.64(峰2)、1.00(峰3)、3.14(峰4)、1.00(峰5)、1.23(峰6)、1.26(峰7)、1.58(峰8)。

进一步地，所述半夏白术天麻汤包含半夏、天麻、白术、橘红、茯苓、甘草、生姜和大枣，优选地，按照重量份数计，所述半夏白术天麻汤包含4.5-6.7份的半夏、3.0-4.5份的天麻、9.0-13.4份的白术、3.0-4.5份的橘红、3.0-4.5份的茯苓、1.5-2.2份的甘草、0.8-1.2份的生姜和4.8-7.2份的大枣。

本发明还提供了一种半夏白术天麻汤的质量检测方法，包括将待测半夏白术天麻汤产品的气相特征图谱与半夏白术天麻汤的对照特征图谱进行比较的步骤，所述待测半夏白术天麻汤产品的特征图谱为使用待测半夏白术天麻汤产品按上述任一所述的构建方法构建得到，所述半夏白术天麻汤对照特征图谱选自如下(1)-(3)中的任意一项：

(1)其具有8个特征峰，与柠檬烯参照物峰相应的峰为S1峰，与苍术酮参照物峰相应的峰为S2峰，峰1-峰4与S1峰的相对保留时间以及峰5-峰6与S2峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内，规定值为：0.43(峰1)、0.64(峰2)、1.00(峰3)、3.14(峰4)、1.00(峰5)、1.23(峰6)、1.26(峰7)、1.58(峰8)；

(2)使用单批次或者多批次半夏白术天麻汤按照上述任一所述的构建方法得到的半夏白术天麻汤的特征图谱；

(3)使用多批次半夏白术天麻汤按照上述任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。

气相色谱法采用固定相为(14％-氰丙基-苯基)甲基聚硅氧烷的色谱柱。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的半夏白术天麻汤中挥发性成分的气相特征图谱的构建方法，采用气相色谱法利用下述程序升温的方式测定供试品溶液：1)初始温度35～80℃保持6～10min；2)以2.8～3.2℃/min升至110～130℃，保持9～11min；3)以1～2℃/min升至140～180℃，保持0～20min；或者，以1～3℃/min升至135～140℃，保持10～20min；再以0.5～4℃/min升至150～200℃，保持0～10min；4)以2-5℃/min升至210-230℃，保持5-10min，建立了半夏白术天麻汤中挥发性成分的特征图谱，实现了多个特征峰的有效分离，而且得到的特征图谱基线平稳，特征峰峰形好，该方法稳定可靠、耐用性好、专属性高，对该品种的质量检测和评价具有指导意义。

2.本发明提供的半夏白术天麻汤中挥发性成分的气相特征图谱的构建方法，所述程序升温方式包括：初始温度70℃保持8min；以3℃/min升至120℃，保持10min；以2℃/min升至135～140℃，保持15～20min；以0.5-4℃/min升至155-200℃，保持0-10min，再以2-5℃/min升至220℃，保持5-10min；或者，所述程序升温方式包括：初始温度70℃保持8min；以3℃/min升至120℃，保持10min；以1～2℃/min升至140～180℃，保持0～20min；以3.2-5℃/min升至220℃，保持10min，尤其是采用所述程序升温方式包括：初始温度70℃保持8min；以3℃/min升至120℃，保持10min；以2℃/min升至140℃，保持15min；以4℃/min升至200℃，保持10min，再以2℃/min升至220℃，保持5min，进一步提高了特征峰分布的均匀性和分离度，实现了柠檬酸和苍术酮的有效分离，准确定位柠檬酸和苍术酮的峰位置，充分的反映半夏白术天麻汤的整体性和特征性。

3.本发明提供的半夏白术天麻汤中挥发性成分的气相特征图谱的构建方法，可采用萃取和水蒸气蒸馏法制备供试品溶液，尤其是通过水蒸气蒸馏法从半夏白术天麻汤中提取挥发性成分，再经乙酸乙酯收集制备得到供试品溶液含有更多挥发性成分；取柠檬烯、苍术酮对照品经甲醇溶解制得参照物溶液；经气相色谱仪检测得特征图谱，该特征图谱中各色谱峰可归属于处方中白术、橘红、生姜3个药味，可有效对半夏白术天麻汤中挥发性成分进行整体控制，对半夏白术天麻汤挥发性成分特征图谱中的色谱峰进行归属和分析，确定半夏白术天麻汤挥发性成分特征图谱中呈现的色谱峰主要来自于白术、橘红、生姜3个药味，其中特征峰1～4为橘红专属性成分，特征峰5～8为白术专属性成分，生姜专属性成分峰面积较小，未选作为特征峰。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中单倍处方量煎液色谱条件优化实验获得的图谱，由下至上依次为：空白(乙酸乙酯)、供试品溶液方法1、供试品溶液方法2、供试品溶液方法3的图谱；

