一种基于Cas12a蛋白的阪崎肠杆菌检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种基于Cas12a蛋白的阪崎肠杆菌检测方法及其应用。

背景技术

阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是一种革兰氏阴性菌，寄生在人和动物肠道内，属肠杆菌科。阪崎肠杆菌广泛存在于自然界中，是一种重要的食源性致病菌，不仅存在于污染的食品、新鲜的水果蔬菜中，还存在于家居环境、食品工厂中，其主要通过婴幼儿奶粉经消化道感染儿童，容易引起新生儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎，甚或遗留神经系统后遗症或导致死亡。近年来，婴幼儿奶粉以及婴幼儿食品中频繁出现阪崎肠杆菌，已引起全社会的广泛关注和重视。

传统的阪崎肠杆菌检测方法是培养方法，该方法检测周期长、漏检率高、程序复杂、所需试剂，已经远远不能满足现代的检测要求。分子生物学方法如聚合酶链式反应(PCR)以及等温核酸技术中的LAMP法已经建立起来，并且在阪崎肠杆菌的检测上已得到较好的应用，大大缩短了检测的时间。PCR技术如实时定量PCR、多重PCR以其高度的特异性及敏感性在阪崎肠杆菌检测方面取得了重大的突破，但是这些方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室。LAMP方法克服了PCR技术需要昂贵的设备仪器等缺点，具有操作简便，结果判断简单等优点，已应用于阪崎肠杆菌的检测，但是，LAMP技术要求多对引物且对靶基因的要求较高，设计比较繁琐，限制了其进一步的应用。重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种快速兴起的恒温扩增技术，通过能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和具有链置换功能的DNA聚合酶，在恒温(37℃)条件下即可获得可检测级别的扩增核酸，可以看成是等温条件下的PCR，但在实际检测过程中，需要筛选出很多的引物才能达到较高的灵敏度。

因此，建立一种方便快捷、准确度高的阪崎肠杆菌检测方法是至关重要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于Cas12a蛋白的阪崎肠杆菌检测方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于Cas12a蛋白的阪崎肠杆菌检测方法，采用由阪崎肠杆菌rpoB基因设计得到的RPA扩增引物组，在等温条件下利用Cas12a蛋白、crRNA、DNA报告分子和上述RPA扩增引物组检测阪崎肠杆菌，具体包括如下步骤：

S1、制备Cas12蛋白；

S2、根据保守的阪崎肠杆菌rpoB基因设计RPA扩增引物组，所述RPA扩增引物组经NCBI-blast比对显示，为特异的阪崎肠杆菌序列，所述阪崎肠杆菌rpoB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，

所述RPA扩增引物组由上游引物和下游引物组成，其中：

上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示；

下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示；

S3、基于Cas12a蛋白的特点，将扩增的基因片段序列设计为能够特异识别阪崎肠杆菌的crRNA，所述crRNA经NCBI-blast比对显示，为特异的rpoB基因序列，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示；

S4、基于Cas12a蛋白的特点，构建DNA报告分子；

S5、将如步骤S2所述的阪崎肠杆菌rpoB基因中的VP72基因的核酸序列克隆至pUc57质粒中，培养、提取得到含有阪崎肠杆菌DNA片段的阳性质粒；

S6、将步骤S5得到的阳性质粒制备成标准工作品，并将所述标准工作品加入扩增检测体系中，混合均匀后恒温反应15分钟，得到反应产物；

S7、将步骤S6得到的反应产物配制成CRISPR-Cas12a检测体系，再将所述CRISPR-Cas12a检测体系放入常温等温扩增荧光检测仪中恒温反应时间60分钟，得到检测结果。

优选的，步骤S4中，所述DNA报告分子序列为：荧光基团-TTATT-淬灭基团，所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC中的任意一种，所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任意一种。

