一种鞣花酸试剂配制方法与活化部分凝血活酶时间测定试剂盒

技术领域

本发明属于临床诊断试剂领域，具体地，本发明涉及一种鞣花酸试剂配制方法与活化部分凝血活酶时间测定试剂盒，更具体地，本发明涉及一种制备鞣花酸试剂的方法、鞣花酸试剂、活化部分凝血活酶时间测定试剂、APTT试剂盒和提高鞣花酸试剂稳定性和灵敏度的方法。

背景技术

活化部分凝血活酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time，APTT)试剂盒的关键物料是激活剂和磷脂。常用的激活剂有硅藻土、白陶土、二氧化硅微粒、鞣花酸等。不同的激活剂对各种凝血因子缺陷、对肝素和对狼疮抗凝物质的敏感性相差很大，如白陶土对凝血因子最敏感、鞣花酸对狼疮抗凝物质敏感性最高。磷脂作为血小板替代物，参与内源性凝血途径，然而磷脂易与鞣花酸反应产生沉淀，目前市场上很多试剂都存在沉淀问题，其直接影响了试剂的稳定性和检测灵敏度。因此目前临床实验室所使用的试剂绝大部分为进口产品。

因此，亟需开发一种稳定性高或检测灵敏度强的鞣花酸试剂。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种制备鞣花酸试剂的方法，该方法制得的鞣花酸试剂不易产生沉淀，具有稳定性高或检测灵敏度强等优点。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

鞣花酸是一种多酚二内酯，微溶于水、醇，溶于碱。鞣花酸在碱性环境中容易氧化，不稳定。目前鞣花酸溶液配制的基本方法都是在碱中溶解后，快速调节pH值至中性，以保证其活性不受影响。但是往往会存在溶解不充分的情况，尤其是与磷脂结合后极易产生沉淀。

兔脑磷脂是一种微黄色蜡状固体，主要成分为甘油、脂肪酸、磷酸、乙醇胺等，不溶于水，微溶于乙醇。兔脑磷脂和水相融为一体形成乳浊液的过程称为乳化。通常乳化较为常见的方法为研磨、超声、搅拌等等，这些乳化方法都需要较长的时间，对稳定性较差的磷脂的性能影响较大。

然而，本发明的发明人意外发现，通过将pH值为中性的鞣花酸溶液进行老化处理，使鞣花酸或者其他成分在溶液中得到充分溶解和扩散，以提高鞣花酸溶液的稳定性。并且，通过将磷脂进行超声处理，在超声处理过程中通过控温(不超过30℃)，避免高温对磷脂活性的影响。

基于此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种制备鞣花酸试剂的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将鞣花酸溶液进行老化处理，得到鞣花酸缓冲液，其中，所述老化处理是在35℃～45℃条件下搅拌20～80h；将磷脂进行乳化处理，得到乳化磷脂；将所述鞣花酸缓冲液和乳化磷脂进行混合处理，得到所述鞣花酸试剂。根据本发明实施例的方法制备工艺简单，通过将鞣花酸溶液进行老化处理，使鞣花酸或者其他成分在溶液中得到充分溶解和扩散，以提高鞣花酸缓冲液的稳定性，并且将老化处理后的鞣花酸缓冲液与乳化后的磷脂进行混合后得到的鞣花酸试剂不易产生沉淀，该鞣花酸试剂具有稳定性高或检测灵敏度强等优点。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下技术特征中的至少之一：