图2为本发明实施例1中多倍处方量煎液色谱条件优化实验中方法3获得的图谱；

图3为本发明实施例1中多倍处方量煎液色谱条件优化实验中方法4-6获得的图谱，由下至上依次为：方法6、方法5、方法4；

图4为本发明实施例1中多倍处方量煎液色谱条件优化实验中方法7-11获得的图谱，由下至上依次为：方法11、方法10、方法9、方法8、方法7。

图5为本发明实施例1中溶剂萃取法考察结果，由下至上依次为：正己烷、乙酸乙酯、甲醇、苍术酮对照品溶液、柠檬烯对照品溶液、供试品1、供试品2；

图6为本发明实施例1中蒸馏法考察结果，由下至上依次为：乙酸乙酯、供试品3、苍术酮对照品溶液、柠檬烯对照品溶液；

图7为提取次数考察对比图，由下至上依次为：乙酸乙酯、提取第一次、提取第二次；

图8为特征图谱化学成分确认色谱图，由下至上依次为：空白(乙酸乙酯)、苍术酮对照品、柠檬烯对照品、半夏白术天麻汤冻干粉、半夏白术天麻汤煎液；

图9为白术药味峰归属考察谱图，由下至上依次为：空白(乙酸乙酯)、空白(甲醇)、柠檬烯与苍术酮混合对照品溶液、白术单味21120101、半夏白术天麻汤(缺白术)21120104、半夏白术天麻汤；

图10为橘红药味峰归属考察谱图，由下至上依次为：空白(乙酸乙酯)、空白(甲醇)、柠檬烯与苍术酮混合对照品溶液、橘红单味21113003、半夏白术天麻汤(缺橘红)21113006、半夏白术天麻汤；

图11生姜药味峰归属谱图，由下至上依次为：空白(乙酸乙酯)、空白(甲醇)、柠檬烯与苍术酮混合对照品溶液、生姜单味21120102、半夏白术天麻汤(缺生姜)21120105、半夏白术天麻汤；

图12为专属性对比图，由下至上依次为：空白(乙酸乙酯)、空白(甲醇)、柠檬烯与苍术酮混合对照品溶液、半夏白术天麻汤21121001；

图13为稳定性考察对比图，由下至上依次为：空白、0h、7h、14h、21h、29h；

图14为载气流速考察对比图，由下至上依次为：载气流速为1.4ml/min、1.6ml/min、1.5ml/min；

图15为检测器温度考察对比图，由下至上依次为：检测器温度300℃、295℃、305℃；

图16为进样口温度考察对比图，由下至上依次为：进样口温度240℃、235℃、245℃；

图17为不同仪器-色谱柱耐用性考察对比图，S1～S3依次为：赛默飞仪器-色谱柱FX-GC-007、赛默飞仪器-色谱柱FX-186、安捷伦仪器-色谱柱FX-GC-007；

图18为15批半夏白术天麻汤挥发性成分特征图谱检测结果对比；

图19为15批半夏白术天麻汤挥发性成分拟合对照特征图谱。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1特征图谱的构建

1、色谱条件的考察

(1)试药

半夏白术天麻汤煎液采用现有常规方法制得，例如本发明中的半夏白术天麻汤煎液可采用如下处方和方法制备得到，处方：清半夏5.60g、天麻3.73g、白术11.19g、茯苓3.73g、橘红3.73g、甘草1.87g、生姜1.0g、大枣6.0g。制法：以上药味，加水煎煮两次，第一次加12倍量水煎煮30分钟，第二次加10倍量水煎煮25分钟，煎液滤过，合并滤液，即得。倍量是指每克药材中加入水的毫升数。

