一种固定化碱性蛋白酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物催化技术领域，特别是涉及一种固定化碱性蛋白酶及其制备方法。

背景技术

蛋白酶作为一种生物催化剂，具有催化效率高、反应专一性强、有害副产物少、反应条件温和等许多优点。但是，蛋白酶作为一种蛋白质，其结构对外界环境十分敏感，易变性失活；即使是在最适宜的条件下，随着反应时间的延长，酶活力也在不断下降；而且蛋白酶一般是水溶性的，回收困难，增加了污染，这些缺点限制了其更广泛的应用。

固定化酶在一定空间内呈闭锁状态，有助于提高酶的稳定性，使酶的使用效率提高；反应后的固定化酶易于与底物和产物分开，可以反复利用；但是在固定化过程中酶蛋白活性构象往往发生变化，使固定化酶活力下降，如何提高固定化酶的活力，有待国内外学者对其进行研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种固定化碱性蛋白酶及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，使固定化碱性蛋白酶实现高负载、高稳定及高活性的技术目标。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种固定化碱性蛋白酶的制备方法，以贝壳中角质层和/或棱柱层为原料，煅烧得到贝壳粉；利用所述贝壳粉对碱性蛋白酶进行吸附，然后包裹于明胶/壳聚糖复合微囊中，得到所述固定化碱性蛋白酶。

进一步地，所述贝壳为马氏珠母贝贝壳。

进一步地，制备方法包括以下步骤：

(1)以贝壳中角质层和/或棱柱层为原料，煅烧得到贝壳粉；

(2)将所述贝壳粉与缓冲溶液、戊二醛水溶液混合，得到原料液；

(3)将碱性蛋白酶与所述原料液混合，冷冻干燥后得到固定化酶粗粉；

(4)将所述固定化酶粗粉的水悬浊液与明胶微囊混合，得到载碱性蛋白酶明胶微囊；

(5)将所述载碱性蛋白酶明胶微囊与Span-80和液体石蜡混合，作为油相；以壳聚糖水溶液为水相；然后将油相与水相混合，并加入碳酸钙水悬浊液，过滤、冷冻干燥后，得到所述固定化碱性蛋白酶。

进一步地，步骤(1)中煅烧温度为900℃，煅烧时间为1h。

进一步地，步骤(2)还包括混合后超声、震荡处理的过程。

进一步地，所述明胶微囊的制备过程包括以下步骤：

将明胶溶于水，得到水相；将Span-80和液体石蜡混合，得到油相；然后将水相与油相混合，并加入戊二醛水溶液，制得所述明胶微囊。

进一步地，水相与油相体积比为1:6。

进一步地，所述戊二醛水溶液的浓度为25％。

本发明还提供采用所述制备方法制备得到的固定化碱性蛋白酶。

本发明公开了以下技术效果：

本发明以贝壳中的角质层、棱柱层为原料，该材料为生产珍珠层粉的边角料，可实现对贝壳的充分利用；本发明制备的明胶/壳聚糖复合微囊可有效地缓释囊内碱性蛋白酶，避免了贝壳粉负载蛋白酶后，可能会出现的酶与载体结合不牢固、脱落的现象，进一步保证了固定化碱性蛋白酶产品的性能。明胶和壳聚糖均是具有良好的生物相容性的天然聚合物，能与交联剂反应形成交联杂混聚合物网络，从而形成囊包裹住蛋白酶，使蛋白酶缓释。从力学性能上分析刚性的壳聚糖与柔性的明胶分子形成聚电解质配合物，壳聚糖的加入起到了增强明胶凝胶膜的作用。本发明获得的固定化碱性蛋白酶具有高负载、高稳定性及高活性等特点，酶结合效率高达 86.08％，酶活力虽比游离的碱性蛋白酶低13.92％，但其重复使用10次后残留酶活力仍高到73.84％，在室温25℃储藏的固定化碱性蛋白酶放置15天，残留酶活力仍可到达68.73％。同时，载固定化碱性蛋白酶的明胶/壳聚糖微囊缓释性较好，第7天的释放率可实现12.43％。

此外，本发明的制备方法简单环保，获得的固定化酶产品具有高活性、高稳定、高负载的特性，可进行多次重复利用，并且制备工艺绿色简便，可实现废弃贝壳资源合理利用，减少了生态环境污染。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1在不进行煅烧的情况下，得到的贝壳粉电子扫描图 (5000x)；

图2为实施例1经900℃煅烧后得到的贝壳粉电子扫描图(5000x)；

图3为对比例1经600℃煅烧后得到的贝壳粉电子扫描图(5000x)；

图4为对比例2经300℃煅烧后得到的贝壳粉电子扫描图(5000x)；

图5为实施例1不同操作次数下固定化碱性蛋白酶的稳定性曲线。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

可在碱性条件下使用的蛋白酶均可，本发明实施例所用碱性蛋白酶为地衣芽孢杆菌液体发酵得到的酶制剂。

实施例1一种固定化碱性蛋白酶的制备方法

(1)取新鲜马氏珠母贝贝壳，清洗后自然风干，放入2％氢氧化钠溶液中，95℃水浴加热1h，取得角质层和棱柱层；

(2)取得的角质层和棱柱层冷却至室温，用蒸馏水清洗至中性，晾干，用马弗炉900℃煅烧1h，过100目筛后，获得贝壳粉；

(3)称取步骤(2)制得的0.3g贝壳粉加入到15mLPBS磷酸盐缓冲液(pH12)中，再加入225uL的25％戊二醛水溶液(相当于15mLPBS体积的1.5％)，28℃超声处理5min，然后在30℃的振荡培养箱中以180r/min 的转速处理1h，得到原料液；