作为本发明的进一步方案，步骤S6中，扩增检测体系包括如下组分：

优选的，所述核酸模板为步骤S6所述的标准工作品。

作为本发明的进一步方案，步骤S7中，CRISPR-Cas12a检测体系包括以下组分：

优选的，所述Cas12a蛋白为LbCas12a。

优选的，检测时的等温条件为37℃。

本发明还提供了一种上述基于Cas12a蛋白的阪崎肠杆菌检测方法在食品检测中的应用。

作为本发明进一步方案，检测方式包括但不限于试剂盒。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种方便快捷、准确度高的阪崎肠杆菌检测方法，可准确鉴定阪崎肠杆菌DNA，操作简便，无需像PCR一样通过变温仪器实现扩增检测，只需在37℃下进行等温扩增，10～60min即可完成检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明对不同浓度阪崎肠杆菌质粒DNA灵敏度的检测结果示意图；

图2为本发明的特异性检测结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

若如无特别说明，实施例中所使用的材料均可容易地从商业公司获取。

实施例1：

本实施例提供了一种基于Cas12a蛋白的阪崎肠杆菌检测方法，采用由阪崎肠杆菌rpoB基因设计得到的RPA扩增引物组，在等温条件下利用Cas12a蛋白、crRNA、DNA报告分子和上述RPA扩增引物组检测阪崎肠杆菌，具体包括如下步骤：

S1、制备Cas12蛋白：

(1)在NCBI上查找毛螺旋菌属的Cas12a蛋白(LbCas12a)的基因序列，GenBank序列号为MW477886.1，Cas12a基因的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。人工合成Cas12a基因并克隆到T载体上，然后用NdeI-HindIII双酶切，并将此片段克隆至pET-28a表达载体的NdeI和HindIII酶切位点之间，构建表达载体pET-28a-Cas12a；

(2)将步骤(1)中构建的表达载体pET-28a-Cas12a转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂于含30μg/ml Kan平板上，37℃培养12h～16h，挑取单克隆菌株，加入1L终浓度为30μg/ml的Kan的LB液体培养基中培养4h，再加入终浓度为0.7mM的IPTG诱导，30℃过夜培养，收取菌液，5000rpm离心30min后得菌体；

(3)用缓冲液对步骤(2)中得到的菌体进行超声破碎，取上清，10000rpm离心30min，纯化后用缓冲液冲洗至基线水平，然后用含咪唑浓度为250mM的缓冲液洗脱蛋白，洗脱后的蛋白经过sephadex G25色谱柱脱盐得到蛋白，-80℃保存，得到纯化后的Cas12a蛋白。

S2、根据保守的阪崎肠杆菌rpoB基因设计RPA扩增引物组，RPA扩增引物组经NCBI-blast比对显示，为特异的阪崎肠杆菌序列，阪崎肠杆菌rpoB基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，具体为

CCGTACCGTAAAGTGACCGACGGTGTGGTGACTGATGAAATTCATTACCTCTCCGCTATCGAAGAAGGTAACTACGTTATCGCGCAGGCGAACACCAACCTGACCGAAGAAGGCCGCTTCGCCGATGATTTGGTCACCTGCCGCAGCAAAGGCGAATCCAGCCTCTTCAGCGCAGACCAGGTTGACTATATGGACGTTTCCACCCAGCAGGTGGTTTCTGTCGGTGCGTCCCTGATCCCGTTCCTTGAG；

RPA扩增引物组由上游引物和下游引物组成，其中：

上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，具体为

GAAATTCATTACCTCTCCGCTATCGAAGAAG；

下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，具体为

CACCTGCTGGGTGGAAACGTCCATATAGTC。

S3、基于Cas12a蛋白的特点，将阪崎肠杆菌rpoB基因的基因片段序列(如SEQ IDNO.4)设计为能够特异识别阪崎肠杆菌的crRNA，crRNA经NCBI-blast比对显示，为特异的rpoB基因序列，crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示，具体为UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUCACCUGCCGCAGCAAAGG。

S4、基于Cas12a蛋白的特点，构建DNA报告分子，DNA报告分子序列为：荧光报告基团FAM-TTATT-淬灭基团BHQ1，5’端修饰FMA荧光报告基团，3’端修饰BHQ1淬灭基团。