(2)单倍处方量煎液色谱条件优化

供试品溶液制备：取半夏白术天麻汤煎液260ml，置圆底烧瓶中，连接挥发油测定器，自测定器上端加水至刻度并溢流入烧瓶时为止，再加乙酸乙酯1ml，连接回流冷凝管，加热至微沸，并保持5小时，放冷，分取乙酸乙酯层0.5ml，加入1ml乙酸乙酯稀释，混匀后过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

对供试品溶液和空白(乙酸乙酯)进行气相色谱检测，使用安捷伦色谱柱(DB-1701毛细管柱〔14％-氰丙基-苯基甲基聚硅氧烷为固定相〕，柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚度为0.25μm)，供试品溶液分别按照表1方法1-3的色谱条件进行测试，空白(乙酸乙酯)按照表1的方法3的色谱条件进行测试，进样量均为1微升。

表1单倍处方量煎液色谱条件优化

表2方法1色谱峰信息

表3方法2色谱峰信息

表4方法3色谱峰信息

上述三种方法对供试品进行检测后，对比图见图1所示。方法1-3的特征峰个数较少，峰信息不足，无法鉴别有效成分柠檬烯和苍术酮。相比于方法1和2来说，方法3中供试品色谱图中各较大色谱峰分布较均匀，分离度较好，且总检测时长较短，节省检测时间，故后续继续进行优化。

(3)多倍处方量煎液色谱条件优化

多倍处方量煎液的制备：处方：清半夏5.60g、天麻3.73g、白术11.19g、茯苓3.73g、橘红3.73g、甘草1.87g、生姜1.0g、大枣6.0g。制法：以上药味，加水煎煮两次，第一次加12倍量水煎煮30分钟，第二次加10倍量水煎煮25分钟，煎液滤过，合并滤液，得到1份煎液。同法制备5份，混匀，即得。

供试品溶液制备：取半夏白术天麻汤煎液2550ml，置圆底烧瓶中，连接挥发油测定器，自测定器上端加水至刻度并溢流入烧瓶时为止，再加乙酸乙酯1ml，连接回流冷凝管，加热至微沸，并保持5小时，放冷，分取乙酸乙酯层，即得。

气相色谱检测，使用安捷伦色谱柱(DB-1701毛细管柱〔14％-氰丙基-苯基甲基聚硅氧烷为固定相〕，柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚度为0.25μm)，分别按照表1方法3的色谱条件和表2的色谱条件进行测试，进样量均为1微升。

表5多倍处方量煎液色谱条件优化

表6方法7色谱峰信息

表7方法8色谱峰信息

表8方法9色谱峰信息

表9方法10色谱峰信息

表10方法11色谱峰信息

方法3得到的色谱图见图2所示，方法4-6得到的色谱图如下图3所示，方法7-11得到的色谱图见图2所示。结果显示，方法3得到的色谱峰集中在30-35min之间，分离度差，各色谱峰在特征图谱中的分布均匀度也较差，经方法4-6的改善，原集中在30-35min出峰的色谱峰保留时间延长至40-60min，分离度得到了一定改善，但仍需进一步降低升温速度对该部分色谱峰进行分离，以提高色谱峰分离度及色谱峰分布的均匀度。经研究发现，升高初始温度至70℃，溶剂峰可在0-5min出峰，柠檬烯出峰位置在10min左右，因此，初始温度优选为70℃，最终温度升至220℃时已基本无明显色谱峰，因此最终温度优选为220℃。

方法7-11与方法3-6比较可知，方法7-11继续降低120℃～180℃的升温速度，可以提高图谱中部较多色谱峰分离度。方法7-11中色谱峰分布均匀性明显提高，从整体色谱峰分布来看，上述方法11为半夏白术天麻汤挥发性成分检测最优方法。

2.提取方法的考察

(1)供试品提取方法的考察

对半夏白术天麻汤中的挥发性成分，分别采用溶剂萃取法和蒸馏法提取。

①溶剂萃取法：取半夏白术天麻汤2份，各50ml，一份加正己烷5ml萃取1次，收集正己烷层，得供试品1；一份加乙酸乙酯5ml萃取1次，收集乙酸乙酯层，得供试品2。

②蒸馏法：取半夏白术天麻汤煎液510ml(相当于单倍处方量)，置圆底烧瓶中，连接挥发油测定器，自测定器上端加水至刻度并溢流入烧瓶时为止，再加乙酸乙酯1ml，连接回流冷凝管，加热至微沸，并保持5小时，放冷，分取乙酸乙酯层约0.5ml，加入1ml乙酸乙酯稀释，混匀后过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，得供试品3。

