多肽TCP-6及其在制备治疗急性肾损伤的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及多肽TCP-6及其在制备治疗急性肾损伤的药物中的应用。

背景技术

急性肾损伤(Acute Kidney Injury，AKI)是指由缺血、药物或脓毒症等多种病因引起的肾功能快速下降而出现的临床综合征，是临床常见的急危重症之一，死亡率高。AKI因缺乏有效的预防和治疗手段，往往容易导致不完全和不适应的组织修复，进而发展成为慢性肾脏病(CKD)，给患者和社会带来沉重的负担。同时，AKI也可以继发于CKD，并与CKD的不良预后息息相关。因此AKI的预防和治疗已成为一个全球性的重大健康问题，研制防治AKI的药物迫在眉睫。

已知肾小管上皮细胞是AKI的主要受损细胞，在缺血、毒素等因素的作用下，肾小管上皮细胞发生凋亡、坏死、脱落，促进管型形成，堵塞肾小管管腔。同时，受损的小管上皮通过释放炎症和趋化因子加重肾脏的炎症反应，加重肾脏损伤。因此，保护肾小管上皮细胞，促进其修复对AKI的治疗有至关重要的作用。

最新研究发现，细胞外基质糖蛋白肌腱蛋白C(Tenascin C，TNC)在急性肾损伤时表达升高，通过激活Wnt/β-catenin信号途径，抑制肾小管上皮细胞损伤与凋亡，缓解肾功能损伤，对肾脏起保护作用(Chen et al,Kidney Int.95:62-74,2019)，因此对急性肾损伤具有一定治疗效果。

然而，肌腱蛋白C是一种由超2000个氨基酸组成的细胞外大分子基质蛋白，由于其分子量很大，既不利于合成导致生产成本高，也存在着过敏风险和吸收利用性差的缺陷。因此，本发明希望提出一种分子量相对较小，且对急性肾损伤有治疗效果的多肽药物。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出多肽TCP-6及其在制备治疗急性肾损伤的药物中的应用。实验表明，该多肽TCP-6能够有效缓解AKI时发生的肾小管上皮细胞损伤和凋亡，保护肾功能，且未见明显毒副作用，因而可作为治疗急性肾损伤的药物得到应用。

本发明提供了一种多肽TCP-6或其在药学上可接受的盐，所述多肽TCP-6的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

ETFTTGLDAPRNLRRVSQTDNSITLEWRNG(SEQ ID NO：1)。

本发明通过对蛋白肌腱蛋白C进行切割后，对所得的多个多肽片段展开研究，经筛选后发现，其中一种由30个氨基酸组成的特定多肽TCP-6能够有效缓解AKI时发生的肾小管上皮细胞损伤和凋亡，保护肾功能，且无明显毒副作用，因此可用于制备治疗急性肾损伤的药物。

优选地，所述多肽TCP-6在药学上可接受的盐包括乙酸盐、柠檬酸盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、磺酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐或富马酸。

本发明还提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码上述多肽TCP-6。

本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体包含上述核酸分子。

本发明还提供了一种转化子，所述转化子包含上述重组载体。

本发明还提供了上述多肽TCP-6或其在药学上可接受的盐在制备治疗急性肾损伤的药物中的应用。

优选地，所述急性肾损伤为缺血再灌注或顺铂引起的肾小管上皮细胞损伤和凋亡。

本发明还提供了一种治疗急性肾损伤的药物，包括上述多肽TCP-6或其在药学上可接受的盐。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

更优选地，所述药学上可接受的辅料为溶剂、润湿剂、乳化剂、增稠剂、赋形剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、润滑剂或稀释剂中的至少一种。

优选地，所述药物的剂型为片剂、注射剂、喷雾剂、冻干粉针剂、胶囊或包衣药丸。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

相关实验表明，本发明所提出的多肽TCP-6在小鼠动物实验中无明显毒副作用，且采用TCP-6进行顺铂(CIS)和缺血/再灌注损伤(IRI)两种急性肾损伤模型实验的结果显示：与CIS或IRI模型组比较，造模后通过尾静脉注射TCP-6进行干预的用药组的肾功能指标血清肌酐水平和血尿素氮水平明显下降，肾小管上皮细胞损伤标志物N-GAL、Kim-1，凋亡相关蛋白Fas-L、FADD、p53、Cleaved Caspase-3等蛋白表达量显著减少。同时，PAS病理染色和Caspase-3的免疫组织化学染色的结果也表明，使用TCP-6干预后，肾小管损伤和凋亡较模型组明显缓解。