根据本发明的实施例，所述乳化处理是采用超声进行的。

根据本发明的实施例，所述超声的温度为0℃～30℃。

根据本发明的实施例，所述超声的温度不为0℃。

根据本发明的实施例，所述超声的温度不为30℃。

在本发明的一个可选实施例中，所述超声为水浴超声。

根据本发明的实施例，所述超声的时间为10～30min。

根据本发明的实施例，所述超声的功率为200W～500W。

根据本发明的实施例，所述乳化磷脂中磷脂的浓度为40～60g/L。

根据本发明的实施例，所述老化处理是在35℃～45℃条件下搅拌24～72h。

根据本发明的实施例，所述鞣花酸溶液是通过将鞣花酸水溶液在碱性液体中进行溶解处理得到的。

根据本发明的实施例，所述碱性液体包括碱性缓冲液或无机碱溶剂。

根据本发明的实施例，所述碱性缓冲液选自三羟基氨基甲烷缓冲液、乙酸钠缓冲液和羟乙基哌嗪乙硫磺酸钠缓冲液中的至少之一。

根据本发明的实施例，在溶解处理产物中，鞣花酸的浓度为0.01～0.5mM。

根据本发明的实施例，在溶解处理产物中，三羟基氨基甲烷的浓度为10～100mM。

根据本发明的实施例，所述鞣花酸水溶液和碱性液体的体积比为(1～2)：(1～2)。

根据本发明的实施例，在所述老化处理之前，将溶解处理产物与稳定剂和金属离子中的至少之一进行预混处理。

根据本发明的实施例，所述预混处理是在中性条件下进行的。

根据本发明的实施例，所述中性条件的pH值为7～7.5。

根据本发明的实施例，所述鞣花酸试剂中，所述磷脂和鞣花酸的质量比为10:1～50:1。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种鞣花酸试剂。根据本发明的实施例，所述鞣花酸试剂是采用前述的方法制备得到的。根据本发明实施例的鞣花酸试剂不易产生沉淀，该鞣花酸试剂具有稳定性高或检测灵敏度强等优点。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种活化部分凝血活酶时间测定试剂。根据本发明的实施例，所述活化部分凝血活酶时间测定试剂包括依据前述的方法制备得到的鞣花酸试剂或者前述的鞣花酸试剂。根据本发明实施例的活化部分凝血活酶时间测定试剂具有稳定性高或检测灵敏度强等优点。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种APTT试剂盒。根据本发明的实施例，所述APTT试剂盒包括：依据前述的方法制备得到的鞣花酸试剂或者前述的鞣花酸试剂；或者第三方面所述的活化部分凝血活酶时间测定试剂。根据本发明实施例的试剂盒具有稳定性高或检测灵敏度强等优点。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种提高鞣花酸试剂稳定性和灵敏度的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将鞣花酸溶液进行老化处理，得到鞣花酸缓冲液，其中，所述老化处理是在35℃～45℃条件下搅拌20～80h；将磷脂进行乳化处理，得到乳化磷脂；将所述鞣花酸缓冲液和乳化磷脂进行混合处理，得到所述鞣花酸试剂。根据本发明实施例的方法可进一步提高鞣花酸试剂稳定性和检测灵敏度。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下技术特征中的至少之一：

根据本发明的实施例，所述乳化处理是采用超声进行的。

根据本发明的实施例，所述超声是在0℃～30℃条件下进行的。

根据本发明的实施例，所述超声的时间为10～30min。

根据本发明的实施例，所述超声的功率为200W～500W。

根据本发明的实施例，所述超声的温度不为0℃。

根据本发明的实施例，所述乳化磷脂中磷脂的浓度为40～60g/L。

根据本发明的实施例，所述老化处理是在35℃～45℃条件下搅拌24～72h。

根据本发明的实施例，所述鞣花酸溶液是通过将鞣花酸水溶液在碱性液体中进行溶解处理得到的。

根据本发明的实施例，所述碱性液体包括碱性缓冲液或无机碱溶剂。

根据本发明的实施例，所述碱性缓冲液选自三羟基氨基甲烷缓冲液、乙酸钠缓冲液和羟乙基哌嗪乙硫磺酸钠缓冲液中的至少之一。

根据本发明的实施例，在溶解处理产物中，鞣花酸的浓度为0.01～0.5mM。

根据本发明的实施例，在溶解处理产物中，三羟基氨基甲烷的浓度为10～100mM。

根据本发明的实施例，所述鞣花酸水溶液和碱性液体的体积比为(1～2)：(1～2)。

根据本发明的实施例，在所述老化处理之前，将溶解处理产物与稳定剂和金属离子中的至少之一进行预混处理。

根据本发明的实施例，所述预混处理是在中性条件下进行的。

根据本发明的实施例，所述中性条件的pH值为7～7.5。

根据本发明的实施例，所述鞣花酸试剂中，所述磷脂和鞣花酸的质量比为10:1～50:1。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本发明测试例1中部分试剂加速6天后鞣花酸试剂外观图；其中，A为对比例1中试剂外观图(用黑色圈出为肉眼可见沉淀物)；B为实施例1中试剂外观图；C为实施例2中试剂外观图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明详细说明