柠檬烯对照品溶液：取柠檬烯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含柠檬烯0.06mg的溶液，即得。

苍术酮对照品溶液：取苍术酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含苍术酮0.1mg的溶液，即得。

将上述3种供试品、溶剂正己烷、乙酸乙酯、甲醇，以及苍术酮对照品溶液、柠檬烯对照品溶液分别采用本实施例中方法11的色谱条件下检测，结果如下图5～图6。结果显示，去除空白溶剂中的色谱峰后，正己烷萃取液(供试品1)中存在的色谱峰较少，说明半夏白术天麻汤中成分在正己烷中溶解度较低；相比之下乙酸乙酯萃取液(供试品2)中存在较多色谱峰，其中经对照品定位，确定含有柠檬烯；由图6可知，相比萃取方式，经蒸馏处理后得到的供试品3中含有更多挥发性物质，经对照品定位，可确定含有柠檬烯和苍术酮。

(2)供试品提取次数考察

以上结果确定蒸馏法可更好地达到半夏白术天麻汤中挥发性成分的提取及富集的目的，为考察煎液中挥发性成分是否提取完全，进行了提取次数的考察。

供试品溶液制备：取半夏白术天麻汤煎液510ml(相当于单倍处方量)，置圆底烧瓶中，连接挥发油测定器，自测定器上端加水至刻度并溢流入烧瓶时为止，再加乙酸乙酯1ml，连接回流冷凝管，加热至微沸，并保持5小时，放冷，分取乙酸乙酯层，即得第一次提取供试品；以上述提取后的剩余煎液为原料，同法提取第二次，得第二次提取供试品。将2次提取得到的供试品照本实施例中方法11的色谱条件下检测，结果如下表11和图7所示。

表11提取次数考察结果

计算公式：峰面积下降比例％＝(第一次提取峰面积-第二次提取峰面积)/第一次提取峰面积*100％

由上述结果可知，将进行过挥发油提取后的煎液再次蒸馏提取，得到的挥发性油中已知成分峰面积下降明显，第二次提取液中柠檬烯已无法检出，苍术酮峰面积相比第一次提取下降91.89％，说明这两个成分在一次提取5h过程中已基本提取完全；但第二次提取结果特征图谱中仍检出部分色谱峰(如图7中峰1等)，原因可能为：①该成分含量较高，一次提取未能将其提取完全；②该成分可能由煎液中其它成分转化而来，在提取中连续加热，可能导致继续发生转化反应。

(3)确定的供试品溶液制备方法

取半夏白术天麻汤煎液约500ml(相当于单倍处方量)，置圆底烧瓶中，连接挥发油测定器，自测定器上端加水至刻度并溢流入烧瓶时为止，再加乙酸乙酯1ml，连接回流冷凝管，加热至微沸，并保持5小时，放冷，分取乙酸乙酯层液，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

3、化学成分确认及峰归属

(1)化学成分确认

半夏白术天麻汤煎液：处方：清半夏5.60g、天麻3.73g、白术11.19g、茯苓3.73g、橘红3.73g、甘草1.87g、生姜1.0g、大枣6.0g。制法：以上药味，加水煎煮两次，第一次加12倍量水煎煮30分钟，第二次加10倍量水煎煮25分钟，煎液滤过，合并滤液，得到1份煎液。同法制备5份，混匀，即得。

半夏白术天麻汤煎液的冻干粉：处方：清半夏5.60g、天麻3.73g、白术11.19g、茯苓3.73g、橘红3.73g、甘草1.87g、生姜1.0g、大枣6.0g。制法：以上药味，加水煎煮两次，第一次加12倍量水煎煮30分钟，第二次加10倍量水煎煮25分钟，煎液滤过，合并滤液，得到煎液。所得煎液采用真空冷冻干燥机冻干，即得。

半夏白术天麻汤煎液的供试品溶液：取上述制得的半夏白术天麻汤煎液置圆底烧瓶中，连接挥发油测定器，自测定器上端加水至刻度并溢流入烧瓶时为止，再加乙酸乙酯1ml，连接回流冷凝管，加热至微沸，并保持5小时，放冷，分取乙酸乙酯液，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

