一种三层结构的神经导管的制备方法及神经导管

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，进一步地说，是涉及一种三层结构的神经导管的制备方法及神经导管。

背景技术

由于我国目前临床上周围神经损伤病例已达2000万例，且每年以大约200万例的速度增加，周围神经损伤已成为神经修复领域研究的重大科学问题。临床上的“金标准”为自体移植；然而，自体移植物的来源有限、对供区损害、尺寸不匹配和二次手术等限制了其应用。因此，亟待开发人工神经导管支架作为替代物，以解决自体移植物的欠缺问题。

目前临床上可用的人工神经导管支架材料，主要起引导损伤的周围神经断端桥接，并在修复完成后降解的作用，但其生物活性低且鲜有生长因子或药物的加载，导致周围神经损伤的修复速度较慢。因此，开发具有修复周围神经损伤所需的微环境的神经导管，对于修复周围神经损伤极为重要。

近年来，针对神经导管的开发，研究人员进行了大量的创新性研究，然而负载生长因子或药物，并具有缓释作用的生物活性神经导管的制备方法较少，本发明构筑了一种三层结构的神经导管，加载含生长因子的核壳结构的微粒，在引导周围神经再生的同时，调控细胞微环境，招募雪旺细胞，引导轴突伸展，加速周围神经修复过程，从而促进周围神经再生；神经导管可被降解并被新生神经取代，或愈合后从周围神经表面降解分离。

发明内容

为解决现有技术中出现的问题，本发明提供了一种三层结构的神经导管的制备方法及神经导管。通过调控纺丝纤维拓扑结构，同时结合核壳结构的电喷微粒，实现生长因子或药物的缓释等效果，可解决目前研究存在的难点，从而高效地结合各项促进周围神经修复的诱导信号，有效地加快周围神经修复并提高修复效果，为进一步发展可临床转化使用的神经导管材料奠定基础。

在构筑加载电喷粒子的神经导管类型的选择上，由于其类细胞外基质结构的特性，静电纺丝纤维备受关注。多种材料均可通过静电纺丝技术制备形成神经导管用于周围神经损伤的修复，例如天然材料如胶原、明胶、壳聚糖等及合成材料如聚己内酯、聚乳酸、聚氨酯等。

单一结构的纺丝纤维支架往往无法修复较长距离的周围神经的损伤，因此通过调控纺丝纤维的表面拓扑结构和功能性，加入促进修复生长因子，赋予支架材料生物活性，并实现缓慢释放，是提高周围神经损伤的修复效果的关键及目前的研究热点。静电纺丝制备的纳米纤维支架的表面形貌对细胞的行为，包括黏附、迁移、增殖和分化具有调控的作用。取向的纤维结构可以诱导神经细胞沿着纤维的取向方向迁移，同时利于细胞的黏附和增殖。取向结构的纳米纤维相比于无规结构的纳米纤维，更加有利于促进轴突的伸展和活性粒子的有序释放。因此，利用静电纺丝的纳米纤维可以作神经组织工程支架，并且为周围神经的再生提供合适的微环境。

本发明的目的之一是提供一种三层结构的神经导管的制备方法。

所述方法包括：

步骤(1)、将可溶解的脂肪族聚酯或者可溶解脂肪族聚酯和天然高分子聚合物加入到溶剂A中，充分溶解，得到溶液D；

步骤(2)、将溶液D，采用高速转动的辊筒作为接收器进行静电纺丝后，得到取向结构的电纺纤维膜；

步骤(3)、天然高分子聚合物加入溶剂B得到壳层溶液E；生长因子加入溶剂C得到核层溶液F；壳层溶液E、核层溶液F同轴静电喷雾到步骤(2)得到的取向电纺纤维膜上，得到负载同轴电喷颗粒的电纺纤维膜；

步骤(4)、将溶液D静电纺丝沉积到步骤(3)得到负载同轴电喷颗粒负的电纺纤维膜上，形成三层结构的电纺纤维膜；

步骤(5)、将三层结构的电纺纤维膜卷曲、使用溶液D粘接电纺纤维膜，制得所述三层结构的神经导管。

本发明的一种优选的实施方式中，

步骤(1)，所述溶液D的质量浓度为3～20％；优选为5～15％；

以脂肪族聚酯为1重量份计，天然高分子聚合物的用量为0～100重量份；

所述溶剂A选自六氟异丙醇、三氟乙醇、三氯甲烷、甲醇、二氯甲烷、N，N'-二甲基甲酰胺中的至少一种；和/或，

可降解脂肪族聚酯为：聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物中的一种或组合；和/或，

天然高分子聚合物为：胶原、明胶、壳聚糖、淀粉、纤维素、弹性蛋白中的一种或组合。

本发明的一种优选的实施方式中，

所述生长因子为血管内皮生长因子、神经生长因子、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子中的一种或组合；

