辣椒疫霉效应因子RxLR19781在促进植物生长中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及辣椒疫霉效应因子RxLR19781在促进植物生长中的应用。

背景技术

在自然条件下，植物长期受到各种生物和非生物胁迫，为了躲避这些干扰，植物进化出了多种防卫手段。当病原菌入侵植物细胞，植物细胞表面常形成屏障反应，阻止病原菌的入侵，如果病原菌成功突破植物细胞表面屏障，植物细胞膜受体能够感知病原菌的入侵，从而启动植物的免疫系统，诱导寄主植物产生免疫反应。

研究发现，植物病原菌侵染植物寄主过程中，常分泌产生RxLR效应因子，这些RxLR效应因子与寄主靶蛋白结合，干扰植物的免疫系统，促进病原菌的侵染与致病，但寄主植物也相应的进化出防御系统识别并阻止病原菌的侵染致病，进而激发植物抗性蛋白表达，活性氧迸发，胼胝质沉积，乃至产生过敏性坏死反应(HR)，从而抑制了病原卵菌的扩展。这类RxLR效应因子常被称为免疫性效应分子。

近年来研究发现，重要植物病原卵菌马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、烟草疫霉菌(Phytophthora parasitica)及辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)的基因组均含上百个RxLR效应因子，其中有些RxLR效应分子成员具免疫性能，克隆和正确鉴定RxLR效应分子的免疫特性，借助基因表达和蛋白纯化技术，进一步证实该类免疫性RxLR效应分子的应用前景具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供辣椒疫霉效应因子RxLR19781在促进植物生长中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供辣椒疫霉效应因子RxLR19781在促进植物生长中的应用。

本发明的效应因子RxLR19781是从辣椒疫霉菌菌株SD33中克隆得到的，参见CN110734918A。

前述的应用，将辣椒疫霉效应因子RxLR19781配制成蛋白溶液，或者将表达辣椒疫霉效应因子RxLR19781的大肠杆菌菌液或其稀释液施于植物根际周围的土壤或育苗基质中。

前述的应用，将辣椒疫霉效应因子RxLR19781配制成蛋白溶液，或者将表达辣椒疫霉效应因子RxLR19781的大肠杆菌菌液或其稀释液对植株进行灌根处理。

前述的应用，将辣椒疫霉效应因子RxLR19781配制成蛋白溶液，或者将表达辣椒疫霉效应因子RxLR19781的大肠杆菌菌液或其稀释液进行浸种处理。

前述的应用，将辣椒疫霉效应因子RxLR19781编码基因通过质粒导入植物中或通过基因工程手段整合到植物染色体上，使植物表达辣椒疫霉效应因子RxLR19781。

本发明中，所述表达辣椒疫霉效应因子RxLR19781的大肠杆菌是将辣椒疫霉效应因子RxLR19781编码基因通过质粒导入大肠杆菌感受态细胞中得到的。

优选地，所述质粒为pET28a。

优选地，所述大肠杆菌感受态细胞为DH5α。

本发明中，所述植物包括但不限于辣椒、黄瓜和番茄。

第二方面，本发明提供辣椒疫霉效应因子RxLR19781以及表达辣椒疫霉效应因子RxLR19781的原核或真核表达系统在制备植物促生长剂中的应用。

第三方面，本发明提供植物促生长剂，其有效成分为辣椒疫霉效应因子RxLR19781和/或表达辣椒疫霉效应因子RxLR19781的原核或真核表达系统。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明利用蛋白表达技术，制备辣椒疫霉效应因子RxLR19781大肠杆菌高效表达菌株，获得RxLR19781蛋白溶液，并进一步证实了RxLR19781具有促进辣椒、黄瓜和番茄幼苗根系发育和长势的性能，有望开发成为蔬菜壮根壮苗的新型蛋白制剂。

附图说明

图1为pET28a载体图谱。

图2为本发明较佳实施例中RxLR19781基因PCR扩增结果。其中，M：DNA Marker，1-8：RxLR19781基因DNA PCR扩增条带。

图3为本发明较佳实施例中RxLR19781表达的SDS-PAGE胶图。其中，M：蛋白Marker；1-3：IPTG诱导RxLR19781蛋白表达；CK：对照。

图4为本发明较佳实施例中RxLR19781蛋白促进辣椒幼苗根系发育。

图5为本发明较佳实施例中RxLR19781蛋白促进辣椒幼苗根长势。

图6和图7为本发明较佳实施例中RxLR19781蛋白促进黄瓜幼苗根系发育。

图8为本发明较佳实施例中RxLR19781蛋白促进番茄幼苗根系发育。

图9为本发明较佳实施例中RxLR19781蛋白促进番茄幼苗长势。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1辣椒疫霉效应分子RxLR19781基因的克隆及表达

1.辣椒疫霉效应分子RxLR19781基因信息预测

借助生物信息学DNAMAN软件，分析比较辣椒疫霉全基因组https://genome.jgi.doe.gov/portal/，筛选界定了1个重要的RxLR效应分子，该效应分子被命名为RxLR19781效应因子，其编码基因大小为366bp(含信号肽57bp)，包含121个氨基酸残基，分子量13.86KDa，pI＝6.87。利用SignalP 4.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽，其信号肽区域为1-57bp，无跨膜区。

2.辣椒疫霉效应分子RxLR19781基因克隆测序

2.1辣椒疫霉菌株

强致病辣椒疫霉菌株SD33，由山东农业大学蔬菜病虫生物学重点实验室提供。

2.2辣椒疫霉菌株SD33的RNA提取及反转录cDNA

实验室保存的强致病菌株SD33使用V8平板在28℃恒温培养箱进行培养，RNA提取步骤如下：

1)磨样：使用液氮预冷的研钵研磨辣椒疫霉SD33菌丝至粉末状；

2)匀浆：取1g菌丝研磨粉末加10mL的Trizol，电动涡旋仪充分匀浆2min后，室温静置3-5min使其充分裂解；

3)4℃下转速12000rpm离心10min，吸上清弃沉淀；

4)200μL氯仿/mL Trizol加氯仿，震荡混匀(禁用涡旋震荡仪)后，25℃静置15min，4℃下转速13000rpm离心15min；

5)吸取上层水相至新离心管中，弃下层酚相，勿吸中间界面，酚相用来提取蛋白；

6)500μL异丙醇加入1mL Trizol进行颠倒，室温放置5-10min；

7)温度4℃、12000rpm转速离心10min，弃上清；

8)按1mL 75％乙醇/mL Trizol比例加入乙醇，温和颠倒，温度4℃、转速8000rpm离心5min，尽量去除上清；

9)室温静置晾干或烘干5-10min，除去乙醇，RNA样品切勿过于干燥，否则溶解困难；

10)使用50μL H

11)使用紫外分光光度计测OD

RNA反转录合成cDNA，流程如下：

1)RNA反转录去RNase离心管配制PCR体系，配制体系见表1。

表1 RT-PCR反应体系

配好后吸打混匀，离心后放置于冰上。

2)50℃孵育15min后，85℃孵育2min，其产物立刻用于PCR反应，或在-20℃保存，半年内可继续使用；长期保存建议分装后放置于-80℃冰柜内存放，cDNA应避免反复冻融。

2.3RxLR19781基因PCR克隆引物设计

根据辣椒疫霉全基因组https://genome.jgi.doe.gov/portal/中RxLR19781基因序列(去掉信号肽序列)和重组载体pET28a(Novagen公司)，两个酶切位点NcoI和NotI设计一对特异引物：

上游引物RxLR19781F：5′-CATGCCATGGCTGTCGACACAAGCTGACGCCAC-3′

下游引物RxLR19781R：5′-ATAAGAATGCGGCCGCGTAAGGAAGTCCTTTCTTG-3′

为了后期RxLR19781蛋白纯化，确保pET28a载体C-端his标签正常翻译，去掉RxLR19781的终止密码子。上述引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成。pET28a载体图谱见图1。

2.4目的RxLR19781基因PCR扩增

通过聚合酶链式反应从cDNA中扩增目的片段，PCR反应体系见表2。

表2 RxLR19781基因PCR扩增体系

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示(图2)，扩增条带为300bp左右，与目的基因条带大小基本一致。PCR扩增目的基因片段利用胶回收试剂盒(DNA回收试剂盒)回收，回收产物可在-20℃下短期保存备用。目的RxLR19781基因PCR扩增结果见图2。

3.重组载体构建

3.1目的基因和载体双酶切

将RxLR19781基因PCR扩增胶回收产物和载体pET28a分别用酶1(NcoI)和酶2(XhoI)进行双酶切，37℃水浴2～3h，酶切体系见表3。将酶切之后的RxLR19781和载体pET28a用胶回收试剂盒进行回收，双酶切反应体系见表3。

表3 RxLR19781和载体pET28a双酶切反应体系

3.2目的基因RxLR19781连接至载体pET28a

将酶切的RxLR19781基因DNA片段与载体pET28a(Novagen公司)回收后，用溶液I(Solution I)在16℃下连接3h，连接体系见表4。

表4 RxLR19781连接至载体pET28a反应体系

3.3 pET28a重组载体转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞

1)取50μL DH5α感受态细胞冰浴融化，加入连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；

2)42℃水浴热激90s，然后快速将离心管冰浴2min；

3)在超净台，每个离心管加入500μL无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm振荡培养45～60min，确保宿主菌完全复苏；

4)在常温离心机8000rpm离心1min，弃掉部分上清，用移液器菌体重悬，混匀后涂布至LB琼脂培养基(含相应抗生素)，然后在37℃培养箱中倒置培养12h～16h。

3.4重组载体pET28a鉴定

待上述制备的感受态细胞在平板上长出菌斑后，在1.5mL离心管中加入1mL无菌LB液体培养基(含相应抗生素)，挑取已长出的单菌落置于含LB液体培养基离心管中，37℃振荡培养5～6h，作为菌液PCR模板，适时进行菌液PCR鉴定，菌液PCR反应体系见表5。

