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一种用于诊断椎间盘退行性变的血清miRNA标志物及其应用

文献发布时间：2023-06-19 10:36:57

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及诊断椎间盘退行性变的miRNA及其应用。

背景技术

椎间盘退行性变症(intervertbral disc degeneration，IDD)是中老年的常见病、多发病，严重威胁人类健康，影响正常生活工作。据统计，全世界80％人口曾罹患腰痛，其中由IDD引起腰痛占绝大多数(Rodrigues-Pinto R,Ward L,Humphreys M,et al.Humannotochordal cell transcriptome unveils potential regulators of cell functionin the developing intervertebral disc.Sci Rep.2018；8(1):12866.)。严重IDD患者，甚至引起下肢感觉障碍、大小便失禁等。IDD已成为全球致残的重要因素，且随着世界人口老龄化，IDD威胁健康的问题日益严重。早期诊断、早期治疗有助于抑制IDD进展，缓解疼痛，防止感觉障碍等神经症状出现。但是，部分患者早期症状不明显，较难明确诊断；且IDD导致的腰痛也较难与软组织炎症导致的腰痛鉴别。因此，寻找椎间盘退行性变的早期筛查、诊断的高灵敏性、特异性的血清标志物寻是目前该领域研究的重要方向，亟待解决。

人类基因组计划发现，人体内有大量的非编码序列发挥重要的生物学功能，其中microRNA(miRNA)是非编码RNA中的重要一员。miRNA为全长仅有20-24bp、高度保守、非编码的短链核苷酸片段，随着研究的深入，发现其在人体的肿瘤发生、炎症反应、退行性变等生物学过程中发挥了重要作用。miRNA特异性作用于下游靶点mRNA，进而调控人体重大疾病的发生、发展，故miRNA可作为重大疾病筛查和诊断的重要候选生物学标志物。研究发现，虽然在外周血中，miRNA含量较低，但是其性质稳定，PCR可有有效检测其含量，且miRNA含量与疾病发生、发展具有显著的相关性，故通过外周血miRNA制备疾病检测试剂盒具有有效的可行性。且外周血miRNA疾病检测试剂盒检测效率高、速度快、成本相对较低，具有较好的应用前景。因此，发现与椎间盘退行性变有显著相关性的miRNA，并将其作为miRNA生物标志物，研制相应筛查诊断试剂盒，其在椎间盘退行性变的筛查诊断中将发挥重大的意义。CN105483272A披露了miR-1249可以作为诊治椎间盘退行性病变的分子标志物。CN105420376A披露了miR-744可以作为诊治椎间盘退行性病变的分子标志物。CN105521490A披露了miRNA-888-3p可以作为诊治椎间盘退行性病变的分子标志物。但是，现有技术中披露的与椎间盘退行性变有显著相关性的miRNA生物标志物的种类较少，因此，发现与椎间盘退行性变有显著相关性的更多种类的miRNA生物标志物对椎间盘退行性变的筛查诊断将发挥重大意义。

发明内容

为了克服现有技术中披露的与椎间盘退行性变有显著相关性的miRNA生物标志物的种类较少的技术缺陷，本发明的第一个方面提供一种椎间盘退行性变的诊断试剂或诊断工具，所述诊断工具包括用于检测miRNA表达量的试剂，所述miRNA选自miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146中的任一种或两种以上。所述用于检测miRNA表达量的试剂包括探针和/或PCR引物。

miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146在血清中的表达水平与椎间盘退行性变程度成正相关。因此，通过检测血清中miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146的表达水平，可以评估待检人群中椎间盘退行性变的风险及程度。

其中，miRNA-194在miRBase数据库中的Accession number为：MIMAT0000460，具体序列如下：uguaacagcaacuccaugugga(SEQ ID NO.1)。

其中，miRNA-515在miRBase数据库中的Accession number为：MIMAT0002826，具体序列如下：uucuccaaaagaaagcacuuucug(SEQ ID NO.2)。

其中，miRNA-138在miRBase数据库中的Accession number为：MIMAT0000430，具体序列如下：agcugguguugugaaucaggccg(SEQ ID NO.3)。

其中，miRNA-146在miRBase数据库中的Accession number为：MIMAT0000449，具体序列如下：ugagaacugaauuccauggguu(SEQ ID NO.4)。

