一种基于CCD相机的细胞高精度温度场成像系统及方法

技术领域

本发明涉及一种细胞温度场成像系统及方法，尤其涉及一种基于CCD相机的细胞高精度温度场成像系统及方法。

背景技术

温度的变化会改变细胞的动作电位而最终改变细胞的兴奋性，是生物实验中的重要指标，因此需要对细胞的温度进行测量和控制。传统的温度场测量方法主要是利用红外测温仪、针式点温计等仪器进行测量，红外测温仪接触良好，可以测量面积较大的温度场，针式点温计虽然可以快速测量某一点的温度，但上述方法无法精确测定辐射率，故测试误差较大，且温度的分辨率较低，难以实现微电子器件、细胞的温度场测量，因此，需要采用微米甚至纳米尺度下温度场的高分辨测量方法来对细胞进行温度场测量。高分辨率温度场测量方法主要有拉曼光谱测温法、分子标记测温法以及热扫描显微成像测量法等。但是，这些方法容易受到染料荧光率以及环境荧光波动所影响，从而导致所得测量数值不稳定，误差较大。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术的缺陷，本发明提供一种基于CCD相机的细胞高精度温度场成像系统及方法，受外界条件干扰小，所测得的温度场更接近真实温度场。

技术方案：本发明的基于CCD相机的细胞高精度温度场成像系统包括信号发生装置、荧光探测装置、激光脉冲发生装置、微波调制装置、光学系统、CCD相机、用于可模，建立三维电控位移台和用于控制系统各部件运行的控制装置，所述三维电控位移台上装有用于探测细胞温度场且尖端设置有金刚石颗粒的锥形光纤。

荧光探测装置包括用于放大荧光信号的雪崩光电二极管和用于收集和分析荧光信号的信号分析仪。

光学系统包括用于将激光分束的光束分离器、用于滤光的二向色镜和用于聚焦光束的物镜。

金刚石颗粒为含有氮空位(NV)色心的纳米级或微米级金刚石颗粒。

锥形光纤的末端平面处于所述物镜的聚焦焦点上，末端截面的法向与入射光轴对齐。

微波调制装置包括：用于输出微波信号的具有调制功能的微波源、用于根据脉冲信号发生器产生的信号控制微波源发出的微波信号的通断并将微波信号传送给微波天线的微波开关、用于对锥形光纤施加固定微波场的微波天线、用于根据脉冲信号发生器产生的信号控制激光脉冲的声光调制器。

一种采用上述基于CCD相机的细胞高精度温度场成像系统的细胞温度场成像方法，包括如下步骤：

S1、设置三维电控位移台的初始位置、移动区间及移动步长，调节CCD相机的角度和焦距，使显示界面能够清晰地观察到金刚石和待测细胞，设置激光源和微波源的参数；

S2、控制装置控制信号发生器输出独立的数字信号来分别控制532nm激光和微波开关产生的脉冲序列，使激光脉冲和微波脉冲交替产生；

S3、调整声光调制器、二向色镜和物镜，使激光聚焦到锥形光纤末端的金刚石颗粒上，使金刚石颗粒在激光脉冲与电磁波共同作用下产生荧光信号；

S4、用光束分离器将金刚石颗粒产生的荧光信号经二向色镜透射的红光射入共聚焦光路进行聚焦，经雪崩光电二极管将荧光信号转化为电信号并传递给信号分析仪；

S5、信号分析装置对金刚石颗粒在不同载波频率的微波信号作用下所产生的荧光信号进行采集和频谱分析，并从信号频谱中提取出微波开关频率旁边调制频率处的边带信号峰值，通过建立微波信号载波频率与荧光边带信号峰值之间的关系得到光探测磁共振谱数据ODMR；

S6、对上述ODMR光探测磁共振谱数据进行洛伦兹拟合运算得到零场两个共振峰之间的中心频率D，根据所述中心频率D与被测温度之间的变化关系，计算当前测量点的温度；

S7、移动三维电控位移台使金刚石接触细胞内不同位置，依次重复步骤S2-S6，形成被测细胞内整个区域的温度场。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：系统具有高空间分辨率和高灵敏度，所测得的温度场结果精确，更接近真实温度场。

附图说明

图1为本发明实施例的系统结构示意图；

图2为本发明实施例激光脉冲序列、微波信号开关序列、微波调制脉冲序列波形图；

图3为根据实施例的本发明方法测量得到的室温下金刚石的ODMR图谱和拟合结果的示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

如图1所示，本实施例的基于CCD相机的细胞高精度温度场成像系统包括、CCD相机1；、光束分离器2；、共聚焦光路3；、雪崩光电二极管4；、信号分析仪5；、二向色镜6、声光调制器7、激光源8、物镜9、锥形光纤10、微波天线11、金刚石颗粒12、第一三维电控位移台15、第二三维电控位移台16、微波开关17、带调制功能的微波源18、脉冲信号发生器19和计算机20，锥形光纤10的尖端装有金刚石颗粒12、锥形光纤10安装在第一三维电控位移台15上、带有待测细胞14的载玻片13放置于第二三维电控位移台16上。

