香辛料赋予酱卤肉制品滋味成分的鉴定方法

技术领域

本发明涉及酱卤肉制品滋味技术领域。更具体地说，本发明涉及一种香辛料赋予酱卤肉制品滋味成分的鉴定方法。

背景技术

香辛料具有悠久的历史，资源十分丰富。我国现行的GB/T12729.1-2008b标准香辛料和调味品名称中列入的香辛料共68种。随着现代香辛料产业的兴起，香辛料的产量逐年增加，人们对香辛料的研究和利用也日益深入。酱卤牛肉加工过程中用到的香辛料主要有花椒、辣椒、丁香、甘草等，这些香辛料在肉制品的加工过程中，不仅可以掩盖原料的腥味等特征，还可以增强肉制品的香味或赋予其独特的滋味，使酱卤牛肉的味道更加鲜美。

然而在酱卤肉制品的加工过程中，香辛料的利用率甚至不足50％。为了使酱卤肉制品达到理想的风味和口感，香辛料在肉制品的卤制过程中被过量添加，因而产生大量卤制废料，不仅能耗高还造成资源的浪费。为解决上述问题，在酱卤肉制品的加工过程中香辛料的精准定量变得尤为重要，这将为香辛料的有效利用及酱卤肉制品风味的调控提供技术指导。

目前，对于香辛料中非挥发性风味物质测定的研究已经较为成熟，其中包括黄酮类、香豆素类、生物碱等化合物，例如研究表明甘草中含有甘草素、甘草苷等二氢黄酮类化合物，这些化合物一般具有甜味；辣椒中不仅含有辣椒素、二氢辣椒素，还含有槲皮素等黄酮类物质，而槲皮素具有苦味。但并非香辛料中所有的非挥发性风味物质均对酱卤肉制品的风味具有重要贡献。现有技术中虽然可以利用GC-MS来鉴定化合物，但关于气相色谱、液相色谱或质谱等图谱，由于温度、pH、样品稀释度、盐浓度等因素容易造成保留时间的漂移和谱峰的化学位移，因此需要对原始图谱数据进行相应的处理，便于后续的统计分析。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种香辛料赋予酱卤肉制品滋味成分的鉴定方法，其根据超高效液相色谱-质谱联用技术对香辛料赋予酱卤肉制品的滋味成分进行鉴定，依据该鉴定方法能够有效判断香辛料赋予酱卤肉制品的滋味成分，为酱卤肉制品加工过程中香辛料的应用提供一个客观、可靠的技术指导。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，根据本发明的一个方面，本发明提供了香辛料赋予酱卤肉制品滋味成分的鉴定方法，其主要包括以下步骤：利用超高效液相色谱-质谱联用技术，对香辛料赋予酱卤肉制品的非挥发性化合物进行检测，过滤质谱扫描数据，将原始图谱转换为数据矩阵，对齐谱峰，再将数据归一化、标准化，在多个数据库中检索匹配的碎片光谱和化合物，鉴定滋味成分；

其中，所述对齐谱峰的公式为：

(1)λx＝α-y，x∈R

(2)

(3)

公式(1)～(3)中：C为波系数的二维矩阵；S为信号；α为在300～1500nm范围的光谱波段；ψ

优选的是，所述数据归一化的方法为，采用总峰面积归一化法消除或减轻由于采集过程中的明显差异所致的物质浓度的不均一性。

优选的是，所述标准化的公式为：

(4)

(5)K

(6)

公式(4)～(6)中，τ是对应的物质；n为物质的个数；a

优选的是，所述多个数据库包括mzCloud数据库、KEGG数据库、OTCM高分辨液质数据库、Chemspider数据库、以及Chembook数据库。

优选的是，在多个数据库中检索匹配的碎片光谱和化合物的方法为：在mzCloud数据库、KEGG数据库和OTCM高分辨液质数据库中搜索鉴定香辛料赋予酱卤肉制品的非挥发性化合物，再根据三个数据库的搜索结果检索Chemspider数据库和Chembook数据库，确定其中滋味成分。

优选的是，利用超高效液相色谱-质谱联用技术，对香辛料赋予酱卤肉制品的非挥发性化合物进行检测的具体步骤为：

将不同种的香辛料干燥，粉碎，按酱卤肉中香辛料的配方比例称取各香辛料的重量，混合均匀，加入250mL 80％甲醇水溶液、0.5mL乙酸锌溶液和0.5mL亚铁氰化钾溶液，密封后开小孔超声提取2h，超声温度为60℃，静置，离心，离心温度为4℃，取上清液过滤浓缩定容至50mL，用注射器吸取2mL过0.45μm的有机滤膜，获得复合香辛料提取液，于4℃下保存备用；

