一种肌钙蛋白I的检测方法及试剂盒制备方法

技术领域

本发明属于肌钙蛋白I检测相关技术领域，具体涉及一种肌钙蛋白I的检测方法及试剂盒制备方法。

背景技术

心肌肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)是一种调节心肌收缩的蛋白质分子，心肌细胞损伤时，肌钙蛋白就很快被释放入血液，血液中的浓度会持续升高，有非常好的心脏损伤特异性，是诊断急性心肌梗死(AMI)以及对心脏疾病进行危险分层的良好标志物。高敏感心肌肌钙蛋白(hs—cTn)是指用高敏感方法测定cTn。心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心肌纤维上专有的收缩蛋白，分子量为24,000Da，它是肌钙蛋白三个亚单位之一(I，T，C)，它和原肌球蛋白一起通过肌原纤维的肌丝与肌动蛋白结合。cTnI有两种形式，一种为游离的肌钙蛋白I，一种为与肌钙蛋白C、T或同时与C、T结合而成的二联或三联复合物。

cTnI目前虽然是心肌损伤诊断的金标准，因其于AMI后5-8h血清水平才开始升高，因此该指标不能对AMI进行更早期的诊断。hs-cTnI弥补了cTnI的这一不足，其检测系统的灵敏度可达10pg/mL，能检测出任何形式的心肌损伤，包括发病1-3h内的AMI患者，因此其可为AMI患者至少节省3h的黄金管理时间，hs-cTnI目前已被普遍认为是AMI的早期诊断标志物。

但是即时检验(point of care testing,POCT)检测cTnI存在灵敏度不高、重复性和准确度差的问题，而大型化学发光检测系统结果比较精准，但存在样本周转时间长，维护成本高等问题。为了满足临床对于结果和检测时间的要求，当前亟需开发一种灵敏度高且能快速给出检测结果的检测方法和试剂盒，用于心肌损伤等相关疾病的快速准确诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肌钙蛋白I的检测方法及试剂盒制备方法，其灵敏度高且能快速给出检测结果，用于心肌损伤等相关疾病的快速准确诊断，满足临床对于结果和检测时间的要求。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案。

一种肌钙蛋白I的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：

步骤1、进行加样：加入50μL被测样本和60μL的cTnI检测抗体试剂到微孔中；

所述cTnI检测抗体试剂具体为含6.05g/L Tris、10g/L牛血清白蛋白、1g/LProcolin 300、1g/L Tween20、0.4g/L ANS、10mg/L铁氰化钾，pH7.5的水溶液与终浓度为0.5mg/L辣根过氧化物酶标记的cTnI抗体相混合；

步骤2、进行孵育：在37℃的温度下，将被测样本和cTnI检测抗体试剂一起孵育10min；

步骤3、进行清洗：将350μL清洗液加入到微孔中，将未结合在固相上的抗体和被测样本中的其他未结合物质被清除；

步骤4、进行读数：加入化学发光底物A、化学发光底物B，酶催化底物发光，通过光电倍增器测量发光强度；

步骤5、利用已知浓度的定标品绘制发光强度标准曲线，根据步骤4得到的发光强度对照所述发光强度标准曲线，计算得出待测样本中的肌钙蛋白I含量。

进一步的，所述微孔为生物素化cTnI捕获抗体偶联的链霉亲和素包被微孔。

进一步的，所述化学发光底物A为含有0.4％鲁米诺，pH9.0的水溶液；所述化学发光底物B为含有0.06％四硼酸钠，pH5.0的水溶液。

进一步的，所述清洗液为含0.1％吐温20和0.1％ Proclin300的0.05M、pH值为7.5的Tris-HCl溶液。

进一步的，所述定标品为将一定量的cTnI抗原添加至马血清中，配置成浓度约为0pg/mL、80pg/mL、400pg/mL、2000pg/mL、10000pg/mL和40000pg/mL的定标品。