进一步地，所述诊断试剂为血清学诊断试剂，所述诊断工具为血清学诊断工具。优选地，诊断试剂为采用Real-time RT-PCR(qPCR)方法检测miRNA表达量的试剂。

进一步地，所述诊断工具为试剂盒、基因芯片或高通量测序平台。优选地，试剂盒为采用Real-time RT-PCR(qPCR)方法检测miRNA表达量的试剂盒，示例地，所述试剂盒包括如下试剂：正向引物、方向引物、qPCR的常规酶和其他试剂(例如ddH

进一步地，所述诊断试剂和所述诊断工具分别包括：针对miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146中的任一种或两种以上具有检测特异性的探针和/或PCR引物。

进一步地，所述诊断试剂或所述诊断工具用于检测生物样品中的miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146中的任一种或两种以上的表达量。

进一步地，所述诊断试剂或所述诊断工具采用Real-time RT-PCR方法检测生物样品中的miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146中的任一种或两种以上的表达量。

进一步地，所述生物样品选自血液，体液，新鲜组织或细胞，由福尔马林固定或石蜡包埋的组织或细胞中的任一种或两种以上。优选地，生物样品选自：获自对象外周血离心后所得的血清。

本发明的第二个方面提供上述的miRNA在制备椎间盘退行性变的诊断试剂或诊断工具中的应用。

进一步地，所述诊断试剂为血清学诊断试剂，所述诊断工具为血清学诊断工具。优选地，诊断试剂为采用Real-time RT-PCR(qPCR)方法检测miRNA表达量的试剂。

进一步地，所述诊断工具为试剂盒、基因芯片或高通量测序平台。优选地，试剂盒为采用Real-time RT-PCR(qPCR)方法检测miRNA表达量的试剂盒。本发明的试剂盒通过检测miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146的表达水平，可以筛查待检测人群患椎间盘退行性变的风险：若miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146中任一miRNA的表达水平高于正常值范围(上述miRNA的正常值范围依次为9410±1318，558±63，2347±294，401±49拷贝数每500微升外周静脉血血清)，则患椎间盘退行性变的风险较高；若miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146中任一miRNA的表达水平低于正常值范围(上述miRNA的正常值范围依次为35.6±5.9，42.9±5.1，43.3±6.6，28.4±3.9拷贝数每500微升外周静脉血血清)，则患椎间盘退行性变的风险低。

进一步地，所述诊断试剂和所述诊断工具分别包括：针对miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146中的任一种或两种以上具有检测特异性的探针和/或PCR引物。示例地，miRNA-194的正向引物(forward primer)为：GCCCGCTGTAACAGCAACTCCAT(SEQ IDNO.5)；反向引物(reverse primer)为：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO.6)。

示例地，miRNA-515的正向引物(forward primer)为：TATAGAGTAAATATTTGAAATATTTTTGT(SEQ ID NO.7)；反向引物(reverse primer)为：AACATTAACTACCAAAAACCACC(SEQ ID NO.8)。

示例地，miRNA-138的正向引物(forward primer)为：GCGAGCTGGTGTTGTGAATC(SEQID NO.9)；反向引物(reverse primer)为：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT(SEQ ID NO.10)。

示例地，miRNA-146的正向引物(forward primer)为：CCGATGTGTATCCTCAGCTTTG(SEQ ID NO.11)；反向引物(reverse primer)为：GCTGAAGAACTGAATTTCAGAGGTC(SEQ IDNO.12)。

探针和PCR引物的设计是本领域常规技术手段，也可以设计为其他序列。其中，探针具有与miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146中的任一种或两种以上互补的碱基序列。

进一步地，所述诊断试剂或所述诊断工具用于检测生物样品中的miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146中的任一种或两种以上的表达量。

进一步地，所述诊断试剂或所述诊断工具采用Real-time RT-PCR方法检测生物样品中的miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146中的任一种或两种以上的表达量。

采用了上述技术方案后，与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明第一次发现了对椎间盘退行性变具有较高诊断价值的生物标记物miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146；通过miRNA血清标志物诊断试剂及诊断工具的制备，有助于椎间盘退行性变的早期筛查，为临床早期诊断、提高疗效提供坚实的基础。