取一组肉样，将肉样按照酱卤肉的生产工艺预煮，捞出，加入水和食盐，再加入按酱卤肉中香辛料的配方比例配制的混合香辛料粉末，卤煮，浸泡后捞出，获得混料肉样，将混料肉样用绞肉机充分搅碎并混合均匀，称取5g置于离心管中，加入20mL 80％的甲醇水溶液、0.5mL乙酸锌溶液和0.5mL亚铁氰化钾溶液，涡旋混匀，在40℃的水浴下超声提取20min，离心，离心温度为4℃，取上清液过滤并转移至烧杯中，沉淀物中再次加入20mL 80％的甲醇水溶液，涡旋混匀，离心，合并上清液并定容至50mL，用注射器吸取2mL过0.45μm的有机滤膜，获得混料煮肉提取液，于4℃下保存备用；

另取一组同等重量的肉样，按照酱卤肉的生产工艺预煮相同的时间，捞出，加入等量的水和食盐，卤煮相同的时间，浸泡相同的时间后捞出，获得盐水肉样，将盐水肉样用绞肉机充分搅碎并混合均匀，称取5g置于离心管中，加入20mL 80％的甲醇水溶液、0.5mL乙酸锌溶液和0.5mL亚铁氰化钾溶液，涡旋混匀，在40℃的水浴下超声提取20min，离心，离心温度为4℃，取上清液过滤并转移至烧杯中，沉淀物中再次加入20mL 80％的甲醇水溶液，涡旋混匀，离心，合并上清液并定容至50mL，用注射器吸取2mL过0.45μm的有机滤膜，获得盐水煮肉提取液，于4℃下保存备用；

利用超高效液相色谱-质谱联用的方法，对所述复合香辛料提取液、混料煮肉提取液及盐水煮肉提取液中的非挥发性化合物进行检测比对，确定复合香辛料提取液及混料煮肉提取液中共有，而盐水煮肉提取液中并未检出的非挥发性化合物，为香辛料所赋予酱卤肉制品的非挥发性化合物。

优选的是，所述不同种的香辛料包括花椒、辣椒、丁香、甘草、白芷、陈皮、八角、桂皮、白蔻、小茴香、山萘、香叶、草果等。

优选的是，超高效液相色谱的条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相：A为0.1％的甲酸和乙腈，B为0.1％的甲酸水溶液；洗脱剃度：0～15.0min，5％～90％B；15.0～20.0min，90％～90％B；20～20.10min，90％～5％B；20.10～30min，5％～5％B；流速0.3mL/min；柱温30℃；进样量5μL。

优选的是，质谱的条件为：离子源：电喷雾离子源(ESI)；鞘气(N

本发明至少包括以下有益效果：

第一、本发明鉴定方法能够在基于超高效液相色谱-质谱联用的分析方法对香辛料对酱卤肉制品滋味的贡献及其赋予酱卤肉制品的滋味成分进行研究，以期为酱卤肉制品的滋味调制技术研发提供技术指导；

第二、本发明对谱峰对齐的方法进行改进，并对对齐公式和标准化公式进行了整合，降低了计算复杂度，同时提高结果准确性；

第三、本发明采用多元统计分析方法，并与OTCM高分辨液质数据库、Chembook数据库、Chemspider数据库进行比较，以确定酱卤肉制品加工过程中香辛料赋予酱卤肉制品主要的滋味成分，为进一步研究香辛料在酱卤肉制品加工过程对滋味的调控提供理论基础，为酱卤肉制品滋味物质的整体滋味特征进行综合反映提供可能。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为应用本发明方法对复合香辛料赋予酱卤牛后腱肉制品滋味成分的多元统计分析的工艺流程图；

图2为复合香辛料提取液组、复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液组、盐水-牛后腱肉煮制提取液组中共有和独特物质的数量的Venn图；

图3为复合香辛料提取液组、复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液组、盐水-牛后腱肉煮制提取液组差异物质的聚类热图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

<实例1>

(1)原料准备

牛后腱(Beef Shank)采自经检疫合格、质量约为400kg的2岁龄草原黄牛。屠宰后的牛采用吊挂风冷排酸48h(循环冷风风速2m/s、温度0～4℃、相对湿度90％)，从9头情况相近的公牛胴体中分别取2块牛后腱，共52块肉样，经修整每块约为15cm×3cm×3cm，重约200g，真空包装后，在4℃下保藏以进行后续的试验。

(2)制备复合香辛料提取液

将花椒、辣椒、丁香、甘草、白芷、陈皮、八角、桂皮、白蔻、小茴香、山萘、香叶、草果香辛料样品放入数显鼓风干燥箱于65℃干燥4h，用高速粉碎机粉碎后过60目筛，每种样品按酱卤牛肉中香辛料的配方比例称取并混合均匀，加入250mL 80％甲醇水溶液、0.5mL乙酸锌溶液和0.5mL亚铁氰化钾溶液，密封后开小孔超声提取2h，超声温度为60℃，静置，离心，离心温度为4℃，取上清液过滤浓缩定容至50mL，用注射器吸取2mL过0.45μm的有机滤膜，获得复合香辛料提取液，于4℃下保存备用。

(3)制备复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液及盐水-牛后腱肉煮制提取液

将10块肉样随机分为两组，每组约为1000g。将两组肉样按照酱卤牛肉的生产工艺，在同等条件下分别预煮10min后捞出。其中一组加入2L水、17g食盐卤煮40min后浸泡90min捞出。另一组加入2L水、17g食盐、按酱卤牛肉中香辛料的配方比例配制的香辛料粉4包卤煮40min，浸泡90min后捞出。

将上述两组肉样分别用绞肉机充分搅碎并混合均匀，称取样品5g置于100mL的离心管中，加入20mL 80％的甲醇水溶液、0.5mL乙酸锌溶液和0.5mL亚铁氰化钾溶液，涡旋混匀。在40℃的水浴下超声提取20min，以10000r/min离心10min，离心温度为4℃。取上清液过滤并转移至50mL的烧杯中，沉淀物中再次加入20mL 80％的甲醇水溶液，涡旋混匀，离心10min，合并上清液并定容至50mL的容量瓶中。用注射器吸取2mL过0.45μm的有机滤膜，获得复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液及盐水-牛后腱肉煮制提取液，于4℃下保存备用。

(4)超高效液相色谱-质谱联用检测

超高效液相色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相：A为0.1％的甲酸和乙腈，B为0.1％的甲酸水溶液；洗脱剃度：0～15.0min，5％～90％B；15.0～20.0min，90％～90％B；20～20.10min，90％～5％B；20.10～30min，5％～5％B；流速0.3mL/min；柱温30℃；进样量5μL。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源(ESI)；鞘气(N

(5)结果分析

利用Thermo Compound Discover 2.0(CD)分析软件对UPLC-QE采集的原始数据进行计算：过滤质谱扫描数据，将原始图谱转换为数据矩阵，由于温度、pH、样品稀释度、盐浓度等因素会造成保留时间的漂移和谱峰的化学位移，所以首先应对齐谱峰，其公式为：

(1)λx＝α-y，x∈R

(2)

(3)

公式(1)～(3)中：C为波系数的二维矩阵；S为信号；α为在300～1500nm范围的光谱波段；ψ

谱峰对齐后，可采用总峰面积归一化法消除或减轻由于采集过程中的明显差异所致的物质浓度的不均一性；经过归一化以后的数据再进行数据标准化，将变量的强度统一标准，其公式为：

(4)

(5)K

(6)

公式(4)～(6)中，τ是对应的物质；n为物质的个数；A

在mzCloud数据库中搜索匹配的碎片光谱，对Full MS/dd-MS2扫描模式下的离子碎片进行未知化合物的元素成分的预测；搜索KEGG途径中匹配的化合物；在OTCM高分辨液质数据库、Chemspider数据库中搜索匹配的化合物，根据OTCM高分辨液质数据库、Chemspider数据库的化合物信息鉴定非挥发性化合物。

对复合香辛料提取液组、复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液组及盐水-牛后腱肉煮制提取液组中鉴定到的非挥发性化合物进行比对，确定复合香辛料提取液组及复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液组中共有而盐水-牛后腱肉煮制提取液组(对照组)中并未检出的非挥发性化合物为香辛料所赋予酱卤牛肉的非挥发性化合物，根据Chembook数据库的化合物信息鉴定滋味物质。所有指标的测定均为3次平行测定结果，表示为平均值±标准差。

<对比例1>

步骤(1)～(4)同实例1；

(5)结果分析：

利用Thermo Compound Discover 2.0(CD)分析软件对UPLC-QE采集的原始数据进行计算：过滤质谱扫描数据，将原始图谱转换为数据矩阵，利用mSPA(multiscale peakalignment，mSPA)法进行谱峰对齐，其公式为：

(1)小波函数：

(2)波转换公式：C(a，b)＝＜s(λ),

公式(1)～(2)中：C为波系数的二维矩阵；s(λ)为信号；λ为在300～1500nm范围的光谱波段；ψ

谱峰对齐后，可采用总峰面积归一化法消除或减轻由于采集过程中的明显差异所致的物质浓度的不均一性；经过归一化以后的数据再进行数据标准化,将变量的强度统一标准，其公式为：

(3)

公式(3)中，i是对应的物质；A

在mzCloud数据库中搜索匹配的碎片光谱，对Full MS/dd-MS2扫描模式下的离子碎片进行未知化合物的元素成分的预测；搜索KEGG途径中匹配的化合物；在OTCM高分辨液质数据库、Chemspider数据库中搜索匹配的化合物，根据OTCM高分辨液质数据库、Chemspider数据库的化合物信息鉴定非挥发性化合物。

对复合香辛料提取液组、复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液组及盐水-牛后腱肉煮制提取液组(对照组)中鉴定到的非挥发性化合物进行比对，确定复合香辛料提取液组及复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液组中共有而盐水-牛后腱肉煮制提取液组(对照组)中并未检出的非挥发性化合物为香辛料所赋予酱卤肉制品的非挥发性化合物，根据Chembook数据库的化合物信息鉴定其中滋味物质。所有指标的测定均为3次平行测定结果，表示为平均值±标准差。

<对比例2>

步骤(1)～(4)同实例1；

(5)结果分析：

利用Thermo Compound Discover 2.0(CD)分析软件对UPLC-QE采集的原始数据进行计算：过滤质谱扫描数据，将原始图谱转换为数据矩阵，利用EBM(empirical Bayesmodel,EBM)法进行谱峰对齐，其公式为：

i.参考谱中的化合物j出现在目标谱中的边缘概率：

P(Y

ii.根据给出的Y

iii.参考谱中化合物j出现在目标谱中，并且与目标谱中化合物匹配的条件下的概率：

P(W

iv.利用混合模型来描述混合相似性得分的分布，模型如下：

其中，f是混合密度；f

采用总峰面积归一化法消除或减轻由于采集过程中的明显差异所致的物质浓度的不均一性；经过归一化以后的数据再进行数据标准化，将变量的强度统一标准，其公式为：

在mzCloud数据库中搜索匹配的碎片光谱，对Full MS/dd-MS2扫描模式下的离子碎片进行未知化合物的元素成分的预测；搜索KEGG途径中匹配的化合物；在OTCM高分辨液质数据库、Chemspider数据库中搜索匹配的化合物，根据OTCM高分辨液质数据库、Chemspider数据库的化合物信息鉴定非挥发性化合物。

对复合香辛料提取液组、复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液组及盐水-牛后腱肉煮制提取液组(对照组)中鉴定到的非挥发性化合物进行比对，确定复合香辛料提取液组及复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液组中共有而盐水-牛后腱肉煮制提取液组(对照组)中并未鉴定到的非挥发性化合物为香辛料所赋予酱卤牛肉的非挥发性化合物，根据Chembook数据库的化合物信息鉴定滋味物质。所有指标的测定均为3次平行测定结果，表示为平均值±标准差。

<谱峰对齐方法对比>

对比例1中采用的mSPA算法，其利用谱峰检测与合并，将谱图划分为多重峰(谱峰团簇)的组合，利用信息熵以谱峰团簇为单元对谱图进行逐步细分，迭代实现多尺度谱峰对齐。但是mSPA算法对齐效果取决于谱峰团簇的划分，算法的自适应不够。并且mSPA算法只适用于化合物保留时间漂移较小的同质数据，因此将化合物的保留时间转换为保留时间指数即标准化保留时间用于化合物的谱峰对齐，其性能不是很好。对比例2中采用的基于EBM的谱峰对齐方法，其主要包括峰匹配和保留时间调整这两个部分。通过构建EBM分层统计模型，以后验概率的形式来进行峰匹配，并计算峰匹配的置信度，选取具有较高匹配置信度的谱峰对，产生有代表性的标志峰，利用这些峰的保留时间制作网格，根据待对齐谱峰的保留时间是否位于网格内来对保留时间进行相应调整。但是基于EBM的谱峰对齐算法，计算复杂、费时。实例1中采用本发明所述方法，结合mSPA谱峰对齐算法的基础上，对公式进行整合和改进，以克服其自适应不够的缺点，使计算复杂程度低的同时，提高结果准确性。

