一种多孔微载体、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种多孔微载体、其制备方法及其应用，属于生物医用材料技术领域。

背景技术

干细胞是一类具有增殖和分化潜能以及自我更新复制能力的多潜能细胞，为许多目前无法治疗的疾病、人类疾病建模或药物发现提供新的细胞疗法具有很大的应用前景，比如血液系统疾病、神经系统疾病、心血管疾病、糖尿病、骨关节等。近年来，细胞治疗的临床应用日益广泛，据统计研究表明每名患者每公斤体重需要数千万到数十亿的干细胞，针对这些疾病基于细胞治疗和组织再生的方法需要对干细胞进行体外扩增和诱导分化去满足临床需求。在常规单层培养细胞对于传统的二维(2D)单层培养可能会导致传代过程中特定形态和表型的丧失，并且可能改变细胞特异性细胞外基质(ECM)的分泌等。细胞的发育和功能都依赖于细胞微环境中分子间的相互作用，而传统的单层培养并不是细胞生长的自然状态，细胞在基因表达、信号传导和形态学方面都可能与天然状态存在差异，且在空间结构，细胞外基质，细胞因子添加等方面无法模拟体内的三维(3D)造血微环境，从而限制干细胞疗法在临床中的应用。在过去的几十年中，已经开发了各种用于干细胞扩增和分化的方法以满足迅速增长的临床需求，比如生物支架、微载体、微囊、纤维素膜等多种三维技术。目前最广泛认可的技术之一是使用微载体(MCs)在生物反应器系统中大量扩增干细胞，它们具有高放大潜力、减少空间、生物过程步骤、污染风险和整个过程成本，又实现了细胞培养的直观性和条件可控性，可以直接观察细胞的形态结构，检测其功能是否正常，便于研究人体生理、病理状况，以及预防或疾病的治疗，为再生医学和组织工程的研究提供了更安全有效的物质基础以及有据可查的符合当前良好生产规范(cGMP)的情况，值得进一步研究。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种多孔微载体，多孔微载体是一种水凝胶体系，具有良好的生物相容性以及机械性能，用途广泛。

本发明的第二个目的在于提供一种上述多孔微载体的制备方法，该制备方法简单高效，容易控制，稳定性好。

本发明的第三个目的在于提供一种上述多孔微载体的应用。

实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种多孔微载体，包括相互交联的超支化聚合物和天然生物材料；所述超支化聚合物包括超支化聚丙烯酸酯或超支化聚丙烯酰胺；天然生物材料包括：明胶、明胶衍生物、透明质酸、胶原蛋白、糖蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸盐和藻酸盐衍生物中的至少一种。

进一步地，超支化聚合物和天然生物材料的质量比为(0.2-5):1。

进一步地，超支化聚合物通过以下方法制备得到：

将聚合物单体和链转移剂溶解于溶剂中，经除氧后得到混合溶液；在通氩气的条件下，向混合溶液中加入引发剂，得到反应混合体系；反应混合体系在无氧条件下发生可逆加成断裂链转移自由基聚合物反应，使用凝胶渗透色谱监测聚合物分子量，当反应分子量达到设定值10000-100000g/mol时停止反应，然后进行纯化处理，得到超支化聚合物；

聚合物单体包括丙烯酸酯单体和丙烯酰胺单体；

丙烯酸酯单体包括：聚乙二醇二丙烯酸酯、二乙二醇二甲基丙烯酸酯、四甘醇二丙烯酸酯、丁二醇二丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟丙酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸异氰基乙酯、丙烯酸2-(二甲氨基)乙酯、2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯、丙烯酸羟乙酯、二硫化物丙烯酸酯和2-丙烯酸-1,10-癸二基酯中的至少一种；丙烯酰胺单体包括：丙烯酰胺、N,N-二甲基双丙烯酰胺和N,N'-双(丙稀酰)胱胺中的至少一种。

进一步地，乙烯基类单体、链转移剂和引发剂的反应摩尔比为(1-100):1:0.5。

进一步地，链转移剂为4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸、4-氰基戊酸二硫代苯甲酸酯(CPADB)、2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(DCMA)、2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯、2-氰基-2-丙基苯并二硫、2-(十二烷基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸、4-((((2-羧乙基)硫代)硫代碳酰基)硫代)-4-氰基戊酸、4-氰基-4-[(十二烷基磺胺基硫代羰基)磺胺基]戊醇、氰甲基十二烷基三硫代碳酸酯中的至少一种。