因此，TCP-6具有显著抑制肾小管上皮细胞损伤与凋亡的作用，且无明显毒副作用，因此可用于制备有效治疗急性肾损伤的药物。此外，由于TCP-6为分子量较小的多肽，因而相较于作为生物大分子的肌腱蛋白C具有更好的成药性能，且生产成本也更低，具有更为广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例2中不同浓度的TCP-6对顺铂诱导的人肾小管上皮细胞的凋亡的保护作用。

图2为实施例2中TCP-6对顺铂诱导的人肾小管上皮细胞的凋亡的抑制结果。

图3为实施例3中各实验组血清肌酐水平数值。

图4为实施例3中各实验组数值血尿素氮水平数值。

图5为实施例3中在蛋白水平上检测TCP-6对肾小管损伤与凋亡的缓解程度。

图6为实施例3中PAS病理染色、Caspase-3免疫组织化学染色证实TCP-6对肾小管损伤与凋亡的缓解作用。

图7为实施例4中各实验组血清肌酐水平数值。

图8为实施例4中各实验组数值血清尿素氮水平数值。

图9为实施例4中在蛋白水平上检测TCP-6对肾小管损伤与凋亡的缓解程度。

图10为实施例4中PAS病理染色、Caspase-3免疫组织化学染证实TCP-6对肾小管损伤与凋亡的缓解作用。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1：多肽TCP-6的氨基酸序列

本实施例提供一种多肽(命名为TCP-6)，其氨基酸序列为：ETFTTGLDAPRNLRRVSQTDNSITLEWRNG(SEQ ID NO：1)。

上述多肽TCP-6的氨基酸数量较少(30个)，因而既可通过常规固相合成法进行化学合成，也可通过构建重组表达载体和重组菌株的方式进行生物合成。

实施例2：在体外实验中多肽TCP-6抑制顺铂诱导的人肾小管上皮细胞的损伤与凋亡

1.实验材料：

细胞：人肾小管上皮细胞(HK2)。

培养液：含10％FBS的DMEM/F12(1:1)培养液。

培养条件：37℃含5％CO

2.实验处理及实验结果：

(I)将培养好的人肾小管上皮细胞以约10000/孔的数量接种于96孔板细胞培养板，培养1天后，用无血清DMEM/F12(1:1)培养基继续培养12小时。使用无血清DMEM/F12(1:1)培养基换液后，加入顺铂(25μg/mL)刺激细胞，同时加入不同浓度(0、25、50、100、200、400、800ng/mL)的多肽TCP-6共同孵育12小时。孵育结束后使用MTT法检测细胞活力。

实验结果如图1所示，TCP-6对顺铂诱导的人肾小管上皮细胞的凋亡具有缓解作用，且缓解效果具有浓度依赖性。

(II)将培养好的人肾小管上皮细胞以1.5×10

实验结果如图2所示，顺铂刺激人肾小管上皮细胞后，肾小管损伤标志物N-gal，凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-7与FADD的蛋白水平明显升高，但经TCP-6干预后各个蛋白的水平明显下降，表明TCP-6能够抑制顺铂诱导的人肾小管上皮细胞的凋亡。

实施例3：多肽TCP-6对小鼠顺铂模型肾脏急性损伤的抑制作用

1.实验动物：

C57小鼠，雄性，8周龄，体重20-22g，SPF级

先将动物称重、打耳钉编号，选择健康、体重在20-22g的小鼠24只，随机分为4组，每组6只，分别为假手术组、顺铂模型组及高剂量药物干预组、低剂量药物干预组。

2.实验分组：

(I)假手术组：以20μL/g的剂量，向小鼠腹腔注射生理盐水。记录并核实编号，置于相应鼠笼。

(II)顺铂模型组：以20μL/g的剂量，向小鼠腹腔注射含顺铂(1mg/mL)的生理盐水记录并核实编号，置于相应鼠笼。

(III)低剂量药物干预组：在顺铂模型组的基础上腹腔注射TCP-6生理盐水溶液，TCP-6的注射剂量为150μg/kg体重。

(IV)高剂量药物干预组：在顺铂模型组的基础上腹腔注射TCP-6生理盐水溶液，TCP-6的注射剂量为300μg/kg体重。

3.实验过程：

TCP-6水溶性的粉末用无菌生理盐水稀释为15μg/mL(低剂量)和30μg/mL(高剂量)的注射溶液。各组分笼饲养。假手术组仅观察。顺铂模型组仅给予含顺铂的无菌生理盐水尾静脉注射。术后24和48小时分别对低剂量药物干预组和高剂量药物干预组的小鼠注射相应浓度和剂量的TCP-6生理盐水溶液。顺铂注射后72小时处死各组小鼠，收集血标本，取左侧肾脏，分别予以10％中性缓冲甲醛固定及液氮冷冻组织。甲醛固定组织在经脱水、包埋、切片、制片后，分别予以PAS病理染色和Caspase-3免疫组织化学染色。冰冻组织匀浆后提取蛋白，用免疫印迹法(Western Blot)检测肾小管损伤标志物N-gal和凋亡相关蛋白Fas-L，p53，Cleaved Caspase-3的表达水平。