定义及一般术语

在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。

在本文中，“活化部分凝血活酶时间”简称“APTT”。其中，活化部分凝血活酶时间测定是临床上最常用的反映内源性凝血系统凝血活性的敏感筛选试验，其在内源性凝血因子缺陷及相关抑制物的检测和活化蛋白C抵抗现象的筛检、肝素治疗的监测、弥散性血管内凝血(DIC)的早期诊断、术前检查等方面有着广泛的用途。

本发明制备鞣花酸试剂的方法以及提高鞣花酸试剂稳定性和灵敏度的方法、鞣花酸试剂、活化部分凝血活酶时间测定试剂、APTT试剂盒的详细说明

方法

在本发明的第一方面，本发明提出了一种制备鞣花酸试剂的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将鞣花酸溶液进行老化处理，得到鞣花酸缓冲液，其中，所述老化处理是在35℃～45℃条件下搅拌20～80h；将磷脂进行乳化处理，得到乳化磷脂；将所述鞣花酸缓冲液和乳化磷脂进行混合处理，得到所述鞣花酸试剂。根据本发明实施例的方法制备工艺简单，通过将鞣花酸溶液进行老化处理，使鞣花酸或者其他成分在溶液中得到充分溶解和扩散，以提高鞣花酸缓冲液的稳定性，并且将老化处理后的鞣花酸缓冲液与乳化后的磷脂进行混合后得到的鞣花酸试剂不易产生沉淀，该鞣花酸试剂具有稳定性高或检测灵敏度强等优点。

尤其是，采用本发明上述的鞣花酸试剂能够对APTT进行准确、快速检测，且稳定性良好，具体为鞣花酸试剂37℃下保存15天仍然稳定，且其在机15天后检测效果未受影响。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种提高鞣花酸试剂稳定性和灵敏度的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将鞣花酸溶液进行老化处理，得到鞣花酸缓冲液，其中，所述老化处理是在35℃～45℃条件下搅拌20～80h；将磷脂进行乳化处理，得到乳化磷脂；将所述鞣花酸缓冲液和乳化磷脂进行混合处理，得到所述鞣花酸试剂。根据本发明实施例的方法可进一步提高鞣花酸试剂稳定性和检测灵敏度。

根据本发明的实施例，上述第一方面和第二方面的方法还可以进一步包括如下技术特征中的至少之一：

根据本发明的实施例，所述乳化处理是采用超声进行的。

根据本发明的实施例，所述超声的温度为0℃～30℃，例如1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或者它们任意两个点值作为端点值之间的范围值，如1℃～29℃、1℃～25℃、1℃～20℃、5℃～29℃、5℃～25℃、5℃～20℃、10℃～29℃。由此，在超声处理过程中将温度控制在0℃～30℃范围内，可避免高温对磷脂活性的影响。

根据本发明的实施例，所述超声的温度不为0℃。

根据本发明的实施例，所述超声的温度不为30℃。

在本发明的一个可选实施例中，所述超声为水浴超声。由此，可通过控制水浴温度达到控制超声温度的目的。例如，可通过添加冰块降低水浴的温度。

根据本发明的实施例，所述超声的时间为10～30min，例如10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min或者它们任意两个点值作为端点值之间的范围值，如11～30min、12～30min、13～30min、14～30min、15～30min。由此，通过将超声处理的乳化时间控制在30min内，可进一步保证磷脂的活性。

根据本发明的实施例，所述超声的功率为200W～500W，例如200W、250W、300W、350W、400W、450W、500W或者它们任意两个点值作为端点值之间的范围值，如250W～500W、300W～500W、350W～500W、400W～500W、450W～500W。