S5、将步骤S2中的阪崎肠杆菌基因核酸序列(如SEQ ID NO.4所示)克隆至pUc57质粒中，克隆位点为SamI，抗性为氨苄抗性，克隆菌株为DH5α，将克隆后的质粒以1％接种量接种到含有100μg/ml氨苄的LB培养基中，在摇床(220rpm)中过夜培养；吸取菌液，采用天根质粒提取试剂盒提取得到含有阪崎肠杆菌DNA片段的阳性质粒，使用Nanodrop 2000检测浓度，并计算拷贝数，进行系列梯度稀释，以备后续使用。

S6、将步骤S5得到的阳性质粒制备成含有阪崎肠杆菌DNA片段的标准工作品，并将标准工作品加入扩增检测体系中，混合均匀后恒温反应15分钟，得到反应产物；

S7、将步骤S6得到的反应产物配制成CRISPR-Cas12a检测体系，再将CRISPR-Cas12a检测体系放入常温等温扩增荧光检测仪中恒温反应时间60分钟，得到检测结果。

步骤S6中，扩增检测体系包括如下组分：

核酸模板为含有阪崎肠杆菌DNA片段的标准工作品。

步骤S7中，CRISPR-Cas12a检测体系包括以下组分：

优选的，Cas12a蛋白为LbCas12a，检测时的等温条件为37℃。

本发明还提供了一种上述基于Cas12a蛋白的阪崎肠杆菌检测方法在食品检测中的应用，检测方式包括但不限于试剂盒。

实施例2：

本实施例提供了一种基于Cas12a蛋白的阪崎肠杆菌检测方法，本实施例与实施例1的不同之处在于，步骤S6中，按扩增检测体系配制反应液1-5，并分别在1.5ml EP管中混合均匀，分别吸取46.5μL反应液于对应的RPA反应单元(

具体为：工作标准品1(模板)，含有1.0×10

按照其余均与实施例1相同。

灵敏度试验：

根据上述检测方法，对不同浓度阪崎肠杆菌DNA片段进行灵敏度检测，具体步骤为：吸取实施例2步骤S6得到的反应产物，并配制成如实施例1所述的CRISPR-Cas12a检测体系，放入常温等温扩增荧光检测仪中恒温反应时间60分钟，设定反应温度为37℃。

检测结果如附图1所示，结果显示60分钟内均产生扩增信号，检测灵敏度高，能够快速灵敏的检出结果。

特异性试验：

根据上述检测方法，提取菌株核酸并进行检测，具体步骤为：

采用阪崎肠杆菌(Bntorobater sakazakii ATCC29544)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes ATCC19115)、沙门氏菌(Salmonella enteritidis ATCC15611)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25922)、副溶血性弧菌(Vibrio ParahemolyticusATCC17802)、志贺氏菌(Shigella flexneri ATCC12022)六种菌株，将上述菌株在LB培养基中过夜培养，使用核酸提取试剂盒分别提取阪崎肠杆菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌的基因组DNA，其余均与实施例2的检测方法一致，对其进行荧光检测，检测结果如附图2所示，结果显示本发明提供的检测方法具备良好的特异性。

本发明提供了一种方便快捷、准确度高的阪崎肠杆菌检测方法，可准确鉴定阪崎肠杆菌DNA，操作简便，无需像PCR一样通过变温仪器实现扩增检测，只需在37℃下进行等温扩增，10～60min即可完成检测。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

<110> 普诺圣肽(苏州）生物科技有限公司

<120> 一种基于Cas12a蛋白的阪崎肠杆菌检测方法

<130> 2010

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaaattcatt acctctccgc tatcgaagaa g 31

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacctgctgg gtggaaacgt ccatatagtc 30

<210> 3

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

uaauuucuac uaaguguaga ugucaccugc cgcagcaaag g 41

<210> 4

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgtaccgta aagtgaccga cggtgtggtg actgatgaaa ttcattacct ctccgctatc 60

gaagaaggta actacgttat cgcgcaggcg aacaccaacc tgaccgaaga aggccgcttc 120

gccgatgatt tggtcacctg ccgcagcaaa ggcgaatcca gcctcttcag cgcagaccag 180

gttgactata tggacgtttc cacccagcag gtggtttctg tcggtgcgtc cctgatcccg 240

ttccttgag 249

<210> 5

<211> 3687

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgagcaagc tggagaagtt tacaaactgc tactccctgt ctaagaccct gaggttcaag 60

gccatccctg tgggcaagac ccaggagaac atcgacaata agcggctgct ggtggaggac 120

gagaagagag ccgaggatta taagggcgtg aagaagctgc tggatcgcta ctatctgtct 180

tttatcaacg acgtgctgca cagcatcaag ctgaagaatc tgaacaatta catcagcctg 240

ttccggaaga aaaccagaac cgagaaggag aataaggagc tggagaacct ggagatcaat 300

ctgcggaagg agatcgccaa ggccttcaag ggcaacgagg gctacaagtc cctgtttaag 360

aaggatatca tcgagacaat cctgccagag ttcctggacg ataaggacga gatcgccctg 420

gtgaacagct tcaatggctt taccacagcc ttcaccggct tctttgataa cagagagaat 480

atgttttccg aggaggccaa gagcacatcc atcgccttca ggtgtatcaa cgagaatctg 540

acccgctaca tctctaatat ggacatcttc gagaaggtgg acgccatctt tgataagcac 600

gaggtgcagg agatcaagga gaagatcctg aacagcgact atgatgtgga ggatttcttt 660

gagggcgagt tctttaactt tgtgctgaca caggagggca tcgacgtgta taacgccatc 720

atcggcggct tcgtgaccga gagcggcgag aagatcaagg gcctgaacga gtacatcaac 780

ctgtataatc agaaaaccaa gcagaagctg cctaagttta agccactgta taagcaggtg 840

ctgagcgatc gggagtctct gagcttctac ggcgagggct atacatccga tgaggaggtg 900

ctggaggtgt ttagaaacac cctgaacaag aacagcgaga tcttcagctc catcaagaag 960

ctggagaagc tgttcaagaa ttttgacgag tactctagcg ccggcatctt tgtgaagaac 1020

ggccccgcca tcagcacaat ctccaaggat atcttcggcg agtggaacgt gatccgggac 1080

aagtggaatg ccgagtatga cgatatccac ctgaagaaga aggccgtggt gaccgagaag 1140

tacgaggacg atcggagaaa gtccttcaag aagatcggct ccttttctct ggagcagctg 1200

caggagtacg ccgacgccga tctgtctgtg gtggagaagc tgaaggagat catcatccag 1260

aaggtggatg agatctacaa ggtgtatggc tcctctgaga agctgttcga cgccgatttt 1320

gtgctggaga agagcctgaa gaagaacgac gccgtggtgg ccatcatgaa ggacctgctg 1380

gattctgtga agagcttcga gaattacatc aaggccttct ttggcgaggg caaggagaca 1440

aacagggacg agtccttcta tggcgatttt gtgctggcct acgacatcct gctgaaggtg 1500

gaccacatct acgatgccat ccgcaattat gtgacccaga agccctactc taaggataag 1560

ttcaagctgt attttcagaa ccctcagttc atgggcggct gggacaagga taaggagaca 1620

gactatcggg ccaccatcct gagatacggc tccaagtact atctggccat catggataag 1680

aagtacgcca agtgcctgca gaagatcgac aaggacgatg tgaacggcaa ttacgagaag 1740

atcaactata agctgctgcc cggccctaat aagatgctgc caaaggtgtt cttttctaag 1800

aagtggatgg cctactataa ccccagcgag gacatccaga agatctacaa gaatggcaca 1860

ttcaagaagg gcgatatgtt taacctgaat gactgtcaca agctgatcga cttctttaag 1920

gatagcatct cccggtatcc aaagtggtcc aatgcctacg atttcaactt ttctgagaca 1980

gagaagtata aggacatcgc cggcttttac agagaggtgg aggagcaggg ctataaggtg 2040

agcttcgagt ctgccagcaa gaaggaggtg gataagctgg tggaggaggg caagctgtat 2100

atgttccaga tctataacaa ggacttttcc gataagtctc acggcacacc caatctgcac 2160

accatgtact tcaagctgct gtttgacgag aacaatcacg gacagatcag gctgagcgga 2220

ggagcagagc tgttcatgag gcgcgcctcc ctgaagaagg aggagctggt ggtgcaccca 2280

gccaactccc ctatcgccaa caagaatcca gataatccca agaaaaccac aaccctgtcc 2340

tacgacgtgt ataaggataa gaggttttct gaggaccagt acgagctgca catcccaatc 2400

gccatcaata agtgccccaa gaacatcttc aagatcaata cagaggtgcg cgtgctgctg 2460

aagcacgacg ataaccccta tgtgatcggc atcgataggg gcgagcgcaa tctgctgtat 2520

atcgtggtgg tggacggcaa gggcaacatc gtggagcagt attccctgaa cgagatcatc 2580

aacaacttca acggcatcag gatcaagaca gattaccact ctctgctgga caagaaggag 2640

aaggagaggt tcgaggcccg ccagaactgg acctccatcg agaatatcaa ggagctgaag 2700

gccggctata tctctcaggt ggtgcacaag atctgcgagc tggtggagaa gtacgatgcc 2760

gtgatcgccc tggaggacct gaactctggc tttaagaata gccgcgtgaa ggtggagaag 2820

caggtgtatc agaagttcga gaagatgctg atcgataagc tgaactacat ggtggacaag 2880

aagtctaatc cttgtgcaac aggcggcgcc ctgaagggct atcagatcac caataagttc 2940

gagagcttta agtccatgtc tacccagaac ggcttcatct tttacatccc tgcctggctg 3000

acatccaaga tcgatccatc taccggcttt gtgaacctgc tgaaaaccaa gtataccagc 3060

atcgccgatt ccaagaagtt catcagctcc tttgacagga tcatgtacgt gcccgaggag 3120

gatctgttcg agtttgccct ggactataag aacttctctc gcacagacgc cgattacatc 3180

aagaagtgga agctgtactc ctacggcaac cggatcagaa tcttccggaa tcctaagaag 3240

aacaacgtgt tcgactggga ggaggtgtgc ctgaccagcg cctataagga gctgttcaac 3300

aagtacggca tcaattatca gcagggcgat atcagagccc tgctgtgcga gcagtccgac 3360

aaggccttct actctagctt tatggccctg atgagcctga tgctgcagat gcggaacagc 3420

atcacaggcc gcaccgacgt ggattttctg atcagccctg tgaagaactc cgacggcatc 3480

ttctacgata gccggaacta tgaggcccag gagaatgcca tcctgccaaa gaacgccgac 3540

gccaatggcg cctataacat cgccagaaag gtgctgtggg ccatcggcca gttcaagaag 3600

gccgaggacg agaagctgga taaggtgaag atcgccatct ctaacaagga gtggctggag 3660

tacgcccaga ccagcgtgaa gcactaa 3687

<210> 6

<211> 1228

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Ser Lys Leu Glu Lys Phe Thr Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr

1 5 10 15

Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile Asp

20 25 30

Asn Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Lys

35 40 45

Gly Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile Asn Asp

50 55 60

Val Leu His Ser Ile Lys Leu Lys Asn Leu Asn Asn Tyr Ile Ser Leu

65 70 75 80

Phe Arg Lys Lys Thr Arg Thr Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn

85 90 95

Leu Glu Ile Asn Leu Arg Lys Glu Ile Ala Lys Ala Phe Lys Gly Asn

100 105 110

Glu Gly Tyr Lys Ser Leu Phe Lys Lys Asp Ile Ile Glu Thr Ile Leu

115 120 125

Pro Glu Phe Leu Asp Asp Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Asn Ser Phe

