一种具有抑菌功能的饲料及其制备方法

技术领域

本发明属于抑菌领域，尤其是涉及一种具有抑菌功能的饲料及其制备方法。

背景技术

我国是水产养殖大国，水产品的养殖密度和产量均较高，但由于养殖技术和设施落后，常导致鱼类细菌性疾病的频繁发生。目前以抗生素为主的药物防治是仍然是养殖生产中最有效、最直接的方法，对于防治鱼类细菌病发挥着非常重要的作用。但生产实践中长期使用抗生素，会导致短时间内耐药菌株层出不穷。

鱼类内脏类结节病，水产养殖中俗称鱼类内脏―白点病‖，是对能够引起患病鱼类内脏组织器官出现白色或者黄色点状结构症状的疾病的统称，由于这些点状结构肉眼观察与结节相似，又称为―类结节病‖。近年来有关鱼类内脏类结节病的报道较多，感染宿主广泛，危害鳢、鲈、鲶、大黄鱼等几十种海、淡水主要养殖鱼类，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。引起鱼类内脏类结节的疾病有多种，有的为长期慢性消耗疾病，影响宿主的生长，增加养殖成本；有的能引起暴发性死亡，造成直接的损失，它们的病原、感染宿主种类和致病机理都有很大不同。

目前已报道的鱼类内脏类结节病的病原有细菌、寄生虫、类立克次体等，其中鱼类细菌性内脏类结节病最为普遍，对水产养殖业造成的危害也最严重。至今没有可以抑制细菌性鱼类内脏类结节病的有效手段。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种具有抑菌功能的饲料及其制备方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种具有抑菌功能的饲料在制备抑制类结节病病原菌的药物中的应用。

进一步，所述的饲料包含0.01-1％的抑菌组合物。

一种抑菌组合物，所述的抑菌组合物包含质量比为1：1-100：100-1000的恩诺沙星、刺柏提取物与舞草提取物。

进一步，所述的抑菌组合物包含质量比为1：1-100：100-1000的恩诺沙星、刺柏提取物与舞草提取物。

优选的，所述的恩诺沙星、刺柏提取物与舞草提取物的质量比为1：1-50：500-1000；所述的恩诺沙星、刺柏提取物与舞草提取物的质量比为1：35-50：620-800。

进一步，所述的刺柏提取物由包括如下步骤的方法制成：将刺柏干燥后研磨成粉末，将粉末加入10-20倍量的浓度为50-70％的乙醇中，浸提1-3小时，反复浸提3-5次，合并浸提液后浓缩即得所述的刺柏提取物。

进一步，所述的舞草提取物由包括如下步骤的方法制成：将舞草干燥后研磨成粉末，将粉末加入10-20倍量的浓度为60-70％的乙醇中，浸提1-3小时，将浸提液后浓缩即得所述的舞草提取物。

所述的抑菌组合物的制备方法，将舞草提取物40-80℃水浴加热10-30分钟，然后将刺柏提取物缓慢滴加到所述的舞草提取物中混合均匀，得到混合料，将混合料冷却至室温，然后向其中加入恩诺沙星，混合均匀后即得所述的抑菌组合物。

进一步，所述的水浴加热步骤的温度为50-65℃，时间为15-25分钟。

一种具有抑菌功能的饲料，所述的饲料包含0.01-1％的抑菌组合物；所述的抑菌组合物包含质量比为1：1-100：100-1000的恩诺沙星、刺柏提取物与舞草提取物。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

本发明所述的一种具有抑菌功能的饲料通过加入恩诺沙星、刺柏提取物与舞草提取物对细菌性类结节病进行有效的抑制。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例中所述的分枝杆菌(Mycobacterium)、鰤鱼诺卡氏菌(Nocardiaseriolae)和舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)由中国水产科学研究院珠江水产研究所水产病害与免疫研究室馈赠。

下面结合实施例来详细说明本发明。

实施例1具有抑菌功能的饲料的制备

准确称量500g刺柏干燥后研磨成粉末，将粉末加入10倍量的浓度为60％的乙醇中，浸提2小时，反复浸提5次，合并浸提液后浓缩即得刺柏提取物。

准确称量5000g舞草干燥后研磨成粉末，将粉末加入10倍量的浓度为70％的乙醇中，浸提3小时，将浸提液后浓缩即得舞草提取物。

将750g舞草提取物60℃水浴加热20分钟，然后将40g刺柏提取物缓慢滴加到舞草提取物中混合均匀，得到混合料，将混合料冷却至室温，然后向其中加入1g恩诺沙星，混合均匀后即得抑菌组合物A。

将750g舞草提取物45℃水浴加热20分钟，然后将40g刺柏提取物缓慢滴加到舞草提取物中混合均匀，得到混合料，将混合料冷却至室温，然后向其中加入1g恩诺沙星，混合均匀后即得抑菌组合物B。

将750g舞草提取物90℃水浴加热20分钟，然后将40g刺柏提取物缓慢滴加到舞草提取物中混合均匀，得到混合料，将混合料冷却至室温，然后向其中加入1g恩诺沙星，混合均匀后即得抑菌组合物C。