半夏白术天麻汤煎液的冻干粉的供试品溶液：取上述制得的半夏白术天麻汤煎液的冻干粉置圆底烧瓶中，加水500ml，振摇混匀后，连接挥发油测定器，自测定器上端加水至刻度并溢流入烧瓶时为止，再加乙酸乙酯1ml，连接回流冷凝管，加热至微沸，并保持5小时，放冷，分取乙酸乙酯液，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

柠檬烯对照品溶液：取柠檬烯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含柠檬烯0.06mg的溶液，即得。

苍术酮对照品溶液：取苍术酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含苍术酮0.1mg的溶液，即得。

取半夏白术天麻汤煎液及冻干粉供试品溶液，与柠檬烯、苍术酮对照品溶液，按照实施例1第1(3)项下方法11检测方法检测，结果如下图8。供试品中含有与柠檬烯、苍术酮对照品保留时间一致的色谱峰，说明半夏白术天麻汤挥发性成分中含有柠檬烯和苍术酮。

(2)色谱峰归属

白术单味：处方：白术11.19g。制法：同半夏白术天麻汤制备方法。

半夏白术天麻汤(缺白术)：处方：清半夏5.60g、天麻3.73g、茯苓3.73g、橘红3.73g、甘草1.87g、生姜1.0g、大枣6.0g。制法：同半夏白术天麻汤制备方法。

橘红单味：处方：橘红3.73g。制法：同半夏白术天麻汤制备方法。

半夏白术天麻汤(缺橘红)：处方：清半夏5.60g、天麻3.73g、白术11.19g、茯苓3.73g、甘草1.87g、生姜1.0g、大枣6.0g。制法：同半夏白术天麻汤制备方法。

生姜单味：处方：生姜1.0g。制法：同半夏白术天麻汤制备方法。

半夏白术天麻汤(缺生姜)：处方：清半夏5.60g、天麻3.73g、白术11.19g、茯苓3.73g、橘红3.73g、甘草1.87g、大枣6.0g。制法：同半夏白术天麻汤制备方法。

半夏白术天麻汤：处方：清半夏5.60g、天麻3.73g、白术11.19g、茯苓3.73g、橘红3.73g、甘草1.87g、生姜1.0g、大枣6.0g。制法：以上药味，加水煎煮两次，第一次加12倍量水煎煮30分钟，第二次加10倍量水煎煮25分钟，煎液滤过，合并滤液，得到1份煎液。同法制备5份，混匀，即得。

柠檬烯与苍术酮混合对照品溶液：取柠檬烯、苍术酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含柠檬烯0.06mg、苍术酮0.1mg的混合溶液，即得。

取半夏白术天麻汤、白术单味、橘红单味、生姜单味、半夏白术天麻汤(缺白术)、半夏白术天麻汤(缺橘红)和半夏白术天麻汤(缺生姜)分别按按实施例1第2(3)项下制备半夏白术天麻汤挥发油(全方挥发油)、白术单味挥发油、橘红单味挥发油、生姜单味挥发油以及半夏白术天麻汤(缺白术)供试品溶液、半夏白术天麻汤(缺橘红)供试品溶液和半夏白术天麻汤(缺生姜)供试品溶液，然后将这些溶液与乙酸乙酯、甲醇、柠檬烯与苍术酮混合对照品溶液分别按照实施例1第1(3)项下方法11检测方法进行检测，结果如图9～图11。

对比图9和11可知，半夏白术天麻汤挥发性成分特征图谱中呈现的色谱峰主要来自于白术、橘红、生姜3个药味。

白术单味挥发油中呈现出较多色谱峰，主要集中在35～100min；对比缺味和全方结果，二者色谱峰个数及响应均存在明显差异，其中峰组1、峰组2、峰组3、峰组4等均仅在全方和单味中呈现，说明该部分色谱峰均为白术的专属性成分，峰组2中含有苍术酮。

橘红单味挥发油中呈现的色谱峰主要集中在0～35min，其中包括柠檬烯。对比缺味和全方结果，二者色谱峰个数及响应均存在一定差异，其中缺橘红中柠檬烯位置处无明显色谱峰，说明半夏白术天麻汤挥发油特征图谱中柠檬烯主要由橘红提供；此外，峰1、峰2、峰3在全方及单缺味供试品中均有呈现，说明该成分由橘红提供，但不是橘红的专属性成分；而峰4、峰5仅在单味及全方中呈现，说明这两个成分为橘红的专属性成分。