附图说明

图1是选取30个正常健康人与30个IDD患者的血清，通过real-time PCR法检测检测miRNA-194的表达量。把循环数(CT值)最高的样本作为对照，并通过计算外参cel-miR-39含量排除操作因素得出的相对量值。结果显示利用本专利方法检测IDD组患者血清miRNA-194表达量均显著高于对照组。**，P<0.01。

图2是选取30个正常健康人与30个IDD患者的血清，通过real-time PCR法检测检测miRNA-146的表达量。把循环数(CT值)最高的样本作为对照，并通过计算外参cel-miR-39含量排除操作因素得出的相对量值。结果显示利用本专利方法检测IDD组患者血清miRNA-146表达量均显著高于对照组。**，P<0.01。

图3是选取30个正常健康人与30个IDD患者的血清，通过real-time PCR法检测检测miRNA-138的表达量。把循环数(CT值)最高的样本作为对照，并通过计算外参cel-miR-39含量排除操作因素得出的相对量值。结果显示利用本专利方法检测IDD组患者血清miRNA-138表达量均显著高于对照组。**，P<0.01。

图4是选取30个正常健康人与30个IDD患者的血清，通过real-time PCR法检测检测miRNA-515的表达量。把循环数(CT值)最高的样本作为对照，并通过计算外参cel-miR-39含量排除操作因素得出的相对量值。结果显示利用本专利方法检测IDD组患者血清miRNA-515的表达量显著高于对照组。**，P<0.01。

图5为55个IDD患者和55个正常健康人的血清miRNA-194的real-time PCR法检测表达情况。通过将real-time PCR的值与标准曲线进行绝对定量，得出每个样本的miRNA拷贝数(拷贝数/500微升血清)并进行作图分析。结果显示利用本发明相关试剂方法检测IDD组患者的血清miRNA-194的表达量显著高于对照组。**，P<0.01。

图6为55个IDD患者和55个正常健康人的血清miRNA-146的real-time PCR法检测表达情况。通过将real-time PCR的值与标准曲线进行绝对定量，得出每个样本的miRNA拷贝数(拷贝数/500微升血清)并进行作图分析。结果显示利用本发明相关试剂方法检测IDD组患者的血清miRNA-146的表达量显著高于对照组。**，P<0.01。

图7为55个IDD患者和55个正常健康人的血清miRNA-138的real-time PCR法检测表达情况。通过将real-time PCR的值与标准曲线进行绝对定量，得出每个样本的miRNA拷贝数(拷贝数/500微升血清)并进行作图分析。结果显示利用本发明相关试剂方法检测IDD组患者的血清miRNA-138的表达量显著高于对照组。**，P<0.01。

图8为55个IDD患者和55个正常健康人的血清miRNA-515的real-time PCR法检测表达情况。通过将real-time PCR的值与标准曲线进行绝对定量，得出每个样本的miRNA拷贝数(拷贝数/500微升血清)并进行作图分析。结果显示利用本发明相关试剂方法检测IDD组患者的血清miRNA-515的表达量显著高于对照组。**，P<0.01。

图9为选取55个IDD患者和55个正常健康人的血清，通过real-time PCR法检测检测miRNA-194的表达量。然后利用SPSS进行ROC曲线分析，获得miRNA-194的特异性及敏感性的相互关系。

图10为选取55个IDD患者和55个正常健康人的血清，通过real-time PCR法检测检测miRNA-146的表达量。然后利用SPSS进行ROC曲线分析，获得miRNA-146的特异性及敏感性的相互关系。

图11为选取55个IDD患者和55个正常健康人的血清，通过real-time PCR法检测检测miRNA-138的表达量。然后利用SPSS进行ROC曲线分析，获得miRNA-138的特异性及敏感性的相互关系。

图12为选取55个IDD患者和55个正常健康人的血清，通过real-time PCR法检测检测miRNA-515的表达量。然后利用SPSS进行ROC曲线分析，获得miRNA-515的特异性及敏感性的相互关系。

图13为选取55个IDD患者和55个正常健康人的血清，通过real-time PCR法检测检测miRNA-194、miRNA-146、miRNA-138、miRNA-515的表达量。然后利用SPSS进行ROC曲线联合分析，获得miRNA联合分析的特异性及敏感性的相互关系。