(4)称取0.1g碱性蛋白酶加入到步骤(3)的10mL原料液中，然后放在55℃、160r/min恒温振荡培养箱中处理6h，真空抽滤，滤渣用蒸馏水重复洗涤至中性，真空冷冻干燥，得固定化酶粗粉，4℃保存，备用；

(5)称取2g明胶溶于10mL蒸馏水，置于60℃的水浴锅中溶解并预热保存，作为水相；在28℃下，用3mLSpan-80和60mL液体石蜡混合均匀作为油相；

(6)将步骤(5)预热的明胶溶液逐滴滴加到步骤(5)油相中(水相与油相的体积比是1:6)，边滴边搅拌，滴加完后28℃水浴并中速(120r/min) 搅拌10min，迅速转移到0℃的冰水浴中，手动搅拌20min，再逐滴加入 400uL的25％戊二醛水溶液，28℃中速搅拌中进一步处理1h；

(7)取出(6)中溶液，28℃下加入6mL乙醇水溶液,搅拌后静置并过滤，将过滤出的明胶微胶囊置于无水乙醇中，在5℃的环境中静置24h，用无水乙醇和蒸馏水依次充分洗涤，过滤得到明胶微囊，冷冻干燥，备用；

(8)称取0.3g步骤(7)的明胶微囊加入30mL 5mg/mL固定化碱性蛋白酶粗粉的水悬浊液中，28℃的水浴锅中中速(150r/min)搅拌3h，待固定化酶被充分包裹后离心，滤渣用蒸馏水清洗3遍，冷冻干燥，得载碱性蛋白酶明胶微囊，备用；

(9)3mLSpan-80和60mL液体石蜡混合均匀，加入1.0g载碱性蛋白酶明胶微囊，搅拌均匀，在40℃水浴锅中预热10min后，高速搅拌10min，作为油相；2％壳聚糖水溶液为水相，水相是0.3g壳聚糖加入15mL含2.5％乙酸的水溶液而成；

(10)取步骤(9)的壳聚糖水溶液，逐滴加入步骤(9)油相，水相和油相的体积比为1:1，40℃水浴中边滴边手动搅拌，滴加完后再继续高速搅拌30min，然后逐滴加入5mL 8％的碳酸钙水悬浊液(固化剂)并继续搅拌30min，用无水乙醇和蒸馏水依次充分洗涤，过滤，冷冻干燥，得固定化碱性蛋白酶。

本实施例获得的固定化碱性蛋白酶的酶活力U＝1900.94u/g，酶结合效率为83.87％，相比于游离的碱性蛋白酶活力U＝2208.34u/g降低了13.92％；此时，载蛋白酶量为64.77％。

本实施例中，在不进行煅烧的情况下，得到的马氏珠母贝壳粉电子扫描图(5000x)见图1；900℃煅烧后得到的贝壳粉电子扫描图(5000x)见图2。

对比例1

与实施例1不同之处仅在于，步骤(1)中的煅烧温度为600℃。

经600℃煅烧后得到的贝壳粉电子扫描图(5000x)见图3。

对比例2

与实施例1不同之处仅在于，步骤(1)中的煅烧温度为300℃。

经300℃煅烧后得到的贝壳粉电子扫描图(5000x)见图4。

对比例3

与实施例1不同之处仅在于，调整制备过程中戊二醛的浓度为15％。

对比例4

与实施例1不同之处仅在于，所用蛋白酶为风味蛋白酶。

对比例5

与实施例1不同之处仅在于，调整制备过程中戊二醛的浓度为15％，所用蛋白酶为风味蛋白酶。

实施例2

同实施例1，不同之处仅在于，调整制备过程中戊二醛的浓度为20％。

实施例3

同实施例1，不同之处仅在于，调整制备过程中戊二醛的浓度为30％。

实施例4

同实施例1，不同之处仅在于，步骤(1)中的煅烧温度为800℃。

实施例5

同实施例1，不同之处仅在于，步骤(1)中的煅烧温度为1000℃。

实施例1-5及对比例1-5的固定化酶的载蛋白酶量见表1。

表1

实施例1-5及对比例1-5的固定化酶活性及水解度对比数据见表2(酶活力、水解度通过水解酪蛋白测定，以考马斯亮蓝法测定吸光度，计算酶活力)。

表2

实施例1-5及对比例1-5的固定化酶稳定性对比数据见表3。

表3

其中，实施例1不同使用次数(操作次数)下固定化酶的稳定性曲线见图5。

实施例1-5及对比例1-5的固定化酶储藏稳定性能对比数据见表4。

表4

实施例1-5及对比例1-5的载固定化酶明胶/壳聚糖微囊缓释性能对比数据见表5。

缓释性能的测试方法如下：

称取0.5g载蛋白明胶/壳聚糖微囊各3份，投入装有5mL蒸馏水的烧杯中，25℃静置，分别在1d、3d、5d、7d测定释放到溶液中的蛋白含量。

表5

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。