<香辛料赋予酱卤牛肉的非挥发性物质筛选>

将实例1中制取的复合香辛料提取液、复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液及盐水-牛后腱肉煮制提取液的UPLC-MS/MS结果进行对比，绘制Venn图，如图2所示。由Venn图可知，有248种化合物在复合香辛料提取液组中检测到而在其他两组中未检出，在三个处理组中均能检测到的化合物有10种，有22种化合物为复合香辛料提取液和混料煮肉提取液所共有，而盐水煮肉提取液中未检出。由此香辛料赋予牛后腱肉的非挥发性化合物共22种。

<香辛料赋予酱卤牛肉的非挥发性物质鉴定>

表1香辛料赋予酱卤牛肉的非挥发性物质信息

香辛料赋予酱卤牛后腱肉的22种非挥发性化合物鉴定结果如表1所示。根据OTCM高分辨液质数据库、Chembook数据库的化合物信息可得，这22种非挥发性化合物分别为花椒油素、槲皮甙、异橙黄酮、新橙皮甙、柚皮素、柚皮苷、甘草苷元-7-O-β-D-芹糖-4'-O-β-D-葡萄糖苷、佛手酚、芸香柚皮苷、橙皮苷、对甲氧基肉桂酸乙酯、甘草苷、异甘草苷、甜橙黄酮、异槲皮苷、圣草次苷、桔皮素、川陈皮素、对羟基肉桂酸、紫云英苷、乙酰苯、木兰花碱。其中花椒油素是间苯三酚的衍生物；佛手酚为香豆素类化合物；对甲氧基肉桂酸乙酯是山萘挥发油中的主要有效成分之一；对羟基肉桂酸为酚类化合物；木兰花碱是一种生物碱；乙酰苯一种酮类化合物；柚皮素、柚皮苷、异橙黄酮、新橙皮甙、芸香柚皮苷、橙皮苷、紫云英苷等均为黄酮类化合物，且大多数呈苦味，少数为甜味。本研究中香辛料赋予酱卤牛肉的滋味物质共8种，其中新橙皮苷、甘草苷、乙酰苯具有甜味，柚皮苷、异槲皮苷、桔皮素、川陈皮素、紫云英苷具有苦味。

<香辛料赋予酱卤牛肉的非挥发性物质差异分析>

为简单直观的表现出不同非挥发性化合物的变化情况，如图3所示，对22种非挥发性化合物绘制了聚类热图。图中颜色表示含量，黑色表示含量高表达，灰色表示含量低表达。从图中条带可看出，22种非挥发性化合物在不同处理组中都有明确的高表达或低表达区域，这些差异物质明显在复合香辛料提取液中含量较高，在复合香辛料-牛后腱肉煮制提取液组中含量下降，在盐水-牛后腱肉煮制提取液中未检出。

在上述实例1中，应用本发明方法针对香辛料赋予酱卤肉制品滋味成分进行分析，总共鉴定出22种非挥发性风味物质，同时，对比分析OTCM高分辨液质数据库、Chembook数据库、Chemspider数据库，确定香辛料赋予酱卤肉制品的滋味成分。

在上述实例1中，利用UPLC-MS/MS对香辛料赋予酱卤牛肉的滋味物质进行解析及鉴定，得到香辛料赋予酱卤牛肉的非挥发性化合物共22种。其中有8种非挥发性化合物具有不同的滋味，新橙皮苷、甘草苷、乙酰苯具有甜味；柚皮苷、异槲皮苷、桔皮素、川陈皮素、紫云英苷具有苦味。

由此，可得出如下结论，采用超高效液相色谱-质谱联用技术，从香辛料卤制的肉样中鉴定出22种非挥发性物质，主要为挥发油、黄酮类、酮类、酚类、香豆素类化合物及衍生物。通过对比分析OTCM高分辨液质数据库、Chembook数据库、Chemspider数据库，确定了香辛料赋予酱卤肉制品的滋味成分，并对其滋味进行系统分析。结果发现，其中有8种非挥发性化合物具有不同的滋味，新橙皮苷、甘草苷、乙酰苯具有甜味；柚皮苷、异槲皮苷、桔皮素、川陈皮素、紫云英苷具有苦味。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。