图14为选取30个正常健康人于采集外周血1年后，4名患者MRI检测结果示椎间盘退行性变症。

具体实施方式

以下结合附图与具体实施例进一步阐述本发明的优点。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本专利所用试剂均市面销售获得，或者根据文献研究方法进行制备。下述实施方案中未标明具体实验条件的，均按常规条件如Sambrook等《分子克隆：实验室指南》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按说明书所建议的条件。

实施例1：针对入院患者进行血清IDD特异性miRNA筛查

一、研究对象

退变组为2019年1月至2019年9月在上海长征医院收集的30例病例，均经腰椎MRI明确椎间盘退行性变症，采集外周血前患者均未采用任何治疗措施。对照组为同期进行体检的健康个体30例，所有外周血收集均提前前告知患者采集目，并得到其允许同意。退变组与对照组患者，在年龄、吸烟、饮酒等因素上均无统计学差异(P>0.05)。

二、研究方法

1.清晨6点，患者空腹，采集患者肘静脉外周血6ml，轻轻摇动采血管，促进EDTA抗凝剂产生作用。于离心机内以2000RPM离心20min，外周血分为两层，上层为血清，下层为血细胞，采集血清，于-80℃保存；

2.5体积(1ml)QIAzol+1体积(200ul)样本，样本最大200ul。室温静置5min。加入等体积(200ul)氯仿，混匀15S。室温静置2-3min。12000g 4℃15min，取上清600ul。加入900ul的无水乙醇，混匀。吸取700ul液体(尽量吸取沉淀)放入RNeasy MinElute spin column ina 2ml collection tube(放入RNeasy MinElute离心柱并置于2ml收集管中)。室温下≥10,000rpm 15s，弃滤液。重复上步，第2次离心，弃滤液。加入700ul Buffer RWT，室温下≥10,000rpm 15s，弃滤液。500ul Buffer RPE，室温下≥10,000rpm 15s，弃滤液。加入500ul80％乙醇，室温下≥10,000rpm 2min，弃滤液。放入新的收集管内，室温离心5min，干燥膜，完全去除乙醇。放入新的收集管，14ul RNase-free水于膜上，室温离心1min。同时加入1μl人工合成的线虫miRNA cel-miR-39(5’-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’(SEQ ID NO.13))，10nM作为外参直接加入每个样品，至于4℃冰箱用于逆转录。

3.Real-time RT-PCR(qPCR)方法

(1)取受试者血清总RNA，利用TAKARA逆转录试剂盒制备20μl体积的逆转录反应体系，进行逆转录15min获得cDNA样品；

(2)加入

其中，miRNA-194的正向引物(forward primer)为：GCCCGCTGTAACAGCAACTCCAT(SEQ ID NO.5)；反向引物(reverse primer)为：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO.6)。

其中，miRNA-515的正向引物(forward primer)为：TATAGAGTAAATATTTGAAATATTTTTGT(SEQ ID NO.7)；反向引物(reverse primer)为：AACATTAACTACCAAAAACCACC(SEQ ID NO.8)。

其中，miRNA-138的正向引物(forward primer)为：GCGAGCTGGTGTTGTGAATC(SEQID NO.9)；反向引物(reverse primer)为：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT(SEQ ID NO.10)。

其中，miRNA-146的正向引物(forward primer)为：CCGATGTGTATCCTCAGCTTTG(SEQID NO.11)；反向引物(reverse primer)为：GCTGAAGAACTGAATTTCAGAGGTC(SEQ ID NO.12)。

PCR反应步骤：

(4)检测并比较椎间盘退行性变病例与健康人对照血清样本中miRNA(miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146)的含量的变化。PCR产物含量计算采用比较Ct值法进行相对定量。比较Ct值法前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到Ct值来反应起始模板的量，一个循环(Ct＝1)的不同相当于起始模板数2倍的差异。

定义：ΔCt＝Ct

ΔΔCt＝(Ct

RQ＝2

利用EXCEL里面的统计分析工具，计算各组的平均值和标准差，两组之间用t检验，P<0.05认为有统计学意义，P<0.01认为差异显著。

三、研究结果

病例组血清miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146表达水平较对照组显著上调，结果见图1-4。

上述结果显示血清miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146水平在对照组及病例组中具有明显差异，提示其中任一miRNA的上调均对椎间盘退变发生发展有提示意义。