所述天然高分子聚合物为胶原、明胶、壳聚糖、淀粉、纤维素、弹性蛋白中的一种或组合；

本发明的一种优选的实施方式中，

步骤(3)，

所述溶剂B选自乙酸、六氟异丙醇、三氟乙醇、三氯甲烷、甲醇、二氯甲烷中的至少一种；

所述壳层溶液E的浓度为5～100ug/mL；优选为10-50mg/mL

所述溶剂C选自乙酸、水、乙醇、甲醇、生理盐水中的至少一种；

核层溶液F的浓度为1～100ug/mL；优选为20-50ug/mL。

本发明的一种优选的实施方式中，：

壳层溶液和核层溶液的用量比为(1～10)：1；优选为(2-5)：1；

电纺纤维膜与壳层溶液和核壳溶液之和的用量比为：1g:(5～100mL)；优选为1g:(50～100mL)。

本发明的一种优选的实施方式中，

步骤(4)，

负载同轴电喷颗粒的电纺纤维膜与溶液D用量比例为：1g：(1-50mL)；优选为1g：(20-50mL)。

本发明的一种优选的实施方式中，

步骤(2)的纺丝工艺条件：溶液D推进速率为0.1～5mL/h，电压8～25kV，辊筒转速100-3000rpm，接收距离为10～30cm，纺丝10～720min。

本发明的一种优选的实施方式中，

步骤(3)，所述的同轴静电喷雾中，壳层电喷溶液推进速率为0.3～6mL/h，核层电喷溶液推进速率为0.1～3mL/h，电压10～30kV，接收距离为10～30cm，喷雾1～360min。

本发明的一种优选的实施方式中，

步骤(4)，所述静电纺丝沉积于负载同轴电喷颗粒的电纺纤维膜，溶液D推进速率为0.1～6mL/h，电压8～25kV，接收距离为10～30cm，纺丝10～720min。

本发明的目的之二是提供一种三层结构的神经导管。

所述神经导管为三层结构，内层为取向结构的电纺纤维层，中间层结构为电喷粒子负载层，外层为无规的电纺纤维层。

神经导管的内径为0.5-2.0mm。

本发明具体可采用以下技术方案：

本发明所述的一种三层结构的神经导管包括内层、中间层和外层结构，所述内层结构为取向的电纺纤维层，中间层结构为电喷粒子负载层，其中，核壳结构的电喷粒子负载层，包括电喷粒子，所述的电喷粒子为核壳结构，其壳层为天然高分子聚合物所配制溶液，核层为生长因子所配制溶液。

所述的含生长因子的电喷粒子在中间层结构表面沉积浓度呈均匀分布。

以上所述聚合物为可降解的脂肪族聚酯或可降解的脂肪族聚酯与天然高分子材料的共混物。

以上所述聚合物纤维为均一厚度的可降解的脂肪族聚酯或可降解的脂肪族聚酯与天然高分子材料的共混物纤维。

以上所述内层结构为取向的电纺纤维层；

以上所述外层结构为无规的电纺纤维层；

本发明所述的一种三层结构的神经导管以修复周围神经损伤的制备方法，包括将包含有所述的可降解的脂肪族聚酯或其与天然高分子聚合物的共混物纤维的溶液静电纺丝形成内层取向结构的纤维层，将壳层为天然高分子聚合物材料或者可降解的脂肪族聚酯所配制的溶液，核层为生长因子所配制溶液，通过同轴静电喷雾在中间层结构形成核壳结构的微粒负载层，再将含有所述可降解的脂肪族聚酯溶液静电纺丝与负载层之上形成外层结构的无规取向纤维层，得到所述三层结构的神经导管以修复周围神经损伤。

本发明所述的制备方法具体包括以下步骤：

步骤(1)、将可溶解的脂肪族聚酯或者可溶解脂肪族聚酯和天然高分子聚合物加入到溶剂A中，充分溶解，得到溶液D；

步骤(2)、将步骤(1)得到的溶液D，使用高速转动的辊筒转速为100-3000rpm转速进行静电纺丝，得到的取向结构的电纺纤维膜；

步骤(3)、天然高分子聚合物加入溶剂B得到壳层溶液E；生长因子加入溶剂C得到核层溶液F；壳层溶液E、核层溶液F同轴静电喷雾到步骤(2)得到的取向电纺纤维膜上，得到负载同轴电喷颗粒的电纺纤维膜；