其中，金刚石颗粒具有氮空位(NV)色心，尺寸为微米或纳米级，CCD相机1用于待测细胞14、金刚石颗粒12的成像，微波开关17的输入端接带调制功能的微波源18、输出端连接微波天线11、控制端连接脉冲信号发生器19中的一路通道；计算机20通过PCI总线连接脉冲信号发生器19、通过USB接口连接带调制功能的微波源18、通过GPIB总线连接信号分析仪5、通过RS232总线连接第一三维电控位移台15和第二三维电控位移台16。

光束分离器、二向色镜和物镜组成光学系统，光束分离器将激光分成平行光束，二向色镜将平行光束中的绿光反射，经物镜聚焦到锥形光纤的金刚石颗粒上，以金刚石颗粒作为探头进行细胞的温度场测量。由于脉冲激光和微波天线辐射的电磁波交替作用在金刚石颗粒上，激光脉冲序列、微波信号开关序列、微波调制脉冲序列的关系如图2所示，信号分析仪11在上述不同序列的控制下进行荧光数据的采集和频谱分析；金刚石颗粒被激发产生荧光信号，荧光信号依次通过物镜、二向色镜和光束分离器传递至CCD相机和雪崩光电二极管，雪崩光电二极管将荧光信号转移成电信号并传递给信号分析仪，由于金刚石NV色心在零场ODMR谱峰的中心频率D随着待测点温度的变化进行高灵敏度线性比例变化，即当温度发生改变时，NV色心零场的中心频率D会随着温度的降低而增大，随着温度的升高而减小，信号分析仪对信号进行频谱分析测量并将测量结果传输至计算机，根据中心频率D与被测温度之间存在以-74kHz/℃为斜率的线性比例变化关系，将中心频率D转换为温度，得到当前测量点的温度。

利用上述系统进行细胞温度场测量的方法如下：

S1、设置系统运行基本参数，调节CCD相机的角度和焦距，使显示界面能够清晰地观察到金刚石和待测细胞，设置激光源和微波源的参数，包括激光源7波长为532nm、输出功率为50mW；带调制功能的微波源18信号载波频率变化范围(2780MHz～2980Hz)、步长设为1MHz、输出功率为10dbm、脉冲调制频率为91Hz；微波开关17接收的TTL信号控制微波脉冲，该信号频率为1MHz，占空比为50％，微波脉冲的脉宽为500ns；声光调制器7接收的TTL信号控制激光脉冲，该信号频率为1MHz，占空比为50％，激光脉冲的脉宽为500ns；根据待测细胞14的尺寸，设置三维电控位移台16的初始位置、移动区间及移动步长；

S2、设置带调制功能的微波源18输出信号的初始载波频率；具体地，当三维电控位移台处于固定位置时，利用计算机20对带调制功能的微波源18进行输出微波信号的设置，保证输出的微波信号频率在2.87GHz左右发生变化，其变化范围根据被测温度场的温度变化区间所决定；

S3、调整声光调制器、二向色镜和物镜，使激光聚焦到锥形光纤末端的金刚石颗粒上，使金刚石颗粒在激光脉冲与电磁波共同作用下产生荧光信号。

S4、用光束分离器将金刚石颗粒产生的荧光信号经二向色镜透射的红光射入共聚焦光路进行聚焦，利用信号分析仪5收集雪崩光电二极管4所接收的荧光信号，设置信号采集时间间隔为0.5s；

S5、进行频谱分析，提取出频率为1000.091kHz的边带信号峰值，并记录该峰值所对应的微波信号的载波频率；建立边带信号峰值与微波信号载波频率的变化关系，得到该三维电控位移台16当前位置的ODMR测量结果，

S6、对S5得到的的测量结果进行洛伦兹拟合，得到两个劈裂谱峰的中心频率D，拟合结果如图3所示，同时记录当前三维电控位移台16的位置；根据中心频率D与被测温度之间存在以-74kHz/℃为斜率的线性比例变化关系，将中心频率D转换为温度，即可得到当前测量点的温度；

S6、不断改变三维电控位移台16的位置，对采集的荧光信号重复进行上述步骤，直到将待测细胞14内所有位置的温度测量完毕为止，将温度值与位置一一对应，形成待测细胞的温度场的整体测量数据，被测温度场的测量量程决定带调制功能的微波源输出信号的载波频率变化范围；金刚石颗粒的尺寸即为被测温度场的测量空间分辨率。

本发明的细胞温度场测量方法选用具有NV色心的微米或纳米级金刚石样品作为温度传感探头；将金刚石样品用紫外胶固定在截面尺寸亚微米级的锥形光纤尖端，利用光线进行荧光传导；利用CCD相机进行成像，确保能够清晰地看清金刚石样品和细胞的准确位置，并将金刚石戳入细胞内；利用共聚焦光路、雪崩光电二极管进行不同温度下金刚石的荧光信号接收和测量；利用高精度三维电动位移平台精确改变测量位置测量温度。因此，该方法具有高分辨率以及高灵敏度的特点，从而能够得到精确的温度场结果。