实施例2：通过检测血清IDD特异性miRNA对患者进行IDD的筛查

一、研究对象

退变组为2019年1月至2019年9月在上海长征医院收集的55例IDD病例，均经腰椎MRI确诊椎间盘退行性变症，采集外周血前患者均未采用任何治疗措施。对照组为同期进行体检的健康个体55例，所有外周血收集均提前前告知患者采集目，并得到其允许同意。退变组与对照组患者，在年龄、吸烟、饮酒等因素上均无统计学差异(P>0.05)。

二、研究方法

同实施例1。

为了明确血清中4种miRNA的具体含量，我们利用标准曲线及绝对定量real-timePCR对上述4种指标进行分析。

此外，为了检测前述4种miRNA指标的特异性及敏感性，利用SPSS软件对测得数值进行统计分析，并通过线性回归方程拟合联合参数，将4种miRNA拟合成新值，并对该新值进行特异性的检验。

三、研究结果

病例组血清miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146表达水平较对照组显著上调，具体如图5-8所示。

然后利用SPSS进行ROC曲线分析，结果见图9-12。miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146均有较好的筛查效果。

如图5、9所示，病例组血清miRNA-194表达水平较对照组显著上调，其AUC为75.6％，说明miRNA-194为较好的椎间盘退变诊断指标，且其对椎间盘退变筛查也有较好的效果。

如图6、10所示，病例组血清miRNA-515表达水平较对照组显著上调，其AUC为81.9％，说明miRNA-515为较好的椎间盘退变诊断指标，且其对椎间盘退变筛查也有较好的效果。

如图7、11所示，病例组血清miRNA-138表达水平较对照组显著上调，其AUC为76.1％，说明miRNA-138为较好的椎间盘退变诊断指标，且其对椎间盘退变筛查也有较好的效果。

如图8、12所示，病例组血清miRNA-146表达水平较对照组显著上调，其AUC为77.7％，说明miRNA-146为较好的椎间盘退变诊断指标，且其对椎间盘退变筛查也有较好的效果。

实施例3 4种生物标记物的联合分析

试验方法：为了将4种阳性指标(血清miRNA-194、miRNA-515、miRNA-138、miRNA-146)联合分析，选取55个IDD患者和55个正常健康人的血清，通过real-time PCR法检测检测miRNA-194、miRNA-146、miRNA-138、miRNA-515的表达量。然后利用SPSS进行ROC曲线联合分析，采取线性回归方程进行拟合，通过拟合出的新值其ROC曲线判断联合分析时的特异性及敏感性。

试验结果：拟合后得到的ROC曲线如图13所示，图13的分析结果显示，相对于使用单一的miRNA作为诊断指标时的特异性及敏感性，同时使用4种阳性指标联合分析作为诊断指标的特异性及敏感性均更高。

实施例4：通过磁共振检测技术验证miRNA对椎间盘退行性变症的早期诊断价值一、研究对象

2019年1月至2019年9月在上海长征医院收集的30例进行体检的健康个体，均经腰椎MRI明确无椎间盘退行性变症，外周血收集均提前告知患者采集目的，并得到其允许同意，采集外周血前患者均未采用任何治疗措施。

二、研究方法

同实施例1。

为了明确血清中4种miRNA的表达量是否可以对椎间盘退变进行早期诊断，对所收集30例个体于1年后，即2020年1月至2020年9月进行磁共振检测，明确患者是否于1年后发生椎间盘退行性变症。

三、研究结果

2019年1月至2019年9月外周血血清miRNA表达量联合分析，发现6名患者miRNA表达显著增高。2020年1月至2020年9月进行磁共振检测，发现此6名患者中，有4名患者发生椎间盘退行性变症，MRI结果如图14所示。说明外周血血清miRNA表达量联合分析对椎间盘退行性变症早期诊断具有较好的诊断价值。相对于MRI，其早期诊断效果较好。

应当注意的是，本发明的实施例有较佳的实施性，且并非对本发明作任何形式的限制，任何熟悉该领域的技术人员可能利用上述揭示的技术内容变更或修饰为等同的有效实施例，但凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改或等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 上海长征医院

<120> 一种用于诊断椎间盘退行性变的血清miRNA标志物及其应用

<130> 说明书

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA