用于治疗癌症的肽治疗剂及其用途

本申请要求于2018年8月27日提交的美国临时专利申请第62/723,428号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

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Bax抑制剂-1(Bax-1)已显示在细胞内具有调节细胞凋亡、ER应激、活性氧物质(ROS)产生、肌动蛋白细胞骨架动力学和胞质钙水平的多样作用(Robinson等，Oncogene30:2391-2400,2011)。BI-1的表达在人类癌症类型之间显著不同，该蛋白在乳腺癌、神经胶质瘤、前列腺癌、子宫癌和卵巢癌中高表达，但在胃癌、结肠癌、肾癌、肺癌和直肠癌中下调(Grzmil等,J Pathol 208:340-349,2006；Schmits等,Int J Cancer 98:73-77,2002；和del Carmen Garcia Molina Wolgien等,Eur J Gynaecol Oncol 26:501-504,2005)。

使用RNA干扰(RNAi)敲低乳腺癌和前列腺癌细胞中BI-1表达的先前研究导致在一些而非全部细胞系中的自发凋亡，表明BI-1对于某些癌症亚型的癌症存活是关键的(Grzmil等，J Pathol 208:340-349,2006；Grzmil等,Am J Pathol 163:543-552,2003；Lima等,Cancer Gene Ther 11:309-316,2004)。通过RNAi敲低BI-1后未经历自发凋亡的细胞显示细胞应激的迹象，并对凋亡诱导高度敏感。因此，BI-1是癌症治疗的独特但尚未测试的靶标候选物。

本文公开了包含BI-1调节结构域的Bax抑制剂-1(BI-1)调节肽。在一些实施方式中，BI-1调节肽包含靶向结构域，其能够赋予BI-1调节肽跨过哺乳动物细胞质膜的能力。这些BI-1调节肽可用于治疗癌症。

在一些实施方式中，BI-1调节结构域包含具有SEQ ID NO：22的序列或与SEQ IDNO：22的序列相差不超过一个氨基酸残基的序列的肽片段；和/或具有SEQ ID NO：23的序列或与SEQ ID NO：23的序列相差不超过一个氨基酸残基的序列的肽片段。在一些实施方式中，BI-1调节结构域包含具有SEQ ID NO：22和/或SEQ ID NO：23的氨基酸的肽片段。在特定实施方式中，BI-1调节结构域包含具有SEQ ID NO：22的序列的肽片段和具有SEQ ID NO：23的序列的肽片段。在特定实施方式中，具有SEQ ID NO：22的序列的肽片段在具有SEQ IDNO：23的序列的片段的氨基末端。在特定实施方式中，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的序列在该片段内重叠。

在一些实施方式中，BI-1调节结构域具有SEQ ID NO：16的序列。在一些实施方式中，BI-1调节结构域具有SEQ ID NO：17的序列。在一些实施方式中，BI-1调节结构域具有SEQ ID NO：18的序列。在一些实施方式中，BI-1调节结构域具有SEQ ID NO：19的序列。在一些实施方式中，BI-1调节结构域具有SEQ ID NO：20的序列。在一些实施方式中，BI-1调节结构域具有SEQ ID NO：21的序列。在一些实施方式中，BI-1调节结构域具有SEQ ID NO：24的序列。在一些实施方式中，BI-1调节结构域具有SEQ ID NO：25的序列。在一些实施方式中，BI-1调节结构域具有SEQ ID NO：26的序列。在一些实施方式中，BI-1调节结构域具有SEQID NO：27的序列。

在一些实施方式中，BI-1调节结构域能够结合BI-1蛋白。在一些实施方式中，BI-1调节结构域能够结合至SEQ ID NO：13的氨基酸序列内的BI-1蛋白内的位点。

在一些实施方式中，BI-1调节肽能够与脂质体偶联。在一些实施方式中，该肽能够与纳米颗粒缀合。

在一些实施方式中，靶向结构域是细胞穿透肽(CPP)。在一些实施方式中，靶向结构域是抗体或抗体的片段。在一些实施方式中，靶向结构域能够结合肿瘤相关抗原。在特定的实施方式中，靶向结构域在BI-1调节肽的氨基末端。在特定的实施方式中，靶向结构域在肽的羧基末端。

在一些实施方式中，BI-1调节肽的长度为5至400个氨基酸之间。在一些实施方式中，BI-1调节肽的长度为8至40个氨基酸之间。在一些实施方式中，BI-1调节肽的长度为15至45个氨基酸之间。在一些实施方式中，BI-1调节肽的长度为22至50个氨基酸之间。在一些实施方式中，BI-1调节肽的长度为30至60个氨基酸之间。在一些实施方式中，BI-1调节肽的长度为45至75个氨基酸之间。在一些实施方式中，BI-1调节肽的长度为6至100个氨基酸之间。在一些实施方式中，BI-1调节肽的长度为80至110个氨基酸之间。在一些实施方式中，BI-1调节肽的长度为280至320个氨基酸之间。

在一些实施方式中，BI-1调节肽具有与SEQ ID NO：19-23和48-87中任一个的序列具有至少85％的序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，BI-1调节肽具有与SEQ IDNO：19的序列具有至少85％的序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，该肽具有与SEQ ID NO：20的序列具有至少85％的序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，该肽具有与SEQ ID NO：21的序列具有至少85％的序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，该肽具有与SEQ ID NO：22的序列具有至少85％的序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，该肽具有与SEQ ID NO：23的序列具有至少85％的序列一致性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，BI-1调节肽包含化学修饰。在一些实施方式中，化学修饰是磷酸化、糖基化和/或脂化。在一些实施方式中，化学修饰是脂肪酸的共价连接。在一些实施方式中，化学修饰是肽的末端氨基的化学封闭。在一些实施方式中，化学修饰是肽的末端羧基的化学封闭。

在一些实施方式中，BI-1调节肽进一步包含Fc多肽或结构域。

在一些实施方式中，该肽进一步包含非肽接头。在一些实施方式中，该肽与一个或多个PEG分子缀合。

在某些实施方式中，BI-1调节肽能够穿过哺乳动物细胞的质膜。在一些实施方式中，哺乳动物细胞是人类细胞。

在另一方面，本文提供了包含BI-1调节肽和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方式中，药物组合物适合于肠胃外施用。在一些实施方式中，药物组合物适合于静脉内施用。在一些实施方式中，药物组合物适合于皮下施用。

在一些实施方式中，药物组合物中活性成分的浓度为100nM或更高。

在一些实施方式中，药物组合物在单剂量预填充注射器中。

在一些实施方式中，药物组合物包含适合于增强BI-1调节肽的溶解性的药学上可接受的载体。

在另一方面，本文提供了一种治疗患者的增殖性疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的BI-1调节肽或包含BI-1调节肽的药物组合物。在一些实施方式中，增殖性疾病是癌症。在一些实施方式中，所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、肺癌、子宫癌和结肠癌中的至少一种。在一些实施方式中，癌症是乳腺癌。

在一些实施方式中，施用BI-1调节肽或包含BI-1调节肽的药物组合物导致受试者细胞中的胞质钙水平。在一些实施方式中，施用所述肽或包含所述肽的药物组合物导致受试者细胞中H

在一些实施方式中，施用BI-1调节肽或包含BI-1调节肽的药物组合物在受试者中诱导赘生性细胞的死亡。在一些实施方式中，施用诱导受试者中赘生性细胞的凋亡和/或副凋亡。

在一些实施方式中，通过静脉内施用将BI-1调节肽或包含BI-1调节肽的药物组合物施用给受试者。在一些实施方式中，通过皮下施用来施用肽或药物组合物。在一些实施方式中，通过鞘内或小脑延髓池内施用来施用所述肽或药物组合物。

在一些实施方式中，该方法进一步包括施用第二有效量的进一步治疗。在特定的实施方式中，该进一步的治疗包括化学治疗剂、放射治疗或抗体或抗体片段。

在一些实施方式中，被施用BI-1调节肽或包含BI-1调节剂的药物组合物的受试者是哺乳动物。在特定的实施方式中，受试者是人。

参照以下描述和附图，将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点，其中：

图1A、图1B、图1C、图1D和图1E显示MQ001和MQ002与BI-1相互作用。图1A显示了HA标记的MQ001和MQ002与BI-1的共免疫沉淀后的免疫印迹结果；图1B显示了酵母双杂交分析的结果，证实了BI-1和MQ001以及BI-1和MQ002之间的相互作用；图1C显示了酵母双杂交分析的结果，确认了BI-1的N末端与MQ001之间以及BI-1的N末端与MQ002之间的相互作用。图1D显示了β-半乳糖苷酶测定的结果，其显示了MQ001和BI-1以及MQ001和BI-1的N末端40个氨基酸的相互作用；图1E显示了用HA-标记的MQ001或HA-标记的MQ002和Myc-标记的BI-1共转染的HeLa细胞的免疫荧光图像，显示了MQ001和BI-1的共定位以及MQ002和BI-1的共定位。

图2A、图2B和图2C显示MQ001和MQ002选择性地诱导人乳腺癌细胞中的细胞死亡。图2A中的图表显示了用MQ001和MQ002处理的MCF-7乳腺癌细胞与来源于正常乳腺组织的MCF-10F细胞相比具有凝集的细胞核和外部膜联蛋白-v的细胞的百分比；图2B显示了用MQ001和GFP-CPP(对照)处理的MCF-7细胞的流式细胞术分析；图2C显示了用MQ001和MQ002处理的MCF-7和MCF-10F细胞的MTT细胞活力测定的结果。