根据本发明的实施例，所述乳化磷脂中磷脂的浓度为40～60g/L。示例性地，所述乳化磷脂中磷脂的浓度为40g/L、41g/L、42g/L、43g/L、44g/L、45g/L、46g/L、47g/L、48g/L、49g/L、50g/L、51g/L、52g/L、53g/L、54g/L、55g/L、56g/L、57g/L、58g/L、59g/L、60g/L或者它们任意两个点值作为端点值之间的范围值，如40～59g/L、40～55g/L、40～50g/L、41～60g/L、41～55g/L、41～50g/L、45～60g/L、45～55g/L、45～50g/L。

根据本发明的实施例，所述老化处理是在35℃～45℃条件下搅拌24～72h。

在本发明的一个可选实施例中，所述老化处理的温度为35℃～45℃，例如35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃或者它们任意两个点值作为端点值之间的范围值，如35℃～44℃、35℃～43℃、35℃～42℃、35℃～41℃、35℃～40℃。

在本发明的一个可选实施例中，所述老化处理的时间为20～80h，例如20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h、35h、40h、45h、50h、55h、60h、62h、70h、71h、72h、73h、74h、75h、76h、77h、78h、79h、80h或者它们任意两个点值作为端点值之间的范围值，如20～75h、20～72h、20～30h、20～25h、20～24h、24～80h、24～75h、24～72h、24～30h、24～25h、70～80h、70～72h。

根据本发明的实施例，所述鞣花酸溶液是通过将鞣花酸水溶液在碱性液体中进行溶解处理得到的。

根据本发明的实施例，所述碱性液体包括碱性缓冲液或无机碱溶剂。

根据本发明的实施例，所述碱性缓冲液选自三羟基氨基甲烷缓冲液、乙酸钠缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸钠缓冲液中的至少之一。

根据本发明的实施例，在溶解处理产物中，鞣花酸的浓度为0.01～0.5mM，例如0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM或者它们任意两个点值作为端点值之间的范围值，如0.01～0.4mM、0.01～0.3mM、0.01～0.2mM、0.01～0.1mM、0.01～0.05mM、0.02～0.4mM、0.02～0.3mM、0.02～0.2mM、0.02～0.1mM、0.02～0.05mM、0.03～0.4mM、0.03～0.3mM、0.03～0.2mM、0.03～0.1mM、0.03～0.05mM、0.04～0.4mM、0.04～0.3mM、0.04～0.2mM、0.04～0.1mM、0.04～0.05mM、0.05～0.4mM、0.05～0.3mM、0.05～0.2mM、0.05～0.1mM。

根据本发明的实施例，在溶解处理产物中，三羟基氨基甲烷的浓度为10～100mM，例如10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM或者它们任意两个点值作为端点值之间的范围值，如10～90mM、10～80mM、10～70mM、10～60mM、10～50mM、20～100mM、20～90mM、20～80mM、20～70mM、20～60mM、20～50mM、30～100mM、30～90mM、30～80mM、30～70mM、30～60mM、30～50mM、40～100mM、40～90mM、40～80mM、40～70mM、40～60mM、40～50mM、50～100mM、50～90mM、50～80mM、50～70mM、50～60mM。

根据本发明的实施例，所述鞣花酸水溶液和碱性液体的体积比为(1～2)：(1～2)，例如为1：1、1：2或2：1。

在本发明的一个可选实施例中，所述鞣花酸溶液是通过如下方式获得的：分别配制浓度为0.05～0.5mM(例如0.1mM)的鞣花酸水溶液和浓度为50～200mM(例如100mM)的三羟基氨基甲烷缓冲液，将等体积的鞣花酸水溶液和三羟基氨基甲烷缓冲液混合，得到所述鞣花酸溶液。

根据本发明的实施例，在所述老化处理之前，将溶解处理产物与稳定剂和金属离子中的至少之一进行预混处理。需要说明的是，预混处理即为将溶解处理产物与稳定剂和金属离子中的至少之一进行混合。

根据本发明的实施例，所述预混处理是在中性条件下进行的。

根据本发明的实施例，所述中性条件的pH值为7～7.5，例如为7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或者它们任意两个点值作为端点值之间的范围值，如7.2～7.4。

根据本发明的实施例，所述稳定剂选自聚乙烯吡咯烷酮K15、聚乙烯吡咯烷酮K25、聚乙烯吡咯烷酮K30、聚乙烯吡咯烷酮K60中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述金属离子选自锌离子、镁离子、铜离子、锰离子中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述聚乙烯吡咯烷酮K30的添加体积为所述鞣花酸溶液体积的0.01％～0.1％，例如0.05％。

根据本发明的实施例，以所述鞣花酸溶液总体积计，所述铜离子的浓度为20～60μM，例如40μM。

根据本发明的实施例，所述乳化磷脂的浓度为30～70g/L，例如30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L或者它们任意两个点值作为端点值之间的范围值，如40～60g/L。

根据本发明的实施例，所述鞣花酸试剂中，所述磷脂和鞣花酸的质量比为10:1～50:1。示例性地，所述磷脂和鞣花酸的质量比为10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1或者它们任意两个值之间的范围值，例如(10～45)：1、(10～40)：1、(15～35)：1、(20～30)：1。

鞣花酸试剂、活化部分凝血活酶时间测定试剂、APTT试剂盒

在本发明的第三方面，本发明提出了一种鞣花酸试剂。根据本发明的实施例，所述鞣花酸试剂是采用第一方面所述的方法制备得到的。根据本发明实施例的鞣花酸试剂不易产生沉淀，该鞣花酸试剂具有稳定性高或检测灵敏度强等优点。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种活化部分凝血活酶时间测定试剂。根据本发明的实施例，所述活化部分凝血活酶时间测定试剂包括依据第一方面所述的方法制备得到的鞣花酸试剂或者第三方面所述的鞣花酸试剂。根据本发明实施例的活化部分凝血活酶时间测定试剂具有稳定性高或检测灵敏度强等优点。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种APTT试剂盒。根据本发明的实施例，所述APTT试剂盒包括：依据第一方面所述的方法制备得到的鞣花酸试剂或者第三方面所述的鞣花酸试剂；或者第四方面所述的活化部分凝血活酶时间测定试剂。根据本发明实施例的试剂盒具有高稳定性、高检测灵敏度和/或高精密度等优点，尤其是其灵敏度可媲美进口试剂，精密度检测变异系数(CV)小于2％。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：鞣花酸试剂的配制

鞣花酸试剂采用以下制备方法制得：

1)将鞣花酸加入纯化水中，搅拌使其均匀分散，得到鞣花酸终浓度为0.1mM的鞣花酸水溶液。然后加入到等体积100mM三羟基氨基甲烷缓冲液中，在加入鞣花酸水溶液后的15min内快速加入6M盐酸，调pH至7.3±0.1。再加入聚乙烯吡咯烷酮K30和铜离子，震荡或上下颠倒混匀，得到鞣花酸溶液；其中，以鞣花酸水溶液和三羟基氨基甲烷缓冲液总体积计，聚乙烯吡咯烷酮K30的体积百分数为0.05％、铜离子的浓度为40μM。将鞣花酸溶液放置于37℃恒温恒湿箱中搅拌老化24h，得到鞣花酸缓冲液。

2)配制乳化磷脂：在兔脑磷脂中加入纯化水，震荡混合后，在400W功率下，水浴超声30min，在水浴超声过程中，通过增加冰块控制温度不超过30℃，得到兔脑磷脂终浓度为50g/L的乳化磷脂。

3)将乳化磷脂和鞣花酸缓冲液混合，得到鞣花酸试剂，其中，兔脑磷脂和鞣花酸的质量比为25:1。

实施例2：鞣花酸试剂的配制

鞣花酸试剂采用以下制备方法制得：

1)将鞣花酸加入纯化水中，搅拌使其均匀分散，得到鞣花酸终浓度为0.1mM的鞣花酸水溶液。然后加入到等体积100mM三羟基氨基甲烷缓冲液中，在加入鞣花酸水溶液后的15min内快速加入6M盐酸，调pH至7.3±0.1。再加入聚乙烯吡咯烷酮K30和铜离子，震荡或上下颠倒混匀，得到鞣花酸溶液；其中，以鞣花酸水溶液和三羟基氨基甲烷缓冲液总体积计，聚乙烯吡咯烷酮K30的体积百分数为0.05％、铜离子的浓度为40μM。将鞣花酸溶液放置于37℃恒温恒湿箱中搅拌老化72h，得到鞣花酸缓冲液。

2)配制乳化磷脂：在兔脑磷脂中加入纯化水，震荡混合后，在500W功率下，水浴超声15min，在水浴超声过程中，通过增加冰块控制温度不超过30℃，得到兔脑磷脂终浓度为50g/L的乳化磷脂。

3)将乳化磷脂和鞣花酸缓冲液混合，得到鞣花酸试剂，其中，兔脑磷脂和鞣花酸的质量比为25:1。

实施例3：鞣花酸试剂的配制

鞣花酸试剂采用以下制备方法制得：

1)将鞣花酸加入纯化水中，搅拌使其均匀分散，得到鞣花酸终浓度为0.1mM的鞣花酸水溶液。然后加入到等体积100mM三羟基氨基甲烷缓冲液中，在加入鞣花酸水溶液后的15min内快速加入6M盐酸，调pH至7.3±0.1。再加入聚乙烯吡咯烷酮K30和铜离子，震荡或上下颠倒混匀，得到鞣花酸溶液；其中，以鞣花酸水溶液和三羟基氨基甲烷缓冲液总体积计，聚乙烯吡咯烷酮K30的体积百分数为0.05％、铜离子的浓度为40μM。将鞣花酸溶液放置于37℃恒温恒湿箱中搅拌老化24h，得到鞣花酸缓冲液。

2)配制乳化磷脂：在兔脑磷脂中加入纯化水，震荡混合后，在400W功率下，水浴超声30min，未进行控温，超声结束后温度可高达45℃，得到兔脑磷脂终浓度为50g/L的乳化磷脂。

3)将乳化磷脂和鞣花酸缓冲液混合，得到鞣花酸试剂，其中，兔脑磷脂和鞣花酸的质量比为25:1。

对比例1：鞣花酸试剂的配制

鞣花酸试剂采用以下制备方法制得：

1)将鞣花酸加入纯化水中，搅拌使其均匀分散，得到鞣花酸终浓度为0.1mM的鞣花酸水溶液。然后加入到等体积100mM三羟基氨基甲烷缓冲液中，在加入鞣花酸水溶液后的15min内快速加入6M盐酸，调pH至7.3±0.1。再加入聚乙烯吡咯烷酮K30和铜离子，震荡或上下颠倒混匀，得到鞣花酸溶液；其中，以鞣花酸水溶液和三羟基氨基甲烷缓冲液总体积计，聚乙烯吡咯烷酮K30的体积百分数为0.05％、铜离子的浓度为40μM。将鞣花酸溶液未进过老化，直接置于2～8℃保存备用。

2)配制乳化磷脂：在兔脑磷脂中加入纯化水，震荡混合后，在400W功率下，水浴超声30min，未进行控温，超声结束后温度可高达45℃，得到兔脑磷脂终浓度为50g/L的乳化磷脂。

3)将乳化磷脂和鞣花酸溶液混合，得到鞣花酸试剂，其中，兔脑磷脂和鞣花酸的质量比为25:1。

对比例2：鞣花酸试剂的配制

鞣花酸试剂采用以下制备方法制得：

1)将鞣花酸加入纯化水中，搅拌使其均匀分散，得到鞣花酸终浓度为0.1mM的鞣花酸水溶液。然后加入到等体积100mM三羟基氨基甲烷缓冲液中，在加入鞣花酸水溶液后的15min内快速加入6M盐酸，调pH至7.3±0.1。再加入聚乙烯吡咯烷酮K30和铜离子，震荡或上下颠倒混匀，得到鞣花酸溶液；其中，以鞣花酸水溶液和三羟基氨基甲烷缓冲液总体积计，聚乙烯吡咯烷酮K30的体积百分数为0.05％、铜离子的浓度为40μM。将鞣花酸溶液未进过老化，直接置于2～8℃保存备用。

2)配制乳化磷脂：在兔脑磷脂中加入纯化水，震荡混合后，在400W功率下，水浴超声30min，在水浴超声过程中，通过增加冰块控制温度不超过30℃，得到兔脑磷脂终浓度为50g/L的乳化磷脂。

3)将乳化磷脂和鞣花酸溶液混合，得到鞣花酸试剂，其中，兔脑磷脂和鞣花酸的质量比为25:1。

对比例3：鞣花酸试剂的配制

鞣花酸试剂采用以下制备方法制得：

1)将鞣花酸加入纯化水中，搅拌使其均匀分散，得到鞣花酸终浓度为0.1mM的鞣花酸水溶液。然后加入到等体积100mM三羟基氨基甲烷缓冲液中，在加入鞣花酸水溶液后的15min内快速加入6M盐酸，调pH至7.3±0.1。再加入聚乙烯吡咯烷酮K30和铜离子，震荡或上下颠倒混匀，得到鞣花酸溶液；其中，以鞣花酸水溶液和三羟基氨基甲烷缓冲液总体积计，聚乙烯吡咯烷酮K30的体积百分数为0.05％、铜离子的浓度为40μM。将鞣花酸溶液放置于50℃恒温恒湿箱中搅拌老化24h，得到鞣花酸缓冲液。

2)配制乳化磷脂：在兔脑磷脂中加入纯化水，震荡混合后，在400W功率下，水浴超声30min，在水浴超声过程中，通过增加冰块控制温度不超过30℃，得到兔脑磷脂终浓度为50g/L的乳化磷脂。

3)将乳化磷脂和鞣花酸缓冲液混合，得到鞣花酸试剂，其中，兔脑磷脂和鞣花酸的质量比为25:1。

测试例：

以下通过试验对实施例1～3和对比例1～3制备得到的鞣花酸试剂的活化部分凝血活酶时间测定进行测试。具体检测步骤和检测结果如下所示：

A.试剂加热稳定性

将实施例1～3和对比例1～3制备得到的鞣花酸试剂分别结合20mM氯化钙试剂，得到APTT试剂，用希森美康CS-2400全自动凝血分析仪对从西门子购买的质控血浆(质控水平1：21.7-27.7s，质控水平2：49.3-62.7s)进行测试。具体地，分别将上述APTT试剂在37℃保存，每隔3天取样一次，检测15天内试剂的稳定性，结果见表1和图1。

表1：加热稳定性测试结果

从表1可知，与对比例1～2相比，在制备鞣花酸试剂过程中，通过增加老化处理后，试剂的稳定性得到了明显的提升；并且，通过增加老化处理和低温乳化处理后，试剂的稳定性得到了进一步提升。其中，对比例1的鞣花酸试剂在37℃放置6天后出现了明显了变化，即凝固时间显著延长，且鞣花酸试剂出现沉淀(如图1所示)；实施例3以及对比例2～3，随着加速时间的延长，试剂测试质控样本的凝固时间也延长；而实施例1～2的试剂15天后测试结果仍然稳定。

B.试剂在机稳定性

将实施例1～2制备得到的鞣花酸试剂分别结合20mM氯化钙试剂，试剂开瓶分别在希森美康CS-2400和雷杜RAC-1800仪器试剂位保存，每隔3天测试一次质控血浆，检测15天内试剂的在机稳定性，结果见表2。

表2：在机稳定性测试结果

从表2可知，实施例1～2的试剂分别放置在希森美康CS-2400和雷杜RAC-1800全自动凝血分析仪上测得15天在机后测试结果仍然稳定。

C.试剂灵敏度

为了验证本发明实施例制备得到的鞣花酸试剂的灵敏度，取了含少量肝素以及内源性干扰的样本，采用分别取实施例1和对比例1制备得到的鞣花酸试剂在希森美康CS-2400进行APTT测试，同时用与仪器配套的市售APTT试剂进行对照(购自西门子)，结果如表3。

表3：试剂特异性测试结果

从表3可知，针对0.5IU/mL肝素，采用对比例1制备得到的鞣花酸试剂进行检测后，其在150s时间内无法凝固，导致无法检测。与市售试剂相比，本发明实施例1制备得到的鞣花酸试剂对不同含量的肝素的区分度更强，其检测灵敏度更强。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。