步骤(4)、将步骤(1)得到的溶液D，使用负载同轴电喷颗粒的电纺纤维膜为接收器，静电纺丝沉积到步骤(3)得到负载同轴电喷颗粒负的电纺纤维膜上，形成三层结构的电纺纤维膜；

三层结构的电纺纤维膜还需要静置样品2～3天以脱除溶剂；

步骤(5)、将三层结构的电纺纤维膜卷曲，溶液D粘接，制得所述三层结构的神经导管，神经导管的内径为0.5-2.0mm。

本发明提供的一种三层结构的神经导管的制备方法及神经导管以修复周围神经损伤，含有均匀沉积密度的核壳结构的电喷粒子，以促进细胞招募与迁移；含有促进周围神经修复生长因子的核壳结构的微粒，以通过生长因子的释放调控不同细胞的行为。具有优异的生物相容性和降解性能，可介导细胞的迁移增殖分化及轴突伸展，能加快轴突由近端向远端，并提高周围神经损伤的修复效果。

附图说明

图1是实施例1的步骤(2)所得内层取向结构的聚己内酯纳米纤维膜的SEM照片。

图2是实施例1步骤(4)所制得的神经导管的外层无规结构的聚己内酯纳米纤维膜的SEM照片。

具体实施方式

下面结合具体附图及实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。

实施例中所用原料均为市售。

实施例1

步骤(1).取聚己内酯溶于二氯甲烷中，室温磁力搅拌12h，得到质量浓度为11％的溶液D；

步骤(2).用溶液D进行静电纺丝，用转速为1500rpm的辊筒作为接收器，纺丝液推进速率为2.0mL/h，电压18kV，接收距离为20cm，纺丝720min，得到有序取向的聚己内酯纳米纤维膜；

步骤(3).取明胶溶解于乙酸水溶液中，室温磁力搅拌8h后充分混合，得到壳层溶液E，浓度为15mg/mL；取血管内皮生长因子加入到去离子水中，充分搅拌溶解得核层溶液F，浓度为40ug/mL；

更换纺丝液为壳层溶液E和核层溶液F，更换单轴纺丝针头为同轴针头，壳层溶液E注入壳层注射器，核层溶液F注入核层注射器；步骤(2)中得到的有序取向的聚己内酯纳米纤维膜作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为3.0mL/h，核层电喷溶液推进速率为1.0mL/h，电压16.0kV，接收距离为15.0cm，喷雾60min，得到负载同轴电喷颗粒的聚己内酯纤维膜；1.0g纤维膜需要核层溶液F用量20mL，壳层溶液E为50mL。

步骤(4).更换纺丝液为溶液D，更换同轴针头为单轴纺丝针头，在步骤(3)中得到的核壳结构的微粒上进行静电纺丝沉积，纺丝液推进速率为2.0mL/h，电压18kV，接收距离为20cm，纺丝360min，得到三层结构的聚己内酯纤维膜；

负载同轴电喷颗粒的电纺纤维膜与溶液D用量比为1g：30mL。

步骤(5).将三层结构的聚己内酯纤维膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。将三层结构的聚己内酯纤维膜卷曲，用溶液D粘接，制得三层结构的神经导管，内层为取向结构的聚己内酯纤维层，中间层结构为电喷粒子负载层，外层为无规的聚己内酯纤维层。神经导管内的直径为1.3mm。

实施例2

步骤(1).取聚乳酸溶于三氟乙醇中，室温磁力搅拌8h，得到质量浓度为9％的溶液D；

步骤(2).用溶液D进行静电纺丝，用转速为1500rpm的辊筒作为接收器，纺丝液推进速率为2.0mL/h，电压18kV，接收距离为20cm，纺丝720min，得到有序取向的聚乳酸纳米纤维膜；

步骤(3).取胶原蛋白溶解于乙酸水溶液中，室温磁力搅拌8h后充分混合，得到35mg/mL溶液E，取神经生长因子加入到无菌水中，充分搅拌溶解得到45ug/mL溶液F，1g聚乳酸纤维膜需要壳层溶液E为50mL，核层溶液F用量25mL；

更换纺丝液为壳层溶液E和核层溶液F，更换单轴纺丝针头为同轴针头，壳层溶液E注入壳层注射器，核层溶液F注入核层注射器；步骤(2)中得到的有序取向纤维作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为5.0mL/h，核层电喷溶液推进速率为2.0mL/h，电压17.0kV，接收距离为15.0cm，喷雾60min，得到负载同轴电喷颗粒的聚乳酸纳米纤维膜；

步骤(4).更换纺丝液为溶液D，更换同轴针头为单轴纺丝针头，在步骤(5)中得到的核壳结构的电喷粒子上进行静电纺丝沉积，纺丝液推进速率为1.0mL/h，电压18.0kV，接收距离为20.0cm，纺丝300min，得到三层结构的聚乳酸纤维膜；

负载同轴电喷颗粒的电纺纤维膜与溶液D用量比为1.0g：25mL；

步骤(5).将三层结构的聚乳酸纤维膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发，将三层结构的聚乳酸纤维膜卷曲，用溶液D粘接，制得三层结构的神经导管，它的内层为取向结构的聚乳酸纤维层，中间层结构为电喷粒子负载层，外层为无规的聚乳酸纤维层，神经导管内的直径为1.0mm。

实施例3

步骤(1).取聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于三氯甲烷中，室温磁力搅拌12h，得到质量浓度为10％的溶液D；

步骤(2).用溶液D进行静电纺丝，用转速为2000rpm的辊筒作为接收器，纺丝液推进速率为1.5mL/h，电压16.0kV，接收距离为16.0cm，纺丝720min，得到有序取向的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维膜；

步骤(3).取明胶溶解于三氯甲烷中，室温磁力搅拌8h后充分混合，得到35.0mg/mL壳层溶液E；取血管内皮生长因子、神经生长因子加入到乙醇中，充分搅拌溶解12h后充分混合，得到35.0ug/mL核层溶液F；

更换纺丝液为壳层溶液E和核层溶液F，更换单轴纺丝针头为同轴针头，壳层溶液E注入壳层注射器，核层溶液F注入核层注射器；步骤(3)中得到的有序取向纤维作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为3.0mL/h，核层电喷溶液推进速率为1.0mL/h，电压19.0kV，接收距离为13.0cm，喷雾30min，得到核壳结构的电喷微粒负载的纤维膜；1.0g取向纤维膜需要核层溶液F用量25mL，壳层溶液E为40mL。

步骤(4).更换纺丝液为溶液D，更换同轴针头为单轴纺丝针头，在步骤(3)中得到的核壳结构的电喷粒子上进行静电纺丝沉积，纺丝液推进速率为2.5mL/h，电压18.0kV，接收距离为20.0cm，纺丝360min，得到三层结构的电纺纤维膜；

负载同轴电喷颗粒的电纺纤维膜与溶液D用量比为1.0g：35mL；

步骤(5).将三层结构的电纺纤维膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发，将三层结构的电纺纤维膜卷曲，用溶液D粘接，制得三层结构的神经导管，它的内层为取向结构的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维层，中间层结构为电喷粒子负载层，外层为无规的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维层。神经导管内的直径为1.4mm。

实施例4

步骤(1).取聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于三氯甲烷中，室温磁力搅拌12h，得到质量浓度为7％的溶液D；

步骤(2).用溶液D进行静电纺丝，用转速为1000rpm的辊筒作为接收器，纺丝液推进速率为3.0mL/h，电压18.0kV，接收距离为15.0cm，纺丝600min，得到有序取向的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维膜；

步骤(3).取明胶、胶原溶解于三氯甲烷中，室温磁力搅拌8h后充分混合，得到25.0mg/mL壳层溶液E；取血管内皮生长因子、神经生长因子加入到乙醇中，充分搅拌溶解12h后充分混合，得到40.0ug/mL核层溶液F；

更换纺丝液为壳层溶液E和核层溶液F，更换单轴纺丝针头为同轴针头，壳层溶液E注入壳层注射器，核层溶液F注入核层注射器；步骤(3)中得到的有序取向纤维作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为4.0mL/h，核层电喷溶液推进速率为2.0mL/h，电压17.0kV，接收距离为16.0cm，喷雾30min，得到核壳结构的电喷微粒负载的纤维膜；1.0g取向纤维膜需要核层溶液F用量20mL，壳层溶液E为30mL。

步骤(4).更换纺丝液为溶液D，更换同轴针头为单轴纺丝针头，在步骤(3)中得到的核壳结构的电喷粒子上进行静电纺丝沉积，纺丝液推进速率为3.0mL/h，电压16.0kV，接收距离为20.0cm，纺丝300min，得到三层结构的电纺纤维膜；

负载同轴电喷颗粒的电纺纤维膜与溶液D用量比为1.0g：40mL；

步骤(5).将三层结构的电纺纤维膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发，将三层结构的电纺纤维膜卷曲，用溶液D粘接，制得三层结构的神经导管，它的内层为取向结构的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维层，中间层结构为电喷粒子负载层，外层为无规的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维层。神经导管内的直径为1.2mm。

实施例5

步骤(1).取聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物溶于二氯甲烷、N，N'-二甲基甲酰胺中，室温磁力搅拌24h，得到质量浓度为7％的溶液D；

步骤(2).用溶液D进行静电纺丝，用转速为2500rpm的辊筒作为接收器，纺丝液推进速率为2.0mL/h，电压20kV，接收距离为20cm，纺丝720min，得到有序取向的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纳米纤维膜；

步骤(3).取壳聚糖溶解于乙酸水溶液中，室温磁力搅拌24h后充分混合，得到壳层溶液E，浓度为25mg/mL；取血小板衍生生长因子加入到去离子水中，充分搅拌溶解得核层溶液F，浓度为30ug/mL；

更换纺丝液为壳层溶液E和核层溶液F，更换单轴纺丝针头为同轴针头，壳层溶液E注入壳层注射器，核层溶液F注入核层注射器；步骤(2)中得到的有序取向的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纳米纤维膜作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为5.5mL/h，核层电喷溶液推进速率为2.0mL/h，电压16.0kV，接收距离为15.0cm，喷雾80min，得到负载同轴电喷颗粒的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纤维膜；1.0g纤维膜需要核层溶液F用量30mL，壳层溶液E为60mL。

步骤(4).更换纺丝液为溶液D，更换同轴针头为单轴纺丝针头，在步骤(3)中得到的核壳结构的微粒上进行静电纺丝沉积，纺丝液推进速率为2.5mL/h，电压20kV，接收距离为20cm，纺丝360min，得到三层结构的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纤维膜；

负载同轴电喷颗粒的电纺纤维膜与溶液D用量比为1.0g：35mL。

步骤(5).将三层结构的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纤维膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。将三层结构的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纤维膜卷曲，用溶液D粘接，制得三层结构的神经导管，内层为取向结构的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纤维层，中间层结构为电喷粒子负载层，外层为无规的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纤维层。神经导管内的直径为1.2mm。

实施例6

步骤(1).取聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物溶于二氯甲烷、N，N'-二甲基甲酰胺中，室温磁力搅拌24h，得到质量浓度为7％的溶液D；

步骤(2).用溶液D进行静电纺丝，用转速为1800rpm的辊筒作为接收器，纺丝液推进速率为2.0mL/h，电压20kV，接收距离为20cm，纺丝720min，得到有序取向的聚己内酯纳米纤维膜；

步骤(3).取纤维素溶解于乙酸水溶液中，室温磁力搅拌24h后充分混合，得到壳层溶液E，浓度为30mg/mL；取表皮生长因子、血小板衍生生长因子加入到去离子水中，充分搅拌溶解得核层溶液F，浓度为25ug/mL；

更换纺丝液为壳层溶液E和核层溶液F，更换单轴纺丝针头为同轴针头，壳层溶液E注入壳层注射器，核层溶液F注入核层注射器；步骤(2)中得到的有序取向的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纳米纤维膜作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为6.0mL/h，核层电喷溶液推进速率为3.0mL/h，电压16.0kV，接收距离为15.0cm，喷雾60min，得到负载同轴电喷颗粒的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纤维膜；1.0g纤维膜需要核层溶液F用量40mL，壳层溶液E为70mL。

步骤(4).更换纺丝液为溶液D，更换同轴针头为单轴纺丝针头，在步骤(3)中得到的核壳结构的微粒上进行静电纺丝沉积，纺丝液推进速率为3.0mL/h，电压20kV，接收距离为20cm，纺丝360min，得到三层结构的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纤维膜；

负载同轴电喷颗粒的电纺纤维膜与溶液D用量比为1.0g：50mL。

步骤(5).将三层结构的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纤维膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。将三层结构的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纤维膜卷曲，用溶液D粘接，制得三层结构的神经导管，内层为取向结构的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纤维层，中间层结构为电喷粒子负载层，外层为无规的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纤维层。神经导管内的直径为1.35mm。