3A、3B和图3C提供的数据表明，MQ001和MQ002在几种乳腺癌亚型中诱导细胞死亡，和BI-1对于肽对乳腺癌细胞的治疗作用很重要。图3A所呈现的图表显示响应于用MQ001和MQ002的处理在测试的所有乳腺癌细胞系中观察到了凝集细胞核的增加；图3B显示了所测试的七个乳腺癌细胞系代表三种不同的乳腺癌亚型；图3C显示了BI-1的siRNA敲低的结果，表明在没有BI-1的情况下，MQ001和MQ002在乳腺癌细胞中不诱导细胞死亡。

图4呈现的图表显示了响应于MQ001和MQ002的处理的七个乳腺癌细胞系中具有外化的膜联蛋白-v的细胞的百分比。

图5显示了与用MQ70C处理的MCF-7细胞的相差显微镜图像相关的定量细胞死亡数据，表明MQ70C以剂量依赖性方式诱导细胞死亡。

图6A和图6B显示了用各种BI-1调节肽治疗后的MCF-7细胞的相差显微镜图像，显示所有测试的肽在MCF-7细胞中诱导细胞死亡。

图7A、图7B、图7C、图7D、图7E、图7F、图7G、图7H和图7I提供了表明BI-1调节肽MQ001和MQ002诱导乳腺癌以外的癌细胞中的细胞死亡的结果。图7A显示了在用MQ001和MQ002处理后，具有凝集细胞核的肺癌和乳腺癌细胞的百分比。图7B和图7C显示了用BI-1调节肽MQ30C处理的肺癌和结肠癌细胞随时间的相差显微镜图像。图7D显示了染色的免疫荧光图像，以评估用MQ16处理后卵巢癌细胞中的溶酶体和线粒体膜。图7E显示了四个卵巢癌细胞系的每一个中MQ16处理的剂量反应曲线。图7F显示了在用各种BI-1调节肽处理后卵巢癌细胞中的钙外流。图7G提供了免疫荧光图像，其显示了在用MQ16处理后子宫癌细胞中溶酶体的形成和线粒体膜的透化。图7H显示了五个子宫癌细胞系的每一个中MQ16处理的剂量反应曲线。图7I显示了响应于各种BI-1调节肽的处理子宫癌细胞中的钙外流。

图8A和图8B显示了在用MQ001、MQ002以及内在和外在的细胞凋亡诱导剂处理后，具有裂解的胱天蛋白酶3的MCF-7细胞的百分比。图8A中显示的结果证明，MQ001和MQ002对经受内在凋亡诱导剂的MCF-7细胞具有抗凋亡作用，但是对暴露于外在凋亡诱导剂的细胞没有相同的保护作用。图8B中显示的结果进一步证明，BI-1表达对于MQ001和MQ002的抗凋亡作用是必要的。

图9A和图9B显示了用MQ001和MQ002处理后具有凝集细胞核和外部膜联蛋白-v的非癌细胞的百分比。

图10A、图10B和图10C显示了在用MQ001或MQ002处理后(图10A)，在过表达BI-1的细胞中(图10B)和在用各种BI-1调节肽处理后(图10C)的细胞中胞质钙浓度的相对变化。

图11A和图11B显示了用MQ001和MQ002处理后细胞溶质ROS水平的变化(图11A)以及用MQ16处理后细胞形态和染色的变化(图11B)。

图12呈现了用HA-标记的MQ001或HA-标记的MQ002处理和对于存活线粒体染色的MCF-10F和MCF-7细胞的免疫荧光图像。

图13A、图13B和图13C显示了用MQ001和MQ002处理的细胞的免疫荧光和相态显微镜图像，显示了处理后ER形态的变化(图13A)和处理后肌动蛋白定位的破坏(图13B和图13C)。

图14A、图14B和图14C显示了用于ER(图14A)、自噬蛋白(图14B)和溶酶体(图14C)的标志物染色的细胞的免疫荧光显微图像。

图15A、图15B、图15C和图15D显示了评估MQ001和MQ002处理后MCF-10F和MCF-7细胞中磷酸化-JNK和磷酸化-ERK表达的免疫印迹(图15A)，评估BCL-2家族成员和UPR诱导的转录因子CHOP的RT-PCR结果的凝胶电泳(图15B)，评估用MQ001和MQ002处理后MCF-10F和MCF-7细胞中的磷酸化Bcl-2表达的免疫印迹(图15C)，以及与对照相比，用MQ001或MQ002处理后覆盖到具有细胞核凝集的细胞计数(黑条)上的ER破坏(白条)的定量(图15D)。

图16A和图16B呈现的图表显示了在用MQ001处理后人乳腺癌小鼠模型中肿瘤体积(图16A)和体重(图16B)的变化。

图17显示了评估MQ001在人乳腺癌小鼠模型中的毒性的H&E染色的结果。

图18A和图18B示出了MQ001在血浆(图18A)和微粒体(图18B)中的稳定性评估的结果。

定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。

术语“氨基酸”是指天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物。除非另有说明，术语“氨基酸”包含D和L立体异构体，如果相应的结构允许这样的立体异构形式。

天然氨基酸包括丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、蛋氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。

非自然氨基酸或非天然氨基酸包括但不限于，氮杂环丁烷羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、萘基丙氨酸(“naph”)、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸(“tBuG”)、2,4-二氨基异丁酸、锁链素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸(“hPro”或“homoP”)、羟基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸(“3Hyp”)、4-羟基脯氨酸(“4Hyp”)、异锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基丙氨酸(“MeAla”或“Nime”)、N烷基甘氨酸(“NAG”)(包括N-甲基甘氨酸)、N-甲基异亮氨酸、N-烷基戊基甘氨酸(“NAPG”)(包括N-甲基戊基甘氨酸)、N-甲基缬氨酸、萘基丙氨酸、正缬氨酸(“Norval”)、正亮氨酸(“Norleu”)、辛基甘氨酸(“OctG”)、鸟氨酸(“Orn”)、戊基甘氨酸(“pG”或“PGly”)、哌可酸、硫代脯氨酸(“ThioP”或“tPro”)、高赖氨酸(“hLys”)和高精氨酸(“hArg”)。

如本文所用，术语“哺乳动物”包括人类和非人类，并且包括但不限于人类、非人类灵长类、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛、马科动物和猪。

如本文所用，术语“肽”是指通过肽键连接在一起的氨基酸的聚合物。肽可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物和/或修饰的氨基酸。肽可以是天然存在的蛋白质或非天然(合成的)蛋白质或多肽的一部分或片段。

如本文所用，术语“突变肽”是指天然存在的肽的变体，其具有与被称为“野生型”序列的自然界中最常见的变体不同的氨基酸序列。与野生型肽相比，突变肽可包含一个或多个氨基酸置换、缺失或插入。

如本文所用，“保守”氨基酸置换是指用具有相似化学性质(例如大小或电荷)的另一种氨基酸取代肽或多肽中的氨基酸。为了本公开的目的，以下八组中的每一个包含彼此为保守置换的氨基酸：

1)丙氨酸(A)和甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)和赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)和缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；以及

8)半胱氨酸(C)和蛋氨酸(M)。

天然存在的残基可基于共同的侧基性质而分为多个种类，例如：极性带正电荷的(组氨酸(H)、赖氨酸(K)和精氨酸(R))；极性带负电荷的(天冬氨酸(D)，谷氨酸(E))；极性中性的(丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q))；非极性脂肪族的(丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、蛋氨酸(M))；非极性芳族的(苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W))；脯氨酸和甘氨酸；和半胱氨酸。如本文所用，“半保守”氨基酸置换是指肽或多肽中的氨基酸被具有共同侧基性质的另一氨基酸取代。

在一些实施方式中，除非另有说明，否则保守或半保守的氨基酸置换还可以涵盖具有与天然残基相似的化学性质的非天然存在的氨基酸残基。这些非天然残基通常通过化学肽合成而不是通过生物系统中的合成掺入。这些包括但不限于拟肽和其他逆向或反向形式的氨基酸部分。本文的实施方式包含天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物。例如，正亮氨酸可以用来置换蛋氨酸。

非保守置换可涉及将一个类别的成员交换为来自另一类别的成员。

如本文所用，术语“序列一致性”是指两个聚合物序列(例如，肽、多肽、核酸等)具有单体亚单元的相同顺序组成的程度。术语“序列相似性”是指两个聚合物序列(例如，肽、多肽、核酸等)仅通过保守和/或半保守氨基酸置换而不同的程度。通过以下方式计算“百分序列一致性”(或“百分序列相似性”)：(1)在比较窗口(例如，较长序列的长度、较短序列的长度、窗口等)上比较两个最佳比对的序列，(2)确定包含相同(或相似)单体(例如，两个序列中出现相同的氨基酸，两个序列中出现相似的氨基酸)的位置数以产生匹配位置数，(3)将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数(例如，较长序列的长度、较短序列的长度、指定窗口)，和(4)将结果乘以100以得出百分序列一致性或百分序列相似性。例如，如果肽A和B的长度均为20个氨基酸，并且除了1位以外的所有氨基酸均相同，则肽A和B具有95％的序列一致性。如果位于不同位置的氨基酸具有相同的生物物理特性(例如，两者均为酸性的)，则肽A和肽B将具有100％的序列相似性。再举一个例子，如果肽C的长度为20个氨基酸，而肽D的长度为15个氨基酸，并且肽D的15个氨基酸中有14个与肽C一部分中的那些氨基酸相同，则肽C和D具有70％的序列一致性，但肽D与肽C的最佳比较窗口具有93.3％的序列一致性。本文出于计算“百分序列一致性”(或“百分序列相似性”)的目的，将比对序列中的任何空位都视为在该位置的错配。

为了进行序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数，计算测试序列相对于参考序列的百分序列一致性。

为了本文的目的，使用BLAST算法执行百分一致性和序列相似性，这在Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中描述。可通过国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得进行BLAST分析的软件。

如本文所用，术语“受试者”广泛地指任何动物，包括但不限于人类和非人类动物(例如，狗、猫、牛、马、绵羊、猪、家禽、鱼、甲壳类动物，等)。如本文所用，术语“患者”是指人类受试者。

除非另有说明，否则“BI-1调节肽”是指与Bax抑制剂-1蛋白(BI-1)相互作用的肽。BI-1调节肽可以抑制或刺激BI-1活性。给定的BI-1调节肽可以在特定条件下在某些细胞中抑制BI-1，并可以在其他细胞中刺激BI-1。BI-1调节肽可通过一个或多个氨基酸残基直接结合BI-1。BI-1调节肽可以间接地与BI-1相互作用并调节BI-1，包括通过一个或多个信号传导分子。

如本文所用，术语“有效量”是指足以实现有益或期望的结果的组合物(例如，合成肽)的量。有效量可以一次或多次施用、应用或剂量来施用，并且不旨在限于特定的制剂或施用途径。

术语“治疗有效量”是有效改善疾病症状的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为可以将预防视为治疗。

如本文所用，术语“施用”和“给药”是指向受试者或者体内、体外或离体细胞、组织和器官给予药物、前药或其他药剂或者治疗性处理(例如肽)的行为。对人体的示例性施用途径可以是通过大脑或脊髓的蛛网膜下空间(鞘内)、眼睛(眼的)、嘴(口服)、皮肤(局部或经皮)、鼻(经鼻的)、肺(吸入)、口腔粘膜(颊或舌的)、耳朵、直肠、阴道、通过注射(例如，静脉内、皮下、肿瘤内、腹膜内等)等等。

如本文所用，术语“治疗”是指获得有益或预期的临床结果的途径。该有益或预期的临床结果可包括缓解症状、减轻疾病的严重程度、抑制疾病或病症的基础原因、将疾病稳定在非晚期状态、延缓疾病的进展和/或改善或减轻疾病状况。

如本文所用，术语“药物组合物”是指活性成分(例如，分离的BI-1调节肽)与惰性或活性的载体的组合，使得该组合物特别适合于体外、体内或离体的治疗或诊断用途。

如本文所用，术语“药学上可接受的”或“药理上可接受的”是指当施用于受试者时基本上不产生不良反应(例如毒性、变态或免疫反应)的组合物。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指任何标准药用载体，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如，油/水或水/油乳液)、甘油、液体聚乙二醇、非质子溶剂(如二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮及其混合物)以及各种类型的润湿剂、增溶剂、抗氧化剂、填充剂、蛋白质载体(如白蛋白)、任何和所有溶剂、分散介质、涂层、月桂基硫酸钠，等张剂和吸收延迟剂、崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)等。该组合物还可包含稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和辅助剂的实例，参见，例如，Martin,Remington'sPharmaceutical Sciences,21th Ed.,Mack Publ.Co.,Easton,Pa.(2005)，其通过引用整体并入本文。

必须注意的是，如说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”，“一种”和“该”包含复数对象，除非上下文另外明确指出。

6.1.BI-1调节肽

在第一方面，本文公开了分离的BI-1调节肽。

在各种实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过320个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过340个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过320个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过310个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过300个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过250个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过200个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过175个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过150个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过125个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过100个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过80个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过70个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过60个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过50个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过40个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过30个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过25个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过20个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过15个氨基酸。在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽的长度不超过10个氨基酸。

分离的BI-1调节肽包含BI-1调节结构域。

在某些实施方式中，分离的BI-1调节肽还包含靶向结构域。在一些实施方式中，BI-1调节肽进一步包含Fc多肽或结构域。

6.1.1.BI-1调节结构域

在某些实施方式中，BI-1调节肽的BI-1调节结构域包含一个或多个与BI-1结合的结合位点。该一个或多个结合位点中的每一个包含一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，该一个或多个结合位点中的至少一个在相邻位置处包含两个或更多的氨基酸残基。在一些实施方式中，该一个或多个结合位点中的至少一个在非相邻位置处包含两个或更多个氨基酸残基。

在一些实施方式中，BI-1调节结构域包含两个或更多个具有不同结合亲和力的BI-1结合位点。

在一些实施方式中，BI-1调节结构域包含与SEQ ID NO:18具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，BI-1调节结构域包含与SEQ ID NO:19具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，BI-1调节结构域包含与SEQID NO:20具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，BI-1调节结构域包含与SEQ ID NO:21具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，BI-1调节结构域包含与SEQ ID NO:22具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，BI-1调节结构域包含与SEQID NO:23具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性的氨基酸序列。

6.1.2.靶向结构域

在一些实施方式中，BI-1调节肽还包含靶向结构域，其能够跨哺乳动物细胞质膜转运BI-1调节肽。

在一些实施方式中，靶向结构域是细胞穿透肽。在一些实施方式中，靶向结构域包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，靶向结构域包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，靶向结构域包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，靶向结构域包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，靶向结构域包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，靶向结构域包含SEQ IDNO：31所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，靶向结构域包含SEQ ID NO：104所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，靶向结构域包含抗体或抗体的片段。

在一些实施方式中，靶向结构域在BI-1调节肽的N-末端。在一些实施方式中，靶向结构域在BI-1调节肽的C-末端。

6.1.3.化学修饰

在某些实施方式中，BI-1调节肽包含至少一个化学修饰。

在一些实施方式中，化学修饰是偶联的递送媒介。在一些实施方式中，偶联的递送媒介是脂质体。在一些实施方式中，偶联的递送媒介是纳米颗粒。

在一些实施方式中，化学修饰是非共价修饰。在某些实施方式中，化学修饰是共价连接的。在各种实施方式中，化学修饰是酰胺化、乙酰化、糖基化、脂化、磷酸化、聚乙二醇(PEG)修饰或硫酸化。

在一些实施方式中，化学修饰是脂肪酸的共价连接。在某些实施方式中，脂肪酸是饱和的。在某些实施方式中，脂肪酸是不饱和的。

在一些实施方式中，化学修饰包含在氨基酸侧基、末端氨或末端羧基上的一种或多种修饰。在一些实施方式中，化学修饰是末端氨基的化学封闭。在一些实施方式中，化学修饰是末端羧基的化学封闭。

6.1.4.突变

在某些实施方式中，BI-1调节肽包含至少一个突变。在一些实施方式中，该突变增加了BI-1调节肽对于结合BI-1的亲和力。在一些实施方式中，该突变降低了BI-1调节肽对于结合BI-1的亲和力。在一些实施方式中，突变改善了肽的治疗功效。

在一些实施方式中，该突变是氨基酸置换。在一些实施方式中，突变是氨基酸插入。在一些实施方式中，突变是氨基酸缺失。

在一些实施方式中，原始氨基酸被天然氨基酸置换。在一些实施方式中，原始氨基酸被非天然氨基酸置换。在一些实施方式中，原始氨基酸被化学修饰的氨基酸置换。

在各种实施方式中，氨基酸置换是保守或半保守置换。在一些实施方式中，氨基酸置换对所得肽的活性和/或结构具有最小的影响。

在各种实施方式中，氨基酸置换是非保守置换。在一些实施方式中，氨基酸置换在肽性质上产生显著变化。在某些实施方式中，亲水性残基被疏水性残基置换。在某些其他实施方式中，疏水性残基被亲水性残基置换。在某些实施方式中，具有大体积侧基的残基被不具有侧基的残基置换。在某些其他实施方式中，不具有侧基的残基被具有大体积侧基的残基置换。

6.2.BI-1调节肽的制备

本文还公开了产生分离的BI-1调节肽的方法。

6.2.1.重组合成

在某些实施方式中，本文公开的分离的肽是重组产生的，例如使用细菌、酵母或真核表达系统。

为了重组生产，将编码单结构域或多结构域肽的多核苷酸序列插入合适的表达媒介中，即，含有用于转录和翻译所插入的编码序列的必需元件的载体，或在RNA病毒载体的情况中，复制和翻译所必需的元件。然后将表达媒介转染到合适的靶细胞中，该靶细胞将表达单结构域或多结构域肽。然后，根据所使用的表达系统，通过本领域熟知的过程分离表达的肽。用于重组蛋白和肽产生的方法是本领域众所周知的。

为了提高产生效率，可以设计多核苷酸以编码被酶促切割位点分隔的单结构域或多结构域肽的多个单元。得到的多肽可以切割(例如，通过用适当的酶处理)以回收肽单元。这可以增加由单一启动子驱动的肽的产率。在一些实施方式中，可以设计多顺反子多核苷酸，使得转录编码多个肽的单个mRNA，每一个编码区可操作地连接至不依赖于帽的翻译控制序列，例如内部核糖体进入位点(IRES)。当在合适的病毒表达系统中使用时，由mRNA编码的每一个肽的翻译在转录物内部(例如通过IRES)指导。因此，多顺反子构建体指导单一的大的多顺反子mRNA的转录，其随之指导多个单独肽的翻译。该方法消除了多肽的产生和酶促加工，并且可以显著提高由单一启动子驱动的肽的产率。

多种宿主-表达载体系统可用于表达本文所述的肽。这些包括但不限于微生物，例如用含有适当编码序列的重组噬菌体DNA或质粒DNA表达载体转化的细菌；用含有适当编码序列的重组酵母或真菌表达载体转化的酵母或丝状真菌；用含有适当编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)或烟草花叶病毒(TMV))感染的或用含有适当编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。

表达系统的表达元件的强度和特异性不同。取决于所使用的宿主/载体系统，可以在表达载体中使用许多合适的转录和翻译元件中的任何一种，包括组成型和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子，例如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等。当在昆虫细胞系统中克隆时，可以使用如杆状病毒多面体启动子的启动子。在植物细胞系统中克隆时，可以使用源自植物细胞基因组的启动子(例如，热休克启动子、RUBISCO小亚基的启动子、叶绿素a/b结合蛋白的启动子)或源自植物病毒的启动子(例如，CaMV的35S RNA启动子、TMV的衣壳蛋白启动子)。当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子)。

6.2.2.化学合成

在一些实施方式中，通过化学合成产生本公开的分离的肽。在一些实施方式中，使用液相肽合成技术产生肽。在一些其他实施方式中，使用固相肽合成技术产生肽。

可以通过本领域众所周知的自动固相方法合成具有D-或L-构型的肽。可以通过利用“Boc”或“Fmoc”程序来进行合适的合成。固相合成的技术和过程是本领域众所周知的。也可以通过片段缩合的方法来制备单结构域和多结构域肽，如被描述于，例如，Liu等,Tetrahedron Lett.37:933-936,1996；Baca等,J.Am.Chem.Soc.117:1881-1887,1995；Tam等,Int.J.Peptide Protein Res.45:209-216,1995；Schnolzer和Kent,Science 256:221-225,1992；Liu和Tam,J.Am.Chem.Soc.116:4149-4153,1994；Liu和Tam,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:6584-6588,1994；以及Yamashiro和Li,Int.J.PeptideProtein Res.31:322-334,1988)。对于含甘氨酸的肽尤其如此。在Nakagawa等，J.Am.Chem.Soc.107:7087-7092,1985中描述了用于合成本公开的单结构域和多结构域肽的其他方法。

肽和肽类似物合成领域的普通技术人员已知的其他示例性技术由Bodanszky,M.和Bodanszky,A.,The Practice of Peptide Synthesis,Springer Verlag,New York,1994；以及有Jones,J.,Amino Acid and Peptide Synthesis,2nd ed.,OxfordUniversity Press,2002教导。Bodanszky和Jones的参考文献详细介绍了用于活化和偶联氨基酸和氨基酸衍生物的参数和技术。此外，这些参考文献教导了如何选择、使用和去除各种有用的功能和保护基团。

也可以从合成肽的商业供应商处购买具有D-或L-构型的肽。此类供应商包括，例如，Advanced ChemTech(Louisville，KY)、Applied Biosystems(Foster City，CA)、Bachem(Torrance，CA)、Anaspec(San Jose，CA)和Cell Essentials(Boston，MA)。

6.2.3.纯化

可以通过本领域众所周知的许多技术纯化本公开的肽或肽类似物，例如反相色谱、高效液相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、凝胶电泳等等。用于纯化特定单结构域和多结构域肽的实际条件将部分地取决于合成策略和诸如净电荷、疏水性、亲水性等的因素，并且对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。

在各种实施方式中，分离的BI-1调节肽还包含纯化标签。在一些实施方式中，纯化标签是多组氨酸标签、myc标签或HA标签。

6.3.药物组合物

本文还提供了药物组合物，其包含一种或多种本文所述的分离的BI-1调节肽作为活性成分，以及药学上可接受的载体。除了一种或多种BI-1调节肽之外，这些组合物还包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂、填充剂或本领域技术人员众所周知的其他赋形剂。此类材料应是无毒的，并且不应干扰活性成分的功效。药物组合物中的载体或其他材料的精确性质通常取决于施用途径，例如口服、静脉内、皮肤或皮下、鼻腔、肌肉内、腹膜内途径。可以例如使用目前用于配制治疗性肽(例如胰岛素、GLP-1激动剂以及FDA批准治疗性肽和蛋白质的THPdb数据库中公开的所有批准的肽(crdd.osdd.net/raghava/thpdb/))的任何制剂来配制BI-1调节肽。

用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊剂、粉末或液体形式。片剂可包含固体载体，例如明胶或辅助剂。液体药物组合物通常包含液体载体，例如水、石油，动物或植物油、矿物油或合成油。可以包含生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇的二醇类。

对于静脉内、皮肤或皮下注射或在患处的注射，活性成分将为肠胃外可接受的水性溶液形式，其无热原且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够使用例如等渗媒介(例如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液)来制备合适的溶液。根据需要可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。

6.4.治疗方法

本文还提供了用于治疗癌症的方法，包括但不限于乳腺癌、脑癌、子宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、胃癌、甲状腺癌和子宫癌。

在一些实施方式中，所述方法包含向患有癌症的受试者施用如本文所述的BI-1调节肽或药物组合物。在一些实施方式中，所述受试者处于发生癌症的风险中。

在各个实施方式中，受试者患有实体瘤癌症。

在某些实施方式中，所述受试者是哺乳动物。在某些实施方式中，受试者是人类。在一些实施方式中，受试者是成年人。在某些其他实施方式中，受试者是儿童。

在各种实施方式中，以足以减少受试者的肿瘤生长的量、时间表和持续时间施用肽或药物组合物。在一些实施方式中，以足以使肿瘤体积和/或肿瘤直径与刚开始治疗前的水平相比，减少10％、20％、25％、30％或更多的量、时间表和持续时间施用所述肽。在某些实施方式中，以足以使肿瘤体积和/或肿瘤直径减少至少35％、40％、45％、50％或更多的量、时间表和持续时间施用所述肽。在特定的实施方式中，以足以使肿瘤体积和/或肿瘤直径减少至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的量、时间表和持续时间施用所述肽。

在一些实施方式中，该方法包括通过静脉内施用来施用如本文所述的BI-1调节肽或药物组合物。在一些实施方式中，所述方法包括通过皮下注射施用所述肽。在一些实施方式中，该方法包含通过鞘内或小脑延髓池内施用来施用肽。在一些实施方式中，所述方法包括通过肿瘤内注射或肿瘤周注射施用所述肽。

在一些实施方式中，该方法包括根据待治疗的病症同时或相继地，与进一步的治疗组合施用BI-1调节肽。进一步的治疗可包括但不限于化学治疗剂、放射治疗、小分子抑制剂和抗体或抗体片段。

本发明的药学上有用的肽的施用优选以“治疗有效量”或“预防有效量”(视情况而定，尽管可以将预防视为治疗)，这足以显示出对个体的益处。实际施用的量以及施用的速率和时间过程将取决于所治疗的蛋白质聚集疾病的性质和严重性。治疗的处方，例如剂量的决策等，在全科医生和其他医生的责任范围内，并且通常考虑要治疗的疾病或障碍、个体患者的病情、递送部位、施用方法和从业人员已知的其他因素。上面提到的技术和方案的实例可以在Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.(ed),1980中找到。

7.其他实施方式

1.一种组合物，其包含：(i)NleH部分。

2.根据实施方式1的组合物，其进一步包含：(ii)与NleH部分偶联的靶向部分。

3.根据实施方式1或2中任一项的组合物，其中所述NleH部分是或包含：

(i)具有本文公开为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4的序列的多肽；

(ii)(i)的生物活性片段；或者

(iii)(i)或(ii)的生物活性序列变体。

4.根据实施方式3的组合物，其中所述生物活性片段是具有本文公开为SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的序列的多肽。

5.根据实施方式3或4中任一项的组合物，其中所述生物学活性序列变体与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少50％的序列一致性。

6.根据实施方式2至5中任一项的组合物，其中所述靶向部分结合肿瘤相关抗原。

7.根据实施方式6的组合物，其中所述肿瘤相关抗原是人Ephrin-B2或其同源物。

8.根据实施方式6或7中任一项的组合物，其中所述靶向部分是天青蛋白或保留天青蛋白的特征性结合活性的其片段或变体。

9.根据实施方式8的组合物，其中所述靶向部分是或包含：具有本文公开为SEQ IDNO：8的序列的多肽。

10.根据实施方式9的组合物，其中该组合物是融合蛋白，其具有或包含本文公开为SEQ ID NO：9的序列的多肽。

11.根据实施方式1的组合物，其由具有本文公开为SEQ ID NO：10的序列的多肽组成或包含具有本文公开为SEQ ID NO：10的序列的多肽。

12.根据实施方式6的组合物，其中所述靶向部分是抗体或抗体片段。

13.与NleH(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4)竞争结合BI-1(SEQ ID NO：11)的结合部分。

14.一种结合部分，其结合BI-1(SEQ ID NO：11)中被NleH(SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：4)结合的相同或重叠的表位。

15.根据实施方式13或权利要求14中任一项的结合部分，其中该结合部分结合具有本文公开为SEQ ID NO：12的序列的多肽。

16.根据实施方式13至15中任一项的结合部分，其中所述结合部分结合具有本文公开为SEQ ID NO.13的序列的多肽。

17.根据实施方式13至16中任一项的结合部分，其中所述结合部分是抗体或抗体片段。

18.一种缀合物，其包含与功能性部分偶联的根据实施方式13至17中任一项的结合部分。

19.根据实施方式18的缀合物，其中所述功能性部分促进所述缀合物的细胞内内化。

20.编码前述权利要求中任一项的组合物、结合部分或缀合物的核苷酸。

21.一种载体，其包含根据实施方式20的核苷酸。

22.用根据实施方式21的载体转化的细胞。

23.一种鉴定患有增殖性疾病的受试者的方法，该方法包括评估受试者或源自受试者的样品中BI-1的表达或活性水平。

24.根据实施方式23的方法，该方法鉴定具有发生增殖性疾病的特定风险的受试者，该方法包括评估受试者或源自受试者的样品中BI-1的表达或活性水平，BI-1的表达或活性水平增加表明受试者发生增殖性疾病的风险增加。

25.一种在受试者中预后与增殖性疾病相关的结果的方法，所述方法包括评估受试者或源自受试者的样品中BI-1的活性或表达。

26.根据实施方式25的方法，其中BI-1的活性或表达相对于对照样品的增加指示对用能够抑制BI-1活性的药剂的治疗的敏感性。

27.一种选择患者，优选人类患者来治疗增殖性疾病的方法，该方法包括识别具有升高的BI-1活性或表达的患者，并因此选择所鉴定的患者用于使用能够抑制BI-1活性的药剂的治疗。

28.根据实施方式27的选择患者的方法，其中所述能够抑制BI-1活性的药剂是实施方式1至19中任一项的组合物、结合部分或缀合物。

29.根据实施方式23至28中任一项的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

30.根据实施方式29的方法，其中所述受试者是人类。

31.根据实施方式23至30中任一项的方法，其中所述增殖性疾病是癌症。

32.根据实施方式31的方法，其中所述癌症是乳腺癌。

33.根据实施方式23至32中任一项的方法，其中相对于对照样品测定受试者或源自受试者的样品中的表达或活性水平。

34.一种BI-1调节剂，用于治疗增殖性病症。

35.根据实施方式34的BI-1调节剂，其中所述病症是癌症。

36.根据实施方式35的BI-1调节剂，其中所述癌症是乳腺癌。

37.根据实施方式34-36中任一项的BI-1调节剂，其中所述调节剂是BI-1活性的抑制剂。

38.一种选择可用于预防、抑制或治疗增殖性病症的药物化合物的方法，该方法包括提供一组用于测试的候选药物化合物，在测试系统中测试候选药物化合物结合BI-1的能力，并根据结合BI-1的能力选择候选药物化合物。

39.根据实施方式38的方法，还包括在体外和/或体内模型中测定候选化疗药物对乳腺癌细胞的细胞毒性的步骤。

40.根据实施方式38或39中任一项的方法，其中选择实质或完全结合BI-1的候选药物化合物。

41.根据实施方式40的方法，其中在测试系统中被候选者结合的BI-1的比例大于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％。

42.一种药物组合物，其包含根据前述实施方式中任一项的组合物、结合部分、缀合物、核苷酸、载体或BI-1调节剂，以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。

43.根据实施方式42的药物组合物，其还包含第二治疗剂。

44.根据实施方式42或43中任一项的药物组合物，其用于治疗方法中。

45.根据实施方式42或43中任一项的药物组合物，其用于治疗增殖性疾病的方法中。

46.根据实施方式42或43中任一项的药物组合物在制备用于治疗增殖性疾病的方法的药物中的用途。

47.一种治疗患有增殖性疾病的受试者的方法，所述方法包括向受试者，优选人类受试者施用根据实施方式42或43中的任一项的药物组合物；任选地，其中根据检测的BI-1活性或表达水平来调整受试者的治疗。

48.根据实施方式42至47中任一项的药物组合物、用途或方法，其中所述增殖性疾病是癌症。

49.根据实施方式48的药物组合物、用途或方法，其中所述癌症是乳腺癌。

8.实施例

以下是用于实施本发明的具体实施方式的实例。提供这些实施例仅出于说明目的，而无意以任何方式限制本发明的范围。已经尽力确保所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是，当然应该允许一些实验误差和偏差。

除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。文献中对这些技术进行了充分的解释。

直接酵母双杂交(Y2H)筛选

PCR扩增编码MQ001或MQ002的多核苷酸，并将其在GAL4DNA结合结构域的下游克隆到pGBT9(Clontech)中。克隆的产物在TOP10(Clontech)中表达，并使用Qiagen MiniprepKit纯化质粒。pGBT9-MQ001和pGBT9-MQ002被转化至带有空pGAD424或具有BI-1、BI-140(BI-1的前40个氨基酸)的酵母菌株AH109(Clontech)中。用空pGBT9转化pGAD424 BI-1/BI-140作为阴性对照。如Clontech酵母实验方案手册(Clontech Yeast Protocols Handbook，PT3024-1)中所述，使得AH109具有化学感受态和热休克。转化的酵母初始接种在缺少腺嘌呤和组氨酸的SD最低琼脂上，证实了pGBT9和pGADT7的共转化。将阳性菌落接种在缺乏腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸和酪氨酸的SD最低琼脂平板上，以确认存在质粒以及两个克隆的目的蛋白之间发生的任何相互作用。

β-半乳糖苷酶测定

根据制造商的方案(Clontech PT3024–1手册)进行β-半乳糖苷酶测定。简而言之，使用乙酸锂方法将单独的pGADT7-BI-1或pGADT7-BI-140质粒或与pGBT-MQ001(或必要时，pGBT9、pGBT9-MQ002)一起转化至酿酒酵母菌株PJ69-4A中。在Trp2 Leu2平板上选择转化子，并使其生长至0.6的光密度(D600nm)，然后进行裂解，并使用ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活性水平。报告的数据来自至少三个一式三份进行的生物学重复。

MTT细胞存活力测定

在评估之前，细胞未处理或在24孔组织培养板中处理24小时。用PBS洗涤细胞一次，并用含0.1mg/ml的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)(Sigma)的DMEM替换1h，然后将培养基除去，并向各个孔中加入100ml二甲基亚砜(DMSO，Sigma)。在定轨振荡器上充分混合1分钟后，使用FLUOstar Omega微孔板阅读器(BMG Labtech)获得每一个孔在540nm处的吸光度。从至少三个一式三份进行的生物学重复获得结果。

细胞溶质钙(Ca

根据制造商的说明，使用市售的荧光指示剂Fluo-4 Direct(Invitrogen)测量细胞溶质Ca

细胞在96孔微孔板中生长，用MQ001、MQ002、对照(CPP-GFP)或阳性对照(Thapsigargin–加入Fluo-4后约100分钟)处理12小时，并与Fluo-4 Direct在37℃下孵育1h。使用荧光计测定荧光强度，该荧光计设置用于在494nm下激发和在516nm下发射。

用于评估ROS水平的NBT测定

使用硝基蓝四唑盐(NBT)还原成绿松石色的产物来间接估计在处理的MCF-7和对照细胞中产生的细胞内ROS水平。将NBT(1mg/ml，100μl)添加到处理的细胞中，和然后在37℃的CO

蛋白质印迹分析

所有样品均在10-12％SDS-PAGE凝胶上运行，并通过常规方法转移至PVDF膜或硝酸纤维素膜上，以比较诱导型质粒的表达水平。将膜用含0.1％Tween(Sigma)的TBS洗涤两次，然后与含5％BSA(Sigma)(对于单克隆抗体)或5％市售奶粉(多克隆抗体)的TBS0.1％Tween一起孵育1小时。将膜与一抗(使用的稀释度由供应商指定)孵育1小时(RTP)或过夜(4℃)；补充附图3中提供了所用抗体的列表。然后将膜在TBS.0.1％Tween中洗涤3次，并与偶联至辣根过氧化物酶(HRP)的抗兔或抗小鼠二抗(1：2000)(Cell Signalling)孵育和孵育1小时(RTP)。膜使用ECL试剂(GE Healthcare)显色，并在LAS 3000Fuji Imager中进行检测。

免疫印迹

以下抗体用于免疫印迹，抗His(Sigma)、抗GST(Abcam)、抗微管蛋白(Abcam)、抗Myc(Abcam)、抗Bcl-2、抗Bcl-2(Ser70)、抗Bcl-2(Thr56)、抗磷酸ERK、抗磷酸JNK、抗ERK、抗JNK、抗CHOP、抗ATF6、抗PERK、抗IRE1α被用于免疫印迹。所有的印迹使用在TBS-0.1％Tween中的5％BSA进行。使用Restore

组织培养、MQ001/MQ002剂量和转染

使细胞系在含1000mg/L葡萄糖并补充10％(v/v)胎牛血清、非必需氨基酸和glutamax的DMEM中，在5％(v/v)CO

免疫荧光染色和共定位

半汇合的细胞单层在盖玻片上生长，并在磷酸盐缓冲液(PBS)pH 7.4中用3％多聚甲醛(Sigma)在RTP下固定15分钟。用PBS洗涤细胞3次，并用氯化铵(10mM)中和多聚甲醛10分钟。将细胞用含0.2％Triton-X(Sigma)的PBS透化4分钟，并在PBS中再洗涤两次，然后在含1％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)的PBS中孵育10分钟。然后将细胞与一抗在RTP下孵育1小时，或者如果制造商指南推荐，则在4℃下过夜。将盖玻片在PBS中洗涤两次，再用含1％BSA的PBS洗涤一次，将它们与适当的二抗孵育45分钟。在共定位的情况下，首先放置一抗和与该一抗相对应的二抗。加入第二种一抗，并确保二抗体自不同来源(即如果在小鼠中产生了第一种一抗，则在兔子中产生第二种一抗)。根据制造商的指导使用诸如MitoTracker或DAPI的染料。