基于上述检测方法，本发明还提供了一种肌钙蛋白I的检测试剂盒制备方法，其特征在于：所述试剂盒包括生物素化cTnI捕获抗体偶联的链霉亲和素包被微孔、cTnI酶标抗体试剂、定标品、化学发光底物液A和化学发光底物液B、清洗液。

进一步的，所述生物素化cTnI捕获抗体偶联的链霉亲和素包被微孔，具体为在化学发光微孔(Nunc MaxiSorp

与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：

1、本发明采用化学发光双抗体夹心法体外定量检测样本中的肌钙蛋白I(cTnI)的含量，在生物素化cTnI捕获抗体偶联的链霉亲和素包被微孔中加入样本后，然后加入cTnI抗体-HRP酶结合物，则样本中所含的cTnI将会与之形成抗体—抗原—抗体—酶复合物，洗去未结合在固相上的反应物，加入化学发光底物，化学发光底物在HRP酶的催化下发光，然后读取相对发光强度(RLU)，最后通过校准曲线计算样本中cTnI的浓度，上述方法实现针对肌钙蛋白I的检测，其灵敏度高且能快速给出检测结果。

2、本发明中生物素与抗体形成的生物素衍生物不仅保持了抗体的原有生物活性，并且每个链霉亲合素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物，因此具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度，并且生物素-链霉亲合素系统还具有良好的稳定性和经济性。

3、本发明将生物素化cTnI捕获抗体预先结合到链霉亲和素微孔上，在同样的抗体浓度下，该步骤通过在制备阶段控制反应时间，可以使得生物素捕获抗体与链霉亲和素反应更加充分，更牢固的结合到微孔板上，进而提高捕获抗体结合抗原的能力，提高cTnI检测的灵敏度。

4、本发明在保证灵敏度和准确度的前提下，可以在12分钟内获得检测结果，检测速度快，有利于临床上快速精准的给出检测结果，辅助临床医生采取正确的治疗方案。

附图说明

图1为计算对比例的临床样本相关系数R

图2为计算实施例的临床样本相关系数R

具体实施方式

实施例：基于本发明的检测方法和制备方法，制作试剂盒进行以下各种性能指标的检测。将本试剂盒作为实验组，将市场上获得认可的肌钙蛋白I检测试剂盒作为对比例进行对比实验。

性能指标1、定量限：

在一台仪器上，用试剂盒连续检5份低值样品(浓度水平在预计值附近)5天，每天每份标本检测4孔，每个样本共计20个测试。计算每个样本的变异系数(CV)，选择CV小于10％的样本浓度值作为定量限LOQ。

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由上表知，对比例高敏高敏心肌肌钙蛋白I检测试剂盒的定量限(LoQ)接近20.0pg/ml，实施例试剂盒的定量限(LoQ)为不大于10.0pg/ml，明显优于对比例。

性能指标2、线性范围：

取一份临床高值血清，其中心肌肌钙蛋白I的浓度为39.28ng/mL(接近40ng/mL)，用低值血清(0.003ng/mL)将高值血清样本进行稀释，共同组成8个浓度，用高敏肌钙蛋白I试剂盒进行检测，每个样本检测三次，计算三次测定结果的平均值。以心肌肌钙蛋白I的理论浓度为横坐标，以测定的心肌肌钙蛋白I的结果的平均值为纵坐标，计算线性回归方程及线性回归方程的相关系数。

由上表结果知，高敏肌钙蛋白I试剂盒在10pg/mL～40000pg/mL线性范围内相关性好。

性能指标3、重复性：

使用对比例和实施例的高敏肌钙蛋白I试剂盒，在同一次实验中重复测定质控品1和质控品2各10次，计算10次测定结果的平均值(M)和标准差(SD)。

实验结果表明，实施例中的高敏肌钙蛋白I试剂盒批内重复性CV均不大于5.0％，优于对比例(CV不大于7％)的重复性。

性能指标4、血样比对：

收集40例线性范围内的样本，并使用高敏肌钙蛋白I试剂盒进行检测，对所有检测结果进行线性回归分析，计算与血清检测结果的相关系数，数据比对结果如图1和图2所述。

在临床样本相关性比对实验中，实施例的相关系数R