130 135 140

Asn Gly Phe Thr Thr Ala Phe Thr Gly Phe Phe Asp Asn Arg Glu Asn

145 150 155 160

Met Phe Ser Glu Glu Ala Lys Ser Thr Ser Ile Ala Phe Arg Cys Ile

165 170 175

Asn Glu Asn Leu Thr Arg Tyr Ile Ser Asn Met Asp Ile Phe Glu Lys

180 185 190

Val Asp Ala Ile Phe Asp Lys His Glu Val Gln Glu Ile Lys Glu Lys

195 200 205

Ile Leu Asn Ser Asp Tyr Asp Val Glu Asp Phe Phe Glu Gly Glu Phe

210 215 220

Phe Asn Phe Val Leu Thr Gln Glu Gly Ile Asp Val Tyr Asn Ala Ile

225 230 235 240

Ile Gly Gly Phe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn

245 250 255

Glu Tyr Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Lys Thr Lys Gln Lys Leu Pro Lys

260 265 270

Phe Lys Pro Leu Tyr Lys Gln Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Leu Ser

275 280 285

Phe Tyr Gly Glu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val Phe

290 295 300

Arg Asn Thr Leu Asn Lys Asn Ser Glu Ile Phe Ser Ser Ile Lys Lys

305 310 315 320

Leu Glu Lys Leu Phe Lys Asn Phe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala Gly Ile

325 330 335

Phe Val Lys Asn Gly Pro Ala Ile Ser Thr Ile Ser Lys Asp Ile Phe

340 345 350

Gly Glu Trp Asn Val Ile Arg Asp Lys Trp Asn Ala Glu Tyr Asp Asp

355 360 365

Ile His Leu Lys Lys Lys Ala Val Val Thr Glu Lys Tyr Glu Asp Asp

370 375 380

Arg Arg Lys Ser Phe Lys Lys Ile Gly Ser Phe Ser Leu Glu Gln Leu

385 390 395 400

Gln Glu Tyr Ala Asp Ala Asp Leu Ser Val Val Glu Lys Leu Lys Glu

405 410 415

Ile Ile Ile Gln Lys Val Asp Glu Ile Tyr Lys Val Tyr Gly Ser Ser

420 425 430

Glu Lys Leu Phe Asp Ala Asp Phe Val Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys

435 440 445

Asn Asp Ala Val Val Ala Ile Met Lys Asp Leu Leu Asp Ser Val Lys

450 455 460

Ser Phe Glu Asn Tyr Ile Lys Ala Phe Phe Gly Glu Gly Lys Glu Thr

465 470 475 480

Asn Arg Asp Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Val Leu Ala Tyr Asp Ile

485 490 495

Leu Leu Lys Val Asp His Ile Tyr Asp Ala Ile Arg Asn Tyr Val Thr

500 505 510

Gln Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Lys Leu Tyr Phe Gln Asn Pro

515 520 525

Gln Phe Met Gly Gly Trp Asp Lys Asp Lys Glu Thr Asp Tyr Arg Ala

530 535 540

Thr Ile Leu Arg Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile Met Asp Lys

545 550 555 560

Lys Tyr Ala Lys Cys Leu Gln Lys Ile Asp Lys Asp Asp Val Asn Gly

565 570 575

Asn Tyr Glu Lys Ile Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met

580 585 590

Leu Pro Lys Val Phe Phe Ser Lys Lys Trp Met Ala Tyr Tyr Asn Pro

595 600 605

Ser Glu Asp Ile Gln Lys Ile Tyr Lys Asn Gly Thr Phe Lys Lys Gly

610 615 620

Asp Met Phe Asn Leu Asn Asp Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe Lys

625 630 635 640

Asp Ser Ile Ser Arg Tyr Pro Lys Trp Ser Asn Ala Tyr Asp Phe Asn

645 650 655

Phe Ser Glu Thr Glu Lys Tyr Lys Asp Ile Ala Gly Phe Tyr Arg Glu

660 665 670

Val Glu Glu Gln Gly Tyr Lys Val Ser Phe Glu Ser Ala Ser Lys Lys

675 680 685

Glu Val Asp Lys Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Tyr Met Phe Gln Ile