将40g刺柏提取物加入到750g舞草提取物中混合均匀，然后向其中加入1g恩诺沙星，混合均匀后即得抑菌组合物D。

实施例2抑菌组合物对分枝杆菌的抑菌效果

1、培养基的制备

BHI培养基购自美国BD公司；5％绵羊血琼脂平板、细菌生化微量鉴定管等购自广州环凯微生物有限公司。

2、菌悬液的制备

试验菌培养：将分枝杆菌菌株活化，用接种针在固体培养基上划线，再32℃培养24h后，挑取单个菌落，接种到营养肉汤培养基上震荡培养24h。采用平板计数法将菌液稀释到合适浓度，菌液浓度为1×105CFU/mL。

3、药物敏感性试验

药敏试验采用琼脂扩散法，将培养至对数生长期的菌悬液稀释至浓度约为1×105CFU/mL，使用无菌棉签蘸取菌液均匀涂抹在培养基上，涂抹均匀后，在平板上均匀打孔，每个平板上打4个孔，做好标记。每孔加入100μl(1g/mL)组合物，然后将之放入32℃培养箱中培养24h；平板取出后，观察孔周围是否有抑菌圈，若有，则用游标卡尺测量抑菌圈直径。每种药物做三个重复，同时以无菌水做空白对照。结果判断标准按《中药药理学》介绍的标准：抑菌圈≥20mm，属于极敏；抑菌圈15-19mm属于高敏；抑菌圈10-14mm属于中敏；抑菌圈小于10mm，属于低敏；没有抑菌圈，属于不敏(无抑菌效果)。

4、二次筛选试验

用营养肉汤培养基以二倍稀释法对提取物进行梯度稀释，在每个试管中加入细菌悬液，使细菌浓度达到106CFU/mL，在不同的试管中加入组合物A、组合物B、组合物C、组合物E，不加组合物作为空白对照，不加细菌作为阴性对照，每个重复3次。置32℃摇床中震荡(180r/min)培养24h，然后取出与对照管对比观察，抑菌圈直径及抑菌等级如表1所示。

表1抑菌圈直径及抑菌等级

上述表中，“+++”表示极敏，“++”表示高敏，“+”表示中敏或低敏，“－”表示不敏(无抑菌效果)。

由表1可知，组合物A、组合物B、组合物C、组合物D均对分枝杆菌有抑菌效果，其中组合物A的抑菌等级为极敏，组合物B等级为高敏，组合物C和组合物D等级为中敏或低敏，由此可见，含有刺柏提取物、舞草提取物和恩诺沙星的组合物对于分枝杆菌具有显著的抑菌效果，其中组合物A的抑菌效果尤其显著，而对于组合物B，在制备组合物时，采用45℃的较低温度进行水浴加热，无法对其中的抑菌成分充分的提取出，使其效果与组合物A相比有较大的差距，对于组合物C，采用90℃的高温进行水浴加热，将抑菌物质蒸出，严重影响了组合物的抑菌效果，对于组合物D，在制备组合物的过程中，直接将刺柏提取物、舞草提取物进行混合，没有进行水浴加热及滴加的步骤，没有温度的升降变化，无法将抑菌成分大量的提取出，其效果与组合物B相比，具有一定的差距。由此表明，在组合物中，刺柏提取物、舞草提取物、恩诺沙星的结合，对分枝杆菌具有显著的抑菌效果，在混合的过程中进行水浴加热对于组合物对分枝杆菌的抑菌效果也具有较大的影响。

实施例3刺柏提取物与舞草提取物的配比对抑菌效果的影响

准确称量500g刺柏干燥后研磨成粉末，将粉末加入10倍量的浓度为60％的乙醇中，浸提2小时，反复浸提5次，合并浸提液后浓缩即得刺柏提取物。

准确称量5000g舞草干燥后研磨成粉末，将粉末加入10倍量的浓度为70％的乙醇中，浸提3小时，将浸提液后浓缩即得舞草提取物。

将750g舞草提取物60℃水浴加热20分钟，然后将40g刺柏提取物缓慢滴加到舞草提取物中混合均匀，得到混合料，将混合料冷却至室温，然后向其中加入1g恩诺沙星，混合均匀后即得抑菌组合物A。

将750g舞草提取物60℃水浴加热20分钟，然后将120g刺柏提取物缓慢滴加到舞草提取物中混合均匀，得到混合料，将混合料冷却至室温，然后向其中加入1g恩诺沙星，混合均匀后即得抑菌组合物B。

将80g舞草提取物60℃水浴加热20分钟，然后将40g刺柏提取物缓慢滴加到舞草提取物中混合均匀，得到混合料，将混合料冷却至室温，然后向其中加入1g恩诺沙星，混合均匀后即得抑菌组合物C。

将80g舞草提取物60℃水浴加热20分钟，然后将20g刺柏提取物缓慢滴加到舞草提取物中混合均匀，得到混合料，将混合料冷却至室温，然后向其中加入1g恩诺沙星，混合均匀后即得抑菌组合物D。

