一种5’瓣状核酸酶及茎环适配子结构介导的等温扩增方法

技术领域

本发明涉及等温扩增方法技术领域，尤其涉及一种5’瓣状核酸酶及茎环适配子结构介导的等温扩增方法。

背景技术

近年来分子生物学技术有了迅猛的发展，为了适应不同环境、不同样本及不同目的的检测需求，多种等温扩增方法应运而生；其中，环介导等温扩增技术即LAMP和交叉引物等温扩增技术即CPA是其中应用最广的两种方案；

其中LAMP方法是Notomi等于2000年首先提出来的一种新的核酸扩增技术，它针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，包括2条内引物和2条外引物，利用具有链置换特性的Bst DNA聚合酶，在65℃条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列；

引物设计：针对靶基因3’端的F3c、F2c和Flc区及5’端的B1、B2和B3区6个特异位点设计4种引物，上游内引物FIP由Flc和F2组成，下游内引物BIP由Blc和B2组成，上游外引物F3与F3c互补，下游外引物B3与B3c互补；

哑铃状模板构造的形成：FIP引物中的F2序列与模板DNA上F2c结合，在链置换DNA聚合酶的作用下向前延伸并启动链置换反应，外引物F3与模板F3c区域结合，共同置换出FIP延伸的单链，此单链上F1C与F1互补，碱基配对形成环状结构。以此链为模板，BIP引物与其结合并延伸，同时环状结构被打开。随后，B3在聚合酶作用下置换出新的互补链，被置换的单链两端均存在互补序列，可发生自我碱基配对形成哑铃状DNA结构；

扩增循环：以哑铃状结构为模板，FIP与其F2c区结合开始链置换合成，通过再循环和延伸得到长度不同的DNA产物。整个过程在63℃左右45min～60min即可完成，扩增流程如图1所示；

CAP是2008年由优思达公司独立研发成功的一种新的核酸恒温扩增技术。它针对目的基因4或5个区域设计4或者5条特异性引物，利用具有链置换特性的Bst DNA聚合酶、甜菜碱，在63℃左右条件下进行高效、快速、高特异地扩增靶序列。

根据交叉引物数量的不同，CPA可分为双交叉扩增共4条引物＝2条交叉引物+2条剥离引物和单交叉扩增共5条引物＝1条交叉引物+2条剥离引物+2条普通引物；CPA在63℃左右进行，依赖Bst DNA聚合酶、甜菜碱和交叉引物，根据交叉引物数量的不同，可分为双交叉引物扩增和单交叉引物扩增；

双交叉引物扩增包括3对引物包含两条交叉引物、两条剥离引物和两条探针、BstDNA聚合酶、甜菜碱及其他必要成分；正向交叉引物中的1s与模板互补序列结合，在链置换DNA聚合酶的作用下完成延伸，剥离引物3s将合成的DNA单链置换下来，反向交叉引物2a与其结合并延伸，经剥离引物4a置换，即可产生带有交叉引物位点的扩增产物，以带有交叉引物位点的扩增产物为模板，通过交叉引物和DNA聚合酶的循环杂交、延伸，就可得到大量重复带有交叉位点的扩增产物；

单交叉引物扩增体系中只有一条交叉引物，首先交叉引物中的1s与模板互补序列结合延伸，剥离引物4s置换出新合成的单链，将2a引入到扩增产物中，在链置换DNA聚合酶作用下，以新合成的单链为模板，引入特异引物3a、2a，得到两条不同的单链DNA；2a和交叉引物分别与单链DNA产物迅速结合并延伸，形成两条不同长度的产物；以此产物为模版，引物1s或3a、2a与其结合、延伸，不断循环杂交，最终得到大量扩增产物，具体扩增流程如图2所示；

常规PCR技术存在以下缺陷：(1)PCR仪价格昂贵，对精良设备依赖度高；(2)影响扩增因素众多；(3)耗时较长等；因此限制了PCR技术在基层的推广使用；等温扩增技术是一类更具特色的核酸扩增技术，通过不同的酶和特异性引物在恒定温度下进行快速扩增，与PCR方法相比，等温扩增技术使用的仪器设备简单且扩增时间大大缩短，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。

发明内容

本发明目的是提供一种设计简单、特异性灵敏度高、假阳性低的等温扩增方法，以解决现有技术引物设计复杂、假阳性率高的问题。

本发明解决技术问题采用如下技术方案：一种5’瓣状核酸酶及茎环适配子结构介导的等温扩增方法，包括含有目的基因识别位点的茎环状适配子引物序列、外源引物组等；所用酶包括taq酶、Bst酶等，整个方法步骤如下：