盖玻片在PBS中洗涤3次和在高压灭菌的蒸馏水中再洗涤一次，并使用ProLongGold抗荧光淬灭剂(antifade)(Invitrogen)在载玻片上封片。在Zeiss Axioimager免疫荧光显微镜上以32或100倍的放大倍率观察盖玻片，并使用Axiovision Rel 4.5软件进行分析。在众多视野中对细胞进行了计数，从任何一张盖玻片至少计数600-9000个细胞；所有实验重复三到五次。所有计数均以双盲方式进行。除非另有说明，否则所有抗体来自CellSignaling。抗兔IgG，HRP连接的抗体#7074、抗小鼠IgG，HRP连接的抗体#7076、抗BI-1抗体(ab18852)(Abcam)、GST抗体#2622、抗GST抗体(ab19256)(Abcam)、His-标签(27E8)小鼠mAb#2366、HA-标签(6E2)小鼠mAb#2367、抗Myc标签抗体(ab9106)(Abcam)、β-肌动蛋白(8H10D10)小鼠mAb#3700、

流式细胞术和细胞分选

使细胞在T75烧瓶中生长直至约70％汇合(1.6e106细胞)，并以0.2mg/ml浓度的MQ001或对照处理96小时的时间。每24小时取样一次，并根据其前向散射和侧向散射模式对所有细胞进行评估。前向散射与细胞体积相关，而侧向散射与细胞内部复杂性(即细胞核的形状、细胞质颗粒的量或膜粗糙度)相关。将烧瓶上的贴壁细胞用PBS洗涤和进行胰蛋白酶处理，然后重悬于DMEM中以产生单细胞悬液。立即在BD LSRFortessa(BD Biosciences)上评估细胞悬液。MQ001和对照都具有GFP标签，在MQ001样品中显示MQ001内化的细胞的摄取和治疗，这些均以黑色突出显示。

膜联蛋白V和凝集细胞核计数

细胞在T25烧瓶中补充有10％胎牛血清、非必需氨基酸(Sigma)的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基低葡萄糖(1g/升；Invitrogen)中生长至70％融合。然后将细胞用MQ001、MQ002、对照(CPP-GFP)处理或不处理12h以诱导凋亡。然后按照制造商提供的实验方案使用膜联蛋白V-荧光素异硫氰酸凋亡检测试剂盒(产品目录号K101-100；BioVision)收集和标记漂浮和附着细胞。通过FACS分析来自每一种条件的104个细胞以鉴定其为膜联蛋白V阳性的细胞。也将收集的细胞的等分试样以106个细胞/ml悬浮在具有2g/ml Hoechst染料的PBS中，并通过UV显微法确定具有凋亡核形态的细胞的百分比。如上所述，该数据通过个体计数和使用免疫荧光的重复实验来证实。

RT-PCR

根据制造商的方案进行Verso一步式RT-PCR(Thermo Scientific)。引物作为Apoptosis Multiplex试剂盒的部分购自Sigma。

免疫沉淀/共免疫沉淀

将细胞如所述在T75 cm

微粒体稳定性

通过7-乙氧基香豆素(m/z 191)的损失及7-羟基香豆素(7-OHC，m/z 163)和7-OHC葡糖苷酸(m/z 339)的形成来证实微粒体反应系统的生活力。将微粒体与尿苷5'-二磷酸-葡糖醛酸(UDPGA)辅因子溶液A(BD Gentest)以2μM的反应浓度与溶液B(BD Gentest)；50mMTris–HCl，8mM MgCl2，和25μg丙甲菌素在去离子水中一起孵育。将MQ001加入单个反应混合物中以产生最终浓度10μM，并将反应混合物(0.5ml)在37℃下一式三份孵育规定的时间，和用0.1ml7％的高氯酸淬灭，在12,500rpm(11,0009g)下离心5分钟。将上清液转移到自动进样器小瓶中进行分析。使用底物/代谢物阳性对照(7-乙氧基香豆素/7-羟基香豆素；7-乙氧基香豆素/7-羟基香豆素葡糖酸苷)和与每组底物反应平行进行的四个阴性对照反应来验证反应系统。

动物实验

根据1986年动物科学程序法案(1986Animal Scientific Procedures Act)处理所有小鼠，并在英国政府内政部批准的项目许可证70/8586下进行实验。在第0天，将所有接受MCF-7或MDA-MB-231人乳腺癌细胞(ATCC)的动物培养在含有5％FBS的αMEM(LifeTechnologies)中。两种细胞系均在T-150烧瓶中生长，并根据融合产生5-10×10

将雌性BALB/c小鼠(每种乳腺癌类型n＝30；8周龄；18-20g)随机分配到各组(n＝10)；三个组是PBS、对照、MQ001。将动物圈养在22±5℃下，12小时光/暗周期，并自由喂养啮齿动物饮料和水。如下进行原位乳腺脂肪垫植入：雌性BALB/c小鼠通过Matrx VMS麻醉机(Midmark Corporation)在通过连续吸入2％异氟烷气体5-10分钟的麻醉下接种乳腺脂肪垫中的上述细胞重悬液。用无菌镊子提起第四乳头，并用注射器针头(BD Biosciences)将细胞或组织悬浮液直接植入乳腺脂肪垫中。在所有研究中，向小鼠皮下植入了17β-雌二醇持续释放的小丸(Innovative Research)。肿瘤转换率(tumor take rate)在95-100％的范围内。

使用卡尺每周两次测量肿瘤长度(L)和宽度(W)，并且将肿瘤体积(V)计算为[V＝(L×W2)/2]。3周后，将携带平均体积约为200mm

组织病理学

在最终终点(治疗后20天)收集每只小鼠的肺、心脏、脑、肾、脾和肝的分段，冲洗其内容物，并在10％缓冲福尔马林中固定以进行显微镜检查。然后按照标准技术处理福尔马林固定的组织，石蜡包埋，以5μm切片，并用苏木精和曙红(H&E)染色。

BI-1调节肽被设计成与细胞调节剂BI-1相互作用并调节细胞调节剂BI-1。BI-1可通过适应于促凋亡和抗凋亡刺激来对细胞途径以信号以抑制、延迟或促进细胞凋亡以及存活(Robinson等，Oncogene 30:2391-2400,2011)。已显示细菌蛋白效应物的NIeH家族与BI-1结合并抑制凋亡信号传导(Hemrajani等，Proc Natl Acad Sci 107:3129-3134,2010)。

为了制备与癌细胞中的BI-1相互作用并调节BI-1的治疗上有用的肽，制备了具有假单胞菌蛋白天青蛋白的28氨基酸结构域(p28)和NIeH效应蛋白NIeH1的融合蛋白。已显示p28结构域负责azurin优先进入癌细胞(Yamada等，Mol.Cancer Ther.8:2947-2958,2009)。

通过在单个阅读框中将编码p28和NIeH1的多核苷酸克隆到细菌表达载体中来创建BI-1调节肽MQ001，其中编码p28的核苷酸在编码NIeH1的核苷酸序列的5'侧。将得到的质粒DNA扩增并转化到大肠杆菌中。随后使用上述提供的方法生长、收获和纯化用质粒DNA转化的大肠杆菌的培养物以分离p28-NIeH1融合蛋白。p28-NIeH1融合蛋白MQ001具有SEQ IDNO：16所示的氨基酸序列。

基于结构算法设计另外的BI-1调节肽以确保治疗性肽、BI-1和其他潜在相互作用蛋白之间的最小干扰。通过修饰NIeH1的C末端序列创建了几种BI-1调节肽。使用NIeH1的157个C末端氨基酸产生BI-1调节肽MQ157(SEQ ID NO：17)。使用通过在肽的N端添加丙氨酸、丝氨酸和甲硫氨酸修饰的NIeH的77个C末端氨基酸来产生BI-1调节肽MQ70(SEQ ID NO：18)。另外的BI-1调节肽MQ30(SEQ ID NO：19)、MQ22(SEQ ID NO：20)、MQ16(SEQ ID NO：21)、MQ8A(SEQ ID NO：22)、MQ8B(SEQ ID NO：23)、MQ45(SEQ ID NO：24)和MQ60(SEQ ID NO：25)全部具有与NIeH1的C-末端的部分对准的氨基酸序列。

通过在先前产生的治疗性肽的N-或C-末端上添加9至28个氨基酸范围的肽序列来产生另外的BI-1调节性肽。另外的肽序列对BI-1调节肽赋予癌细胞靶向和细胞膜穿透特性。这些另外的BI-1调节肽的序列显示在下面第10节的序列表中(SEQ ID NOs 32-103)。

评估BI-1调节肽MQ001和MQ002与BI-1直接相互作用的能力。来自用HA标记的MQ001、MQ002或GFP(对照)转染的HeLa细胞的裂解液的免疫沉淀结果表明，MQ001和MQ002均与BI-1相互作用，因为内源BI-1在与抗HA磁珠一起孵育后与HA标记的肽共免疫沉淀(图1A)。