进一步地，引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)、4,4'-偶氮二(4-氰基戊酸)(ACVA)或过氧化苯甲酰。

进一步地，可逆加成断裂链转移自由基聚合物反应的温度为50-100℃。

实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种如上所述的多孔微载体的制备方法，将超支化聚合物与天然生物材料发生交联反应，通过微流控技术将其分割成微米级球形颗粒，再通过致孔工艺进行处理，得到多孔微载体。

实现本发明的第三个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种如上所述的多孔微载体的应用，为将多孔微载体应用于干细胞培养，或将多孔微载体应用于药物制备。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明多孔微载体是一种水凝胶体系，具有良好的生物相容性以及机械性能；

2、本发明多孔微载体的制备方法，该制备方法简单高效，容易控制，稳定性好；

3、本发明多孔微载体用途广泛，能够用于干细胞培养、药物制备、蛋白质纯化、递送等。

附图说明

图1为实施例1超支化聚丙烯酰胺的合成示意图；

图2为超支化聚丙烯酰胺的凝胶渗透色谱；

图3-4为多微孔载体的光学显微镜图片；

图5-6为多微孔载体的电镜图片；

图7-8为iMSCs的荧光显微图片；

图9-10为iMSCs的活性图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

一种多孔微载体，包括相互交联的超支化聚合物和天然生物材料，所述超支化聚合物包括超支化聚丙烯酸酯或超支化聚丙烯酰胺；超支化聚合物和天然生物材料的质量比为(0.2-5):1；天然生物材料包括：明胶、明胶衍生物、透明质酸、胶原蛋白、糖蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸盐和藻酸盐衍生物中的至少一种。

其中，超支化聚合物通过以下方法制备得到：

将聚合物单体和链转移剂溶解于溶剂中，经除氧后得到混合溶液；在通氩气的条件下，向混合溶液中加入引发剂，得到反应混合体系；反应混合体系在无氧、温度为50-100℃的条件下发生可逆加成断裂链转移自由基聚合物反应，反应过程不存在金属和配体化合物，具有良好的生物相容性，该温度下能够实现良好的可控聚合，易于得到所需聚合物结构；使用凝胶渗透色谱监测聚合物分子量，当反应分子量达到设定值10000-100000g/mol时停止反应，在此范围内，聚合物分子量易于控制；然后使用乙醚和正己烷进行3次沉淀纯化处理，得到超支化超支化聚合物；聚合物单体、链转移剂和引发剂的反应摩尔比为(1-100):1:0.5，在此范围内易于设计具有不同支链长度和支化度的超支化聚合物。

聚合物单体包括丙烯酸酯单体和丙烯酰胺单体；

丙烯酸酯单体包括：聚乙二醇二丙烯酸酯、二乙二醇二甲基丙烯酸酯、四甘醇二丙烯酸酯、丁二醇二丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟丙酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸异氰基乙酯、丙烯酸2-(二甲氨基)乙酯、2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯、丙烯酸羟乙酯、二硫化物丙烯酸酯和2-丙烯酸-1,10-癸二基酯中的至少一种；丙烯酰胺单体包括：丙烯酰胺、N,N-二甲基双丙烯酰胺和N,N'-双(丙稀酰)胱胺中的至少一种。

链转移剂为4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸、4-氰基戊酸二硫代苯甲酸酯(CPADB)、2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(DCMA)、2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯、2-氰基-2-丙基苯并二硫、2-(十二烷基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸、4-((((2-羧乙基)硫代)硫代碳酰基)硫代)-4-氰基戊酸、4-氰基-4-[(十二烷基磺胺基硫代羰基)磺胺基]戊醇、氰甲基十二烷基三硫代碳酸酯中的至少一种；

引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)、4,4'-偶氮二(4-氰基戊酸)(ACVA)或过氧化苯甲酰；

溶剂为2-丁酮。

该方法得到的超支化聚乙二醇含有大量未反应的双键，可通过迈克尔加成、点击化学等多种方法进行修饰改性，可进一步提高聚合物的功能，从而能够制备可调节的多孔微载体扩大其应用领域。