690 695 700

Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Asp Lys Ser His Gly Thr Pro Asn Leu His

705 710 715 720

Thr Met Tyr Phe Lys Leu Leu Phe Asp Glu Asn Asn His Gly Gln Ile

725 730 735

Arg Leu Ser Gly Gly Ala Glu Leu Phe Met Arg Arg Ala Ser Leu Lys

740 745 750

Lys Glu Glu Leu Val Val His Pro Ala Asn Ser Pro Ile Ala Asn Lys

755 760 765

Asn Pro Asp Asn Pro Lys Lys Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Val Tyr

770 775 780

Lys Asp Lys Arg Phe Ser Glu Asp Gln Tyr Glu Leu His Ile Pro Ile

785 790 795 800

Ala Ile Asn Lys Cys Pro Lys Asn Ile Phe Lys Ile Asn Thr Glu Val

805 810 815

Arg Val Leu Leu Lys His Asp Asp Asn Pro Tyr Val Ile Gly Ile Asp

820 825 830

Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Val Val Val Asp Gly Lys Gly

835 840 845

Asn Ile Val Glu Gln Tyr Ser Leu Asn Glu Ile Ile Asn Asn Phe Asn

850 855 860

Gly Ile Arg Ile Lys Thr Asp Tyr His Ser Leu Leu Asp Lys Lys Glu

865 870 875 880

Lys Glu Arg Phe Glu Ala Arg Gln Asn Trp Thr Ser Ile Glu Asn Ile

885 890 895

Lys Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val His Lys Ile Cys

900 905 910

Glu Leu Val Glu Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Glu Asp Leu Asn

915 920 925

Ser Gly Phe Lys Asn Ser Arg Val Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln

930 935 940

Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Met Val Asp Lys

945 950 955 960

Lys Ser Asn Pro Cys Ala Thr Gly Gly Ala Leu Lys Gly Tyr Gln Ile

965 970 975

Thr Asn Lys Phe Glu Ser Phe Lys Ser Met Ser Thr Gln Asn Gly Phe

980 985 990

Ile Phe Tyr Ile Pro Ala Trp Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser Thr

995 1000 1005

Gly Phe Val Asn Leu Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ser Ile Ala Asp

1010 1015 1020

Ser Lys Lys Phe Ile Ser Ser Phe Asp Arg Ile Met Tyr Val Pro

1025 1030 1035

Glu Glu Asp Leu Phe Glu Phe Ala Leu Asp Tyr Lys Asn Phe Ser

1040 1045 1050

Arg Thr Asp Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Tyr

1055 1060 1065

Gly Asn Arg Ile Arg Ile Phe Arg Asn Pro Lys Lys Asn Asn Val

1070 1075 1080

Phe Asp Trp Glu Glu Val Cys Leu Thr Ser Ala Tyr Lys Glu Leu

1085 1090 1095

Phe Asn Lys Tyr Gly Ile Asn Tyr Gln Gln Gly Asp Ile Arg Ala

1100 1105 1110

Leu Leu Cys Glu Gln Ser Asp Lys Ala Phe Tyr Ser Ser Phe Met

1115 1120 1125

Ala Leu Met Ser Leu Met Leu Gln Met Arg Asn Ser Ile Thr Gly

1130 1135 1140

Arg Thr Asp Val Asp Phe Leu Ile Ser Pro Val Lys Asn Ser Asp

1145 1150 1155

Gly Ile Phe Tyr Asp Ser Arg Asn Tyr Glu Ala Gln Glu Asn Ala

1160 1165 1170

Ile Leu Pro Lys Asn Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Ile Ala

1175 1180 1185

Arg Lys Val Leu Trp Ala Ile Gly Gln Phe Lys Lys Ala Glu Asp

1190 1195 1200

Glu Lys Leu Asp Lys Val Lys Ile Ala Ile Ser Asn Lys Glu Trp

1205 1210 1215

Leu Glu Tyr Ala Gln Thr Ser Val Lys His

1220 1225