表5重组载体pET28a菌液PCR反应体系

菌液PCR反应样品进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，有PCR扩增结果的视为阳性样品，取阳性样品菌液500μL送青岛擎科梓熙生物有限公司测序，测序结果用DNAman软件与基因组序列比对分析，取测序结果正确的菌液500μL，加入50％灭菌甘油500μL后，置于-20℃冰柜中保存，另取测序结果正确的菌液提取质粒，置于-20℃冰柜中保存待用，质粒提取参照CWBIO高纯度质粒小提试剂盒说明书进行。

4.RxLR19781重组蛋白表达

4.1RxLR19781重组蛋白试表达

1)将测序正确的pET28a重组质粒转化至E.coli Rosetta(DE3)菌株中，常温离心机8000rpm离心1min，弃掉部分上清，用移液器菌体重悬，混匀后涂布至LB琼脂平板培养基(含相应抗生素)，然后在37℃培养箱中倒置培养12h～16h；

2)挑取单个菌班接种于盛有1.5mL的LB液体培养基(加Kan抗性)离心管中，于37℃下180rpm振荡培养6h；

3)取1mL振荡培养液接种于盛有1.5mL的LB液体培养基(加Kan抗性)培养至OD

4)诱导菌液和对照菌液分别加入不同浓度的诱导剂(IPTG)，37℃180rpm诱导3h；

5)诱导后，各取1mL菌液，与对照同时12000rpm离心1min；弃上清，分别加入40μL 2×结合缓冲液重悬混匀，然后加入40μL 2×加样缓冲液混匀；

6)取样品煮沸15min后，其中间隔5min振荡1次，共振荡2次，SDS-PAGE电泳上样前12000rpm离心1min；

7)取20μL样品进行SDS-PAGE电泳，观察目的蛋白表达情况，确定诱导剂(IPTG)适宜浓度为0.5mM；

8)取表达目的蛋白菌液500μL，加入50％灭菌甘油500μL混匀混合后，装至灭菌冻存管中，于-20℃冰柜中保存。

然后利用SDS-PAGE电泳技术检测目的蛋白表达情况，SDS-PAGE电泳结果表明，与对照相比，pET28a-RxLR19781蛋白经适宜浓度诱导剂(IPTG)诱导处理后，诱导RxLR19781表达出分子量为13.86KDa(去除信号肽)条带的蛋白，其分子量大小与RxLR19781预测分子量大小一致，表明pET28a-RxLR19781蛋白原核表达系统构建成功，结果见图3。

4.2 RxLR19781融合蛋白大量表达

1)对保存的表达量较高的菌株进行活化，按1:100比例接种至含50mg/mL Kan的1LLB液体培养基中37℃180rpm振荡培养3～4h，使其OD

2)提前确保摇床降温至16℃，加入终浓度为1mM的诱导剂(IPTG)，16℃条件下120rpm过夜诱导16～21h，确保OD

OD值：表示被检测蛋白吸收的光密度，1OD大肠杆菌≈10

实施例2 RxLR19781蛋白促进辣椒、黄瓜、番茄幼苗根系发育及幼苗长势的应用

1、RxLR19781蛋白促进辣椒、黄瓜、番茄幼苗根系发育及幼苗长势技术

1)按照实施例1的方法，诱导制备大量的含有RxLR19781蛋白的菌悬液，监测OD

2)利用无菌水将OD

2、RxLR19781蛋白溶液促进辣椒、黄瓜及番茄幼苗根系发育及其长势结果分析

1)RxLR19781蛋白促进辣椒幼苗根系发育及其长势结果分析见图4和图5。

比较分析图4结果显示，经RxLR19781蛋白处理的辣椒幼苗5叶期，幼根平均长度为4.6cm(统计30株幼苗根系)，而对照CK处理的辣椒幼苗5叶期，幼根平均长度为2.5cm(统计30株幼苗根系)，前者较后者幼根平均长度增长2.1cm。

比较分析图5结果显示，经RxLR19781蛋白处理的辣椒幼苗6叶期，幼苗平均高度为10.5cm(统计30株幼苗高度)，而对照CK处理的辣椒幼苗6叶期，幼苗平均高度为7.5cm(统计30株幼苗高度)，前者较后者幼根平均高度增加3cm。可见RxLR19781蛋白可明显促进辣椒幼苗根系发育与长势。

2)RxLR19781蛋白进黄瓜幼苗根系发育及其长势结果分析见图6和图7。

比较分析图6结果显示，经RxLR19781蛋白处理的黄瓜幼苗5叶期，幼根平均长度为3.5cm(统计30株幼苗根系)，而对照CK处理的黄瓜幼苗5叶期，幼根平均长度为2.0cm(统计30株幼苗根系)，前者较后者幼根平均长度增长1.5cm。

比较分析图7结果显示，经RxLR19781蛋白处理的黄瓜幼苗6叶期，幼苗平均高度为13.5cm(统计30株幼苗高度)，而对照CK处理的黄瓜幼苗6叶期，幼苗平均高度为11.5cm(统计30株幼苗高度)，前者较后者幼根平均高度增加2cm，可见RxLR19781蛋白可明显促进黄瓜幼苗根系发育与长势。

3)RxLR19781蛋白进番茄