如图3-4所示，顺铂模型组的血清肌酐和尿素氮水平较假手术组均有明显升高，TCP-6干预后，高、低剂量药物干预组的血清肌酐尿素氮水平均明显下降。

如图5所示，与顺铂模型组相比，高、低剂量的TCP-6干预后小管损伤标志物N-gal，凋亡相关蛋白Fas-L，p53，Cleaved Caspase-3的蛋白水平均明显降低。而图6的免疫组织化学染色也证实TCP-6对肾小管损伤与凋亡的缓解作用。

实施例4：多肽TCP-6对小鼠缺血/再灌注模型肾脏急性损伤的抑制作用

1.实验动物：

C57小鼠，雄性，8周龄，体重20-22g，SPF级

先将动物称重、打耳钉编号，选择健康、体重在20-22g的小鼠18只，随机分为3组，每组6只，分别为假手术组、缺血/再灌注模型组及药物干预组。

2.实验分组：

(I)假手术组：室温，1％戊巴比妥钠以10μL/g的剂量麻醉小鼠。小鼠麻醉后固定于手术板上，腹部消毒，沿腹中线，从胸骨下端至耻骨联合上0.5cm，逐层切开至腹腔，发现双侧肾蒂后随即逐层缝合。局部消毒后，核实并记录标记，置于相应鼠笼。

(II)缺血/再灌注模型组：麻醉，固定，消毒，开腹同假手术组。开腹后寻找并稍微游离双侧肾蒂，使用无损伤微型动脉夹夹闭双侧肾蒂(先夹闭右侧，后夹闭左侧)，见肾脏有鲜红变成暗紫色，表示夹闭成功，将小鼠置于37摄氏度的金属加热板上，30分钟后松开双侧动脉夹，可见肾脏由黑紫色变成粉红色，表示再灌注成功。逐层缝合。局部消毒后，核实并记录标记，置于相应鼠笼。再静脉注射生理盐水溶液。

(III)药物干预组：同缺血/再灌注模型组，再静脉注射TCP-6生理盐水溶液。

3.实验过程：

将TCP-6水溶性的粉末用无菌生理盐水稀释为15μg/ml的注射溶液。各组分笼饲养。假手术组仅观察。缺血/再灌注模型组仅给予药物干预组等剂量的无菌生理盐水尾静脉注射。药物干预组在术后24和36小时分别按10μL/g的剂量注射配置好的TCP-6生理盐水溶液。手术后48小时处死各组小鼠，收集血标本，取左侧肾脏，分别予以10％中性缓冲甲醛固定及液氮冷冻组织。甲醛固定组织在经脱水、包埋、切片、制片后，分别予以PAS病理染色与Caspase-3免疫组织化学染色。冰冻组织匀浆后提取蛋白，用免疫印迹法(Western Blot)检测肾小管损伤标志物N-gal、Kim-1和凋亡相关蛋白FADD、p53、Cleaved Caspase-3的表达水平。

4.实验结果：

如图7-8所示，缺血/再灌注模型组的血清肌酐和尿素氮水平较假手术组均有明显升高，但TCP-6干预后，血清肌酐尿素氮水平均明显下降。

如图9所示，与缺血/再灌注模型组相比，经TCP-6干预后肾小管损伤标志物N-gal，Kim-1，凋亡相关蛋白FADD，p53，Cleaved Caspase-3的蛋白水平均明显降低。

如图10所示，PAS病理染色与Caspase-3免疫组织化学染色的结果表明，与缺血/再灌注模型组相比，经TCP-6干预后肾小管的损伤与凋亡情况均有明显缓解。

以上实施例表明多肽TCP-6可以明显缓解顺铂和缺血/再灌注损伤引起的血清肾功能指标的升高，显著降低肾小管的损伤和凋亡水平。因此，TCP-6可以成为有效抑制急性肾损伤的新药。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。