S1、设计引物

针对目的基因设计引物，引物包含两对，分别为A/B和C/D；

A/B为外侧双向引物，引物长度为10-60nt，最佳为18-24nt，用于锚定目的基因，扩增子长度不限，以100bp-1Kb为佳，A/B结构可以无特殊修饰，也可以增加部分修饰以达到提高特异性、稳定引物结构的目的，例如硫代修饰等，A/B引物序列与C/D茎环结构区域无识别区域；

茎环状适配子引物包括三部分序列，自身成环的茎环结构stem-loop、一段适配子区域以及3’端与目的基因识别的引物即引物C/D，除引物C和D外，其余序列在目的基因上没有识别区域；

茎环状适配子引物结构如图3所示；

茎环结构和适配子区域可以为固定结构，也可以根据需要进行调整；

检测需要两个茎环状适配子引物，其中两个茎环状适配子引物的引物部分C和D，位于外侧双向引物A和B的扩增区域内，分别识别双链DNA的两条链。两个茎环状适配子引物分别标记为SLC和SLD；

两个茎环状适配子引物的适配子部分反向互补，两条链可识别并扩增。两适配子可以完全互补配对，也可以5’端部分游离，以选择最佳的退火Tm值；

茎环结构上设计等温扩增引物SLP，SLP可以是一个，也可以是多个；

设计等温扩增引物。等温扩增引物长度为10-60nt，最佳为18-24nt，与茎环结构部分区域反向互补。等温扩增引物可以是一个茎环结构一条，也可以是一个茎环结构多条，也可以是多个茎环结构多条；

S2、目的基因识别及探针置换、延伸，形成双端茎环结构

获得需要检测的样本DNA/RNA即为目的基因，DNA可直接用于后续检测，RNA需通过常见的反转录步骤获得对应cDNA后用于后续检测；

A/B引物对识别目的基因位点，并结合在目的基因上，在taq酶的作用下开始扩增；

SLC和SLD的3’端C、D引物序列分别识别目的基因位点，由于DNA聚合酶的5’FEN酶活性，SLC和SLD的茎环结构和适配子区域分别被切割并释放出来；

两个茎环结构和适配子区域序列3’端互补，在taq酶作用下延伸补平，形成双端茎环结构；

S3、等温扩增

SLP引物识别退火；加入等温扩增引物，开始哑铃状等温扩增；通过荧光或浊度仪鉴定扩增结果。

本发明具有如下有益效果通过5’FEN酶的内切酶作用和茎环结构适配子引物，实现由目的检测片段至哑铃状等温扩增的转换，达到指数级等温扩增检测要求，同时只需对目的基因设计两对或以上类巢式引物，即可达到特异性、灵敏度高的检测需求，无需设计繁琐的多引物对扩增，另外通过对外源DNA的结构设计，减少其非特异性扩增，达到降低假阳性的目的，具体如下：

1.减少引物对，降低设计难度

本发明无需设计多对引物，只要针对目的基因上下游分别设计两对或两对以上类似巢式扩增引物组即可，引物组的目的不是像LAMP或CPA的引物一样完成置换及形成哑铃状结构，只需达到以下要求即可：

A.特异性结合目的基因序列；

B.序列和环状茎环结构及适配子序列无错配，不能形成稳定的扩增结构，特别是3’端的几个碱基。

本发明中的引物组，主要起到对目的基因定位以及携带茎环适配子结构的作用，引物组中，外侧双向引物针对目的基因上下游特异性位点进行锚定，在DNA聚合酶作用下开始扩增；而内侧引物分别锚定双链DNA的两条链，分别位于A、B引物的3’下游；内侧引物3’端与目的基因特异性结合，5’端携带茎环适配子结构；

后续扩增中，只有引物组都与目的基因结合，茎环适配子结构才会被释放出来；因此特异性较常规qPCR会更高；另外由于内侧引物引入茎环适配子序列，为后续等温扩增提供哑铃状结构基础；

2.5’核酸内切酶作用

通过FAN酶的5’内切酶作用，将内引物对的茎环适配子部分与目的基因结合部分解离，释放的两个或多个茎环结构适配子部分可以互补结合，扩增后形成LAMP经典哑铃状结构，达到适合等温扩增的作用；

3.茎环适配子序列

本发明中茎环适配子序列，可自身成环；设计简便，可形成固定系统流程，方便规模化处理；

4.拓展

基于5’FEN酶及茎环适配子结构介导的等温扩增方案，可根据分析目的的不同设计针对性引物，满足不同的定性、定量检测需求。

附图说明

图1为LAMP方法扩增流程图；

图2为CAP方法扩增流程图；

图3为本发明中茎环状适配子引物结构图；

图4为本发明流程示意图；

图5为本发明实施例1的监测胶图；

图6为本发明实施例2的监测胶图；

图7为本发明实施例3的结果图表。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步阐述。

实施例1一种白色念珠菌的检测方法

1.针对白色念珠菌特异性区域，设计外侧引物对，引物序列为表1.1：

表1.1：

设计内侧引物对，内侧引物对可以设为1对，也可以根据位点特异性设置多对，本方案设计1对，引物序列为：表1.2

表1.2

其中，IF的GCAAGCCCTCACGTAGCGAA和IR的TTCGCTACGTGAGGGCTTGC部分为适配子序列，两适配子反向互补；IF的GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC和IRGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC部分为茎环结构；IF的3’端GTTTGGTGTTGAGCAATACGAga和IR的3’端GCAAGCAATGTTTTTGGTTAGtg序列为目的基因的结合序列，其中3’端两个碱基与目的序列不互补，以阻止序列扩增。

2.抽取样本

按照常规方法对样本DNA进行抽提，可以使用试剂盒，也可以采用经典抽提法，方法不限，以获得样本DNA为目的。

同时送测mNGS作为对照。

3.扩增

按表1.3配制taq酶反应体系

表1.3

65℃10-30min。

加入表1.4试剂：

表1.4

65℃30～60min；85℃5min失活。

4.鉴定

琼脂糖电泳检测：

根据图5，样本1-3均检出白色念珠菌，和mNGS结果一致

实施例2一种SNP的检测方法

1.针对rs1801133位点区域，设计外侧和内侧引物对，内侧引物对可以设为1对，也可以根据位点特异性设置多对，本方案设计1对，引物序列为：表2.1

表2.1

其中，IF的GCAAGCCCTCACGTAGCGAA和IR的TTCGCTACGTGAGGGCTTGC部分为适配子序列，两适配子反向互补；IF的GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC和IR的GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGAG部分为茎环结构；IF的3’端actgggcagagagagtccAG和IR的3’端ctttgaggctgacctgTC序列为目的基因的结合序列，其中3’端两个碱基与目的序列不互补，以阻止序列扩增。

2.样本抽取

三个样本，按照常规方法对样本DNA进行抽提，可以使用试剂盒，也可以采用经典抽提法，方法不限，以获得样本DNA为目的。

同时送测sanger测序作为对照。

3.扩增

按表2.2配制taq酶反应体系

表2.2

65℃10-30min。

加入表2.3内试剂

表2.3

65℃30～60min；85℃5min失活。

4.鉴定

琼脂糖电泳检测；

如图6所示，结果显示1为纯合子AA，2和3为纯合子GG，与一代测序结果一致。

实施例3一种RNA病毒的检测方法

1.针对甲流病毒特异性位点区域，设计外侧和内侧引物对，内侧引物对可以设为1对，也可以根据位点特异性设置多对，本方案设计1对，引物序列为表3.1：

表3.1

其中，IF的GCAAGCCCTCACGTAGCGAA和IR的TTCGCTACGTGAG GGCTTGC部分反向互补。IF的acgccgacggtggccaggaaccacgcgggctccttgggcc序列及IRagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatccc序列为识别探针；IF的3’端gac caatcctgtcacctctgGT和IR的3’端agggcattttggacaaagcgtcAC序列为目的基因的结合序列，其中3’端两个碱基与目的序列不互补，以阻止序列扩增。

2.样本抽取

Sample1-4按照常规方法对样本RNA进行抽提，可以使用试剂盒，也可以采用经典抽提法，方法不限，以获得样本RNA为目的。

同时送测mNGS作为对照。

3.扩增

反转录如表3.2

表3.2

50℃30min，94℃2min，置于冰上。

按表3.3配制taq酶反应体系：

表3.3

65℃10-30min。

加入表3.4内的试剂

表3.4

置于qPCR仪中，设置反应条件如下：65℃30～60min；85℃5min失活。

全程收集荧光信号。

4.鉴定

查看结果如图7所示。

根据检测结果，sample1-4均有检出，和mNGS结果一致。

以上实施例的先后顺序仅为便于描述，不代表实施例的优劣。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。