生姜单味挥发油中呈现的色谱峰主要集中在0～30min，对比缺味和全方结果，峰1、峰2仅在全方和单味中呈现，说明该成分为生姜的专属性成分。

4、15批半夏白术天麻汤挥发性成分特征图谱构建

取15批半夏白术天麻汤煎液，照确定的检测方法对挥发性成分特征图谱进行检测，结果对比如下图18。直观分析各批次特征图谱中呈现的色谱峰个数无明显差异，但色谱峰响应差异明显，以指纹图谱相似度或特征峰相对峰面积评价批间差异明显，原因为该检测方法供试品溶液制备过程中难以进行定量控制，因此对检测结果峰面积影响较大。半夏白术天麻汤挥发油为复杂的混合物质，以其所含成分种类进行定性控制可较为全面的评价其质量，因此初步确定以特征峰相对保留时间作为评价指标。

将15批半夏白术天麻汤挥发性成分特征图谱检测AIA数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本，国家药典委员会)”计算软件，参数设置为：数据剪切0-3min溶剂峰，以S1为参照图谱，生成方法为中位数，时间窗为0.1；多点校正(3)，峰面积占总峰面积0％以上的峰全峰匹配，生成15批半夏白术天麻汤挥发性成分拟合对照特征图谱，并匹配共有峰，选择对照特征图谱中占总峰面积2.5％以上的共有峰作为特征峰，标记为下图中峰1～峰8，根据挥发性成分特征图谱耐用性考察检测结果，不同仪器、色谱柱检测得到的特征图谱中各特征峰相对保留时间均未超过均值的±10％，因此拟定质量标准中规定值为耐用性项下均值，即供试品特征图谱中应呈现8个特征峰，与柠檬烯参照物峰相对应的峰为S1峰，与苍术酮参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰1～峰4与S1峰的相对保留时间，峰6～峰8与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.43(峰1)、0.64(峰2)、3.14(峰4)、1.23(峰6)、1.26(峰7)、1.58(峰8)。

统计15批半夏白术天麻汤基准样品挥发性成分特征图谱中各特征峰相对保留时间，结果如下表，15批基准样品特征图谱中各特征峰相对保留时间RSD值未超过0.1％，以相对保留时间评价各批次基准样品特征图谱间差异较小。

表12 15批基准样品特征图谱相对保留时间

实施例2方法学考察

按照《中国药典》2020年版通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则、《中国药典》中药质量标准研究制定技术要求等开展了方法学验证，结果该方法专属性、耐用性等均较好，可用作半夏白术天麻汤基准样品特征图谱检测。

A.专属性考察

取半夏白术天麻汤煎液，按确定的方法制备供试品溶液，并与空白溶剂(乙酸乙酯、甲醇)及柠檬烯与苍术酮混合对照品溶液分别进样检测，结果如图12。空白溶剂未在供试品色谱相应位置出峰，供试品色谱中能找到与柠檬烯、苍术酮保留时间一致的峰，说明本方法专属性良好。

B.耐用性考察

a.溶液稳定性

取半夏白术天麻汤煎液，按实施例1第2(3)项下确定的方法制备供试品溶液，分别在0h、7h、14h、21h、29h按照实施例1第1(3)项下方法11进样检测，记录色谱图。统计特征峰1～峰8的保留时间，以峰3(柠檬烯)为S1，计算峰1～峰4的相对保留时间；以峰5(苍术酮)为S2，计算峰6～峰8的相对保留时间，如图13所示。

结果：不同时间点测得的特征图谱中实验例1确定的8个特征峰相对保留时间RSD值均小于0.2％，相对峰面积RSD值均小于3.9％，说明供试品溶液在29h内稳定。

b.载气流速

考察方法中载气流速有小的变动时，对特征图谱测定结果的影响。

取半夏白术天麻汤煎液，按实施例1第2(3)项下确定的方法制备供试品溶液，设置色谱条件中载气流速为每分钟1.5±1ml，其余色谱条件均按照实施例1第1(3)项下方法11进样检测，记录色谱图。统计特征峰1～峰8的保留时间，以峰3(柠檬烯)为S1，计算峰1～峰4的相对保留时间；以峰5(苍术酮)为S2，计算峰6～峰8的相对保留时间，如图14所示。