在酿酒酵母中进行直接酵母双杂交筛选以确认BI-1调节肽MQ001、MQ002两者与BI-1之间的相互作用。结果证明，MQ001和MQ002分别与BI-1相互作用(图1B)。进一步的酵母双杂交筛选进一步证明，MQ001和MQ002分别与BI-1的40个N末端氨基酸的至少一部分相互作用(图1C)。

还使用酿酒酵母进行了β-半乳糖苷酶报告体测定，以进一步证实MQ001与BI-1相互作用。在给定分析中测量的β-半乳糖苷酶活性水平可用于比较所选转化子的蛋白质-蛋白质相互作用的相对强度。图1D中显示的结果表明，与MQ001和全长BI-1的相互作用相比，MQ001和BI-1的N末端之间的相互作用强度仅略有降低。

与HA标记的MQ001或MQ002和Myc标记的BI-1共转染的HeLa细胞被固定并与荧光团偶联的抗HA和抗Myc抗体一起孵育。处理的细胞的免疫荧光图像显示MQ001和MQ002各自与BI-1共定位(图1E)。

分别用MQ001、MQ002或GFP(对照)处理源自癌性乳腺组织(MCF-7)和非癌性乳腺组织(MCF-10F)的细胞12小时，和然后使用上述方法评估其凋亡标志物，包括细胞核凝集和细胞表面上膜联蛋白-V的存在。结果(图2A)显示，MQ001和MQ002两者诱导乳腺癌细胞的凋亡，但不诱导源自健康乳腺组织的乳腺细胞凋亡。

为了进一步评估用MQ001或MQ002处理后的乳腺癌和非癌性乳腺癌细胞的生存力，将细胞用MQ001、MQ002处理或保持未处理(对照)24小时，和然后通过MTT测定法评估。图2C中的结果显示，用MQ001或MQ002处理的MCF-7细胞显示出显著较低水平的还原形式的MTT，表明用MQ001或MQ002处理减少存活的MCF-7细胞的数量，同时保持MCF-10F细胞相对不受影响。

随后将MCF-7细胞用GFP标记的MQ001或仅GFP(对照)处理96小时。每24小时通过流式细胞术评估细胞样品的前向和侧向散射模式。与对照相比，在用MQ001处理的细胞中观察到明显更多的前向散射和侧向散射，表明在MQ001处理的细胞中较大比例的濒死细胞(图2B)。

为了评估MQ001和MQ002是否在所有乳腺癌来源的细胞系或仅MCF-7细胞中诱导细胞死亡，用MQ001、MQ002或GFP(对照)处理另外七种乳腺癌来源的细胞系，和然后如上所述评估凝集细胞核和外部膜联蛋白-V的存在。图3A和图4所示的结果表明，用MQ001或MQ002进行处理在96小时的时间内诱导所有七种乳腺癌细胞系的100％的细胞死亡。如图3B所确定的，评估的7种乳腺癌细胞系来自5种乳腺癌亚型。

为了评估BI-1对MQ001和MQ002诱导MCF-7细胞中的细胞死亡的能力的重要性，使用BI-1反义寡核苷酸来敲低BI-1表达(BI-1

进行了另外的研究以评估BI调节肽MQ70C和MQ30C处理对源自乳腺癌组织的细胞(MCF-7)以及源自非癌性乳腺癌组织的细胞(MCF-10A)的效果。细胞用各种浓度的MQ70C或MQ30C处理24小时。图5所示的定量结果表明，BI-1调节肽MQ30C和MQ70C以剂量依赖性方式诱导MCF-7细胞死亡。

用3μM、6μM、8.4μM和12μM的MQ70C处理的MCF-7细胞在处理4小时20分钟、6小时30分钟或19小时40分钟之后通过相差显微镜成像。与用较低浓度的MQ70C处理的细胞相比，用较高浓度的MQ70C处理的细胞在较短的时间内可见与细胞死亡一致的细胞形态变化(图6A)，这与BI-1调节肽以剂量依赖的方式诱导乳腺癌细胞的细胞死亡的评估一致。

为了评估多种BI-1调节肽并比较每一种肽诱导细胞死亡的能力，将MCF-7细胞分别用以下BI-1调节肽中的每一种处理6.5小时：MQ30-TAT(SEQ ID NO:105)、MQ16C(SEQ IDNO:71)、MQ30F1C(SEQ ID NO:49)、MQ70-TAT(SEQ ID NO:106)、MQ22(SEQ ID NO:20)、MQ16(SEQ ID NO:21)、FLMQ31F1C(SEQ ID NO:57)、FLF1BMQ31(SEQ ID NO:56)、F1NMQ30(SEQ IDNO:48)和MQ22C(SEQ ID NO:63)。在高负载(1mg/mL肽浓度)和中等负载(0.6mg/mL肽浓度)下用每一种BI-1调节肽处理MCF-7细胞。结果显示在图6B中。

为了确定BI-1调节肽是否在乳腺癌以外的癌细胞中诱导细胞死亡，用BI-1调节肽处理源自乳腺癌以外的癌症组织的细胞系并评估细胞死亡的标志物。在肺癌细胞系HOP64和H460以及前列腺癌细胞系PC3中评估用MQ001和MQ002处理的效果。图7A中的结果显示，与MCF-7乳腺癌细胞中约50％和60％的细胞死亡诱导相比，MQ001诱导约30％的肺癌细胞的细胞死亡，和MQ002诱导约20％的肺癌细胞的细胞死亡。相反，用MQ001和MQ002处理前列腺癌细胞不会诱导细胞死亡(图7A)。

用0.14mg/mL的BI调节肽MQ30C处理肺癌细胞(A549)和结肠癌细胞(HCT-116)。通过相差显微镜在多达48小时(肺癌细胞)或24小时(结肠癌细胞)的多个时间点对细胞成像。图7B和图7C的结果显示，用MQ30C处理的大多数细胞的形态随时间变化。在处理5小时后拍摄的40X图像似乎显示了，与使用单独CPP处理的细胞相比，在MQ30C处理的细胞中ER的破坏。处理96小时后，用MQ30C处理的A549和HCT-116细胞中超过85％死亡(数据未显示)。

卵巢癌组(ATCC-1021)用BI调节肽激发，并通过相差和免疫荧光显微镜评估细胞的形态学变化，包括细胞核凝集、ER破坏、溶酶体形成和线粒体膜透化。还评估细胞的细胞溶质钙水平、活性氧物质(ROS)水平的变化，且通过台盼蓝和细胞生存力测定法对细胞进行评估。来自卵巢癌细胞系SW626的细胞的免疫荧光图像(图7D)显示，与对照相比，用BI-1调节肽MQ16处理的细胞中溶酶体的形成和线粒体膜的透化，与通过MQ16诱导的细胞死亡一致。图7E显示了四种卵巢癌细胞系中每一种的MQ16处理的剂量反应曲线。在用各种BI-1调节肽处理后，在SW626细胞中测量细胞溶质钙水平。图7F的结果显示细胞中响应于每种BI-1调节肽的处理而不响应于CPP-GFP(对照)的处理的钙流出，表明治疗性肽诱导了钙从细胞内钙存储的释放，从而促进细胞死亡。

子宫癌组(ATCC-1023)用BI调节肽激发，并通过相差和免疫荧光显微镜评估细胞的形态学变化，包括细胞核凝集、ER破坏、溶酶体形成和线粒体膜透化。还评估细胞的细胞溶质钙水平、活性氧物质(ROS)水平的变化且通过锥虫蓝和细胞生存力测定法评估。来自子宫癌细胞系CRL-1671的细胞的免疫荧光图像(图7G)显示，与对照相比，用BI-1调节肽MQ16处理的细胞中溶酶体的形成和线粒体膜的透化，其与MQ16诱导的细胞死亡一致。在图7H中显示了五种子宫癌细胞系中的每一种中MQ16处理的剂量反应曲线。在用各种BI-1调节肽处理后，在CRL-1671细胞中测量了细胞溶质钙水平。图7I中的结果显示细胞中响应于每一种BI-1调节肽的处理而不响应于CPP-GFP(对照)处理的钙流出，表明该治疗性肽诱导了钙从细胞内钙存储的释放，从而促进细胞死亡。

为了评估MQ001和MQ002是否在非癌性细胞中诱导抗凋亡作用，MCF-10F细胞用MQ001或MQ002处理24小时，且然后暴露于内在的细胞凋亡诱导剂：星形孢菌素(STS)、衣霉素(TUN)或布雷菲德菌素A(BFA)，或者外在的细胞凋亡诱导剂：TNFα(TNF)。图8A中的结果表明，MQ001和MQ002均防止经历内在细胞凋亡诱导剂的MCF-7细胞中的凋亡，但是对经历外在的细胞凋亡诱导剂TNF的MCF-7细胞没有抗凋亡作用。结合实施例3和4中概述的实验结果，该数据表明BI-1的促凋亡和抗凋亡功能均可以通过BI-1相互作用肽来调节，BI-1根据细胞的性质可选地发挥功能以诱导或防止细胞凋亡。

为了进一步研究BI-1的重要性，BI-1反义(BI-1

对非癌性人类细胞系MCF-10F、HMEC-1和MCF-12A进行了另外的研究以评估如前所述用MQ001、MQ002或对照(GFP-CPP)处理后的细胞凋亡标志物。图9A和9B中的结果表明，MQ001和MQ002处理在非癌性细胞系MCF-10F、HMEC-1和MCF-12A中不诱导细胞死亡。该数据与从实施例3和4中概述的实验获得的数据相结合，表明BI-1调节肽MQ001和MQ002选择性地诱导癌细胞中的细胞死亡。