以得到的超支化聚合物制备多孔微载体，制备方法如下：

将超支化聚合物与天然生物材料发生交联反应，通过微流控技术将其分割成微米级球形颗粒，再通过致孔工艺进行处理，得到多孔微载体。

微流控技术为使用微流体装置，微流体装置为具有分散流和连续流的微芯片，调节两相流速比设计微米级的载体；分散流为水相溶液中包含超支化聚乙二醇与天然生物材料，连续流为有机相溶液中包含有机溶剂和表面活性剂。

多孔微载体可应用于干细胞培养，包括但不限于细胞生长、增殖、封装等，还可应用于药物制备，也可应用于再生医学研究包括但不限于细胞移殖、包裹细胞等。多孔微载体具有良好的生物相容性以及机械性能，解决了目前市面上的微载体存在工艺复杂、功能单一且降解后会存在微粒而影响细胞质量的问题。现有技术中使用的聚苯乙烯基微载体具有强大的机械性能、易于灭菌和已被批准用于生产临床所需细胞的优势，但它们不可降解，需要过滤等操作，会在纯化过程中影响产量和活力；可降解的微载体具有良好的生物相容性，但又无法对微载体表面属性进行改性，包括弹性模量、表面细胞粘附配体等。

实施例1：

制备超支化聚丙烯酰胺：

将N,N-二甲基双丙烯酰胺(DMAA，分子量为154g/mol)4.5mmol和链转移剂2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸0.5mmol加入到装有2-丁酮50mL的三口瓶中并通过磁力搅拌使单体充分溶解，使用通氮气鼓泡的方法除氧30min后得到混合溶液；在通氩气的条件下，向混合溶液中加入引发剂4,4'-偶氮二(4-氰基戊酸)(ACVA)0.25mmol，得到反应混合体系；继续通氮气5min，反应混合体系在无氧、温度为55℃的条件下发生可逆加成断裂链转移自由基聚合物反应10h，使用凝胶渗透色谱监测聚合物分子量，当反应分子量达到设定值10000-100000g/mol时停止反应；然后使用乙醚进行3次沉淀纯化处理，得到超支化聚丙烯酰胺分子量为50000g/mol，超支化聚丙烯酰胺p＝200，m＝150，图1为超支化聚丙烯酰胺的合成示意图。

实施例2：

制备多孔微载体，方法如下：

将实施例1得到的超支化聚丙烯酰胺20mg与透明质酸50mg分别溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)1mL中制备分散相(水相)，通过使用注射泵将不同的相(分散相和连续相)以受控的流速注入微流体装置微流控芯片中，化学交联反应温度为25-37℃，时间为2-5min，在微芯片中形成W/O乳液，并调节分散相与连续相的流速比，通过连续相乳化形成均匀液滴，将液滴收集并固化至少24h以上使其充分交联形成微米级球形颗粒；再通过致孔工艺溶剂蒸发法进行处理，得到多孔微载体。

实施例3：

制备多孔微载体，方法如下：

将实施例1得到的超支化聚丙烯酰胺10mg与透明质酸20mg分别溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)1mL中制备分散相(水相)，通过使用注射泵将不同的相(分散相和连续相)以受控的流速注入微流体装置微流控芯片中，化学交联反应温度为25-37℃，时间为5-10min，在微芯片中形成W/O乳液，并调节分散相与连续相的流速比，通过连续相乳化形成均匀液滴，将液滴收集并固化至少24h以上使其充分交联形成微米级球形颗粒；再通过致孔工艺溶剂蒸发法进行处理，得到多孔微载体。

从实施例1-3可知，超支化聚丙烯酰胺具有良好的可控性和可调节性，通过改变N,N-二甲基双丙烯酰胺、链转移剂与引发剂的比例，所得超支化聚丙烯酰胺的分子量及支化度均不相同，因此得到不同组成和支化度的超支化聚丙烯酰胺。

图2为实施例1的超支化聚丙烯酰胺的凝胶渗透色谱。

多孔微载体具有可调的化学组成和机械性能，具体为通过改变超支化聚丙烯酰胺的分子量及支化度，改变超支化聚丙烯酰胺与透明质酸的交联比例，因此得到具有不同结构和性能的多孔微载体。图3-4分别为实施例2-3多微孔载体的光学显微镜图片，形成了大小均匀的微米级球形颗粒，尺寸大小100-300μm；图5-6分别为实施例2-3多微孔载体的电镜图片，形成的多微孔载体具有较大较多的孔径并且具有很好的连通性，孔径大小3-8μm不等。

将多孔微载体置于培养基中孵育至少1h在37℃和5％v/v CO

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。