结果：不同载气流速检测得到的特征图谱中实验例1确定的8个特征峰相对保留时间RSD值均小于2.4％，相对峰面积RSD值均小于2.0％，表明该方法在载气流速为每分钟1.4ml～1.6ml范围内变动时，耐用性较好。

c.检测器温度

考察方法中检测器温度有小的变动时，对特征图谱测定结果的影响。

取半夏白术天麻汤煎液，按实施例1第2(3)项下确定的方法制备供试品溶液，设置色谱条件中检测器温度为300±5℃，其余色谱条件均按照实施例1第1(3)项下方法11进样检测，记录色谱图。统计特征峰1～峰8的保留时间，以峰3(柠檬烯)为S1，计算峰1～峰4的相对保留时间；以峰5(苍术酮)为S2，计算峰6～峰8的相对保留时间，如图15所示。

结果：不同检测器温度检测得到的特征图谱中实验例1确定的8个特征峰相对保留时间RSD值均小于0.1％，相对峰面积RSD值均小于3.1％，表明该方法在检测器温度为295℃～305℃范围内变动时，耐用性较好。

d.进样口温度

考察方法中进样口温度有小的变动时，对特征图谱测定结果的影响。

取半夏白术天麻汤煎液，按实施例1第2(3)项下确定的方法制备供试品溶液，设置色谱条件中进样口温度为240±5℃，其余色谱条件均按照实施例1第1(3)项下方法11进样检测，记录色谱图。统计特征峰1～峰8的保留时间，以峰3(柠檬烯)为S1，计算峰1～峰4的相对保留时间；以峰5(苍术酮)为S2，计算峰6～峰8的相对保留时间，如图16所示。

结果：不同进样口温度检测得到的特征图谱中实验例1确定的8个特征峰相对保留时间RSD值均小于0.1％，相对峰面积RSD值均小于2.4％，表明该方法在进样口温度为235℃～245℃范围内变动时，耐用性较好。

e.不同编号色谱柱及不同品牌仪器耐用性

考察使用不同品牌仪器、相同品牌不同编号色谱柱对特征图谱的影响。

取半夏白术天麻汤煎液按实施例1第2(3)项下确定的方法制备供试品溶液，按照实施例1第1(3)项下方法11的色谱条件，用同一台仪器考察同一品牌不同编号的色谱柱(安捷伦DB-1701毛细管柱，30m*0.32mm，0.25μm，SN：US0363121H；安捷伦DB-1701毛细管柱，30m*0.32mm，0.25μm，SN：UST283827H)以及用同一根色谱柱考察不同品牌仪器(赛默飞Trace1300；安捷伦GC-7890B)对特征图谱的影响，记录色谱图。分别将使用不同仪器、色谱柱检测的特征图谱AIA数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本，国家药典委员会)”计算软件，参数设置为：数据剪切0-4min溶剂峰，以S1为参照图谱，生成方法为平均数，时间窗为0.1；多点校正(15)，峰面积占总峰面积0％以上的峰全峰匹配，生成耐用性考察结果对比图。统计特征峰1～峰8的保留时间，以峰3(柠檬烯)为S1，计算峰1～峰4的相对保留时间；以峰5(苍术酮)为S2，计算峰6～峰8的相对保留时间，如图17所示。

结果：不同品牌仪器、不同编号色谱柱的特征图谱中实验例1确定的8个特征峰相对保留时间RSD值均小于1.2％，受不同仪器及色谱柱影响，个别特征峰相对峰面积差异较大，但不影响整体特征峰的识别，表明不同品牌仪器、不同编号色谱柱对特征图谱结果影响较小。

C.理论板数的确定

分别计算不同仪器、色谱柱耐用性项下各特征图谱中柠檬烯峰理论板数，赛默飞仪器-色谱柱2的理论塔板数为90685，赛默飞仪器-色谱柱1的理论塔板数为88834，安捷伦仪器-色谱柱2的理论塔板数为80182，可知在确定的检测方法项下柠檬烯峰理论板数均大于80000，暂定以该理论板数下降50％为最低标准，来确定理论板数的限度，即按柠檬烯峰计算，理论板数应不低于40000。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。