将750g舞草提取物60℃水浴加热20分钟，然后冷却至室温，然后向其中加入1g恩诺沙星，混合均匀后即得抑菌组合物E。

将40g刺柏提取物60℃水浴加热20分钟，然后冷却至室温，然后向其中加入1g恩诺沙星，混合均匀后即得抑菌组合物F。

准确称量1g恩诺沙星溶于10倍量的浓度为60％的乙醇中，混合均匀后得到组合物G。

在每个试管中加入分枝杆菌的细菌悬液，使细菌浓度达到105CFU/mL，将各组合物稀释1000倍，在不同的试管中加入组合物A、组合物B、组合物C、组合物E、组合物F与组合物G的稀释液，不加组合物作为空白对照，不加细菌作为阴性对照，每个重复3次。置32℃摇床中震荡(180r/min)培养24h，然后取出与对照管对比观察，抑菌圈直径及抑菌等级如表2所示。

表2抑菌圈直径及抑菌等级

上述表中，“+++”表示极敏，“++”表示高敏，“+”表示中敏或低敏，“－”表示不敏(无抑菌效果)。

由表2可知，组合物A、组合物B、组合物C、组合物D、组合物E、组合物F、组合物G均对分枝杆菌有抑菌效果，其中组合物A的抑菌等级为极敏，组合物B等级为高敏，组合物D、组合物E(不含刺柏提取物)、组合物F(不含舞草提取物)和组合物G(恩诺沙星)等级为中敏或低敏。由此可见，含有恩诺沙星、刺柏提取物与舞草提取物的组合物对于分枝杆菌具有显著的抑菌效果，其中组合物A的抑菌效果尤其显著，而组合物B的抑菌效果与组合物A相比，有一定的差距，组合物B与组合物A的区别在于，刺柏提取物的添加量为120g，由此可见，过高的刺柏提取物的添加量会降低组合物的抑菌效果；组合物C的抑菌效果与组合物A相比，有显著的差距，组合物C与组合物A的区别在于，舞草提取物的添加量为80，由此可见，过少的舞草提取物的添加量会降低组合物的抑菌效果，且舞草提取物对组合物的抑菌效果的影响远大于刺柏提取物；组合物D与组合物A的区别在于，舞草提取物的添加量为80，刺柏提取物的添加量为120g，其抑菌效果均不及组合物A、组合物B，表明刺柏提取物与舞草提取物的添加量需要在一定范围内才能实现最优的抑菌效果；对于组合物E与组合物F，分别添加舞草提取物或刺柏提取物的组合物，对分枝杆菌具有一定的抑菌效果，但抑菌效果与包含有恩诺沙星、刺柏提取物与舞草提取物的组合物的抑菌效果差距显著，而对于组合物G，单独的恩诺沙星对于分枝杆菌的抑菌效果低于分别添加刺柏提取物与舞草提取物的组合物。

实施例4具有抑菌功能的饲料对于分枝杆菌、鰤鱼诺卡氏菌和舒伯特气单胞菌的抑菌效果

准确称量500g刺柏干燥后研磨成粉末，将粉末加入10倍量的浓度为60％的乙醇中，浸提2小时，反复浸提5次，合并浸提液后浓缩即得刺柏提取物。

准确称量5000g舞草干燥后研磨成粉末，将粉末加入10倍量的浓度为70％的乙醇中，浸提3小时，将浸提液后浓缩即得舞草提取物。

将750g舞草提取物60℃水浴加热20分钟，然后将40g刺柏提取物缓慢滴加到舞草提取物中混合均匀，得到混合料，将混合料冷却至室温，然后向其中加入1g恩诺沙星，混合均匀后即得抑菌组合物。

准确称量2g抑菌组合物，将其与1000g的外购饲料混合均匀，得到具有抑菌功能的饲料。

实验鱼：健康的杂交鳢(100-120克)购自广州市国联鱼苗发展有限公司，试验前曝气水缸中暂养2周，每天早晚投食。

试验分别设置7组杂交鳢，分枝杆菌、鰤鱼诺卡氏菌和舒伯特气单胞菌各注射2组试验组，不注射细菌对照组，每个试验组各放养杂交鳢100条。攻毒后分枝杆菌、鰤鱼诺卡氏菌和舒伯特气单胞菌各组中选出一组用具有抑菌功能的饲料进行饲喂，观察1周，统各组的死亡率。每组三个重复。

注射细菌后，试验鱼第2天出现急性死亡，死亡鱼类出现腹水，肝、脾、肾肿大等败血症症状，内脏无类结节，第4天死亡的鱼类，内脏开始出现自然发病鱼相似的类结节症状，第6天未死亡鱼剖检也出现内脏类结节症状。

治疗结果如表3所示。

表3治疗结果

由表3可知，包含有恩诺沙星、刺柏提取物与舞草提取物的组合物的饲料对病原菌为分枝杆菌、鰤鱼诺卡氏菌和舒伯特气单胞菌的类结节病均有显著的抑菌效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。