为了评估MQ001和MQ002调节ER钙浓度且因此细胞溶质钙浓度的BI-1调控的能力，用MQ001、MQ002、GFP-CPP(对照)或Thapsigargin(阳性对照)处理乳腺癌细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)以及非癌细胞系(MCF-10F和HMEC-1)12小时，然后与荧光钙指示剂Fluo-4Direct(Invitrogen)孵育1小时。在经受每种处理条件的细胞中测量荧光强度。图10A中的结果显示，MQ001和MQ001的处理显著提高乳腺癌细胞中的细胞溶质钙浓度，而在用MQ001和MQ002处理的非癌性细胞中未观察到细胞溶质钙的增加。因此，数据证明MQ001或MQ002与BI-1的相互作用不会自动诱导细胞内钙释放，因为非癌性细胞(图10A)或PC3前列腺癌细胞(数据未显示)在MQ001或MQ002处理后均未表现出细胞溶质钙水平的增加。

用BI-1转染乳腺癌细胞和非癌性细胞以诱导BI-1的过表达，和随后在不存在BI-1调节肽处理的情况下测量细胞中的细胞溶质钙水平。图10B中的结果显示，单独的BI-1的过表达不足以诱导乳腺癌或非癌性细胞中的细胞内钙释放。

为了评估通过各种BI-1调节肽的处理诱导的细胞溶质钙浓度的相对变化，将乳腺癌细胞与各种BI-1调节肽以及GFP-CPP(对照)和Thapsigargin(阳性对照)孵育19小时，和然后如上所述评估细胞溶质钙水平。图10C中的结果显示，用于处理细胞的BI-1调节剂的浓度提高导致细胞内钙释放增加，且因此细胞溶质钙水平提高。

为了评估用BI-1调节肽处理的细胞中细胞内钙释放是否伴随ROS产生的增加，用MQ001、MQ002或GFP-CPP(对照)处理乳腺癌细胞(MCF-7和MDA-MB-231)和非癌性细胞(MCF-10F和HMEC-1)24小时，和然后使用NBT分析评估细胞内ROS水平。图11A中的结果表明，与MQ001或MQ002处理后的乳腺癌细胞中细胞溶质钙水平的提高相似，在MQ001或MQ002处理后乳腺癌细胞中细胞溶质ROS水平类似地提高。如同细胞溶质钙一样，用MQ001或MQ002处理的非癌性细胞中的细胞溶质ROS水平保持不变(图11A)。

为了进一步评估在用BI-1调节肽MQ16处理之后的ROS产生，在有或没有MQ16的情况下将MCF-7细胞处理8小时，和然后用CellRox Green试剂(Thermo Fisher)染色以探测氧化应激的诱导。CellRox中的弱荧光染料在通过ROS氧化后表现出亮绿色的光稳定荧光。图11B(右图)中的结果表明，MQ16处理后MCF-7细胞中诱导氧化应激并且ROS水平升高。

使用线粒体靶向的MitoSox Red试剂(Thermo Fisher)评估了MQ16处理治疗后超氧化物的存在。MitoSox中的红色荧光染料被超氧化物氧化，但不被其他ROS和活性氮物质(RNS)氧化。氧化产物在可存活的线粒体中具有高荧光性。将MCF-7细胞在有或没有MQ16的情况下处理8小时，和然后用MitoSox Red染色。图11B(左图)中的结果显示在未用BI-1调节肽处理的对照细胞中的红色荧光线粒体，表明超氧化物的存在。用MQ16处理的细胞显示出弥散的红色荧光，与线粒体膜的透化和细胞裂解一致。结果表明，用BI-1调节肽处理癌细胞诱导存活线粒体的损失。

为了评估用MQ001和MQ002处理的细胞中线粒体膜的完整性，对来自乳腺癌细胞系MCF-7和来自非癌性乳腺癌细胞系MCF-10F的细胞用HA标记的MQ001或HA标记的MQ002进行处理。将细胞与MitoTracker一起孵育以染色存活的线粒体(图12，顶部)和荧光标记的抗HA抗体(图12，底部)。图12中的结果显示了用MQ001或MQ002处理的MCF-10F细胞中完整的线粒体，而用MQ001处理MCF-7乳腺癌细胞导致细胞中线粒体膜的透化。

为了评估BI-1调节肽MQ001和MQ002是否破坏肌动蛋白动力学，用Myc-标记的MQ001或Myc-标记的MQ002处理MCF-7细胞，并使用与荧光团偶联的抗体对肌动蛋白和Myc染色。通过免疫荧光显微镜拍摄的图像(图13C-D)显示，与对照相比，用MQ001和MQ002处理的细胞中肌动蛋白的定位似乎被破坏。肌动蛋白表现为与MQ001和MQ002共定位，表明用MQ001和MQ002处理MCF-7细胞可引起细胞的肌动蛋白动力学被破坏，从而导致细胞结构的崩塌。相差显微镜图像(图13A，右图)显示，与对照相比，在用MQ001和MQ002处理的MCF-7细胞中ER表现出变形。此外，细胞的免疫荧光图像显示，MQ001和MQ002肽在处理的细胞中表现定位于ER处。

如上所述进行了另外的实验以评估细胞形态和蛋白质定位。在某些研究中，细胞还用ER标志物钙联接蛋白、溶酶体标志物和抗体染色以标记自噬介导蛋白LC3。结果表明，与对照细胞相比，MQ001和MQ002表现为破坏ER的结构，且此外，MQ001和MQ002都表现出定位于MCF-7细胞中的ER处(图14A)。

为了评估BI-1调节肽处理的癌细胞中的细胞死亡是否由通过自噬介导，使用抗微管相关蛋白1轻链3(LC3)抗体对细胞进行荧光探测。LC3参与自噬过程中的自噬体形成。图14B中的结果表明，在用对照(CPP)处理后以及用MQ001和MQ002处理后，LC3在整个细胞中扩散。用BI-1调节肽处理后，LC3在癌细胞中不定位于自噬体，表明由MQ001和MQ002诱导的细胞死亡不是通过这些细胞中的自噬介导的。染色细胞的其他图像显示，BI-1调节肽MQ16C的处理诱导MCF-7细胞中溶酶体的形成(图14C)。

为了评估用BI-1调节肽MQ001和MQ002处理是否通过ER应激反应(称为未折叠蛋白反应(UPR))诱导癌细胞中的细胞死亡，通过Western印迹评估来自MQ001和MQ002处理的细胞的裂解物中JNK、ERK1/2和Bcl-2的磷酸化的增加。通过PCR进一步评估UPR诱导的转录因子CHOP的活化。结果表明，MQ001和MQ002处理不导致JNK磷酸化的增加(图15A)及仅CHOP的少量激活(图15B)。MQ001和MQ002诱导MCF-10F细胞中的ERK1/2磷酸化(图15A)，这已经证明对于通过下调ROS产生和抑制线粒体透化而促进细胞存活是重要的(Kim等，BiochimBiophys Acta 1823:876-888,2012)。用MQ001或MQ002处理后，在MCF-7细胞中未观察到ERK磷酸化升高(图15A)。

为了证实MQ001和MQ002阻止UPR的激活，评估了由XBP-1的IRE1剪接介导的抗凋亡基因的上调，XBP-1是一种上调抗凋亡Bcl-2以抑制细胞凋亡的UPR转录因子。MQ001和MQ002处理不导致Bcl-2或Bcl-xL表达的任何变化(图15B)，支持MQ001和MQ002抑制癌细胞中的IRE1的概念。此外，在用MQ001或MQ002处理后，未观察到Bcl-2或Bcl-xL的磷酸化的增加或减少(图15C)。

计数在MQ001或MQ002处理后具有破坏的ER形态的MCF-7细胞以及在MQ001或MQ002处理后具有凝集细胞核的MCF-7细胞(均在超过96小时的时程内)。图15D显示了如通过免疫荧光计数的ER破坏的定量(白色条)，覆盖在是具有核凝集的细胞计数(黑色条)上。用MQ001和MQ002处理的细胞显示出与对照相比相似的ER降解速率，和显著更高的核凝集，两者都随时间增加(图15D)。

为了评估BI-1在乳腺癌存活和肿瘤发生中的作用，将管腔AMCF-7或基底MDA-MB-231人乳腺癌细胞注射入8周龄的balb/c雌性小鼠中。在使原发性肿瘤能够在小鼠中建立的生长期之后，将肿瘤用MQ001、对照或安慰剂治疗5天。MQ001治疗的肿瘤在治疗20天内肿瘤大小和体积显著减小(图16A)。用MQ001治疗的小鼠最初体重减轻，但在治疗过程期间大多恢复了减轻的体重(图16B)。MQ001治疗后，通过H&E染色评估主要器官的毒性。在任何主要器官中未观察到出血或其他毒性迹象(图17)。

根据本文所述的方法，在体外评估了MQ001在人、小鼠和非人灵长类(NHP)血浆中的稳定性。结果表明，在人血浆中孵育50小时后，大约50％的MQ001保持完整(图18A)。

还根据本文所述的方法在微粒体中评估了MQ001的稳定性。结果表明6小时后，在微粒体中约40％的MQ001保持完整(图18B)。

尽管已经参照优选实施方式和各种可选的实施方式具体示出和描述了本发明，但是相关领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。

出于所有目的，在本说明书的主体内引用的所有参考文献、已授权专利和专利申请在此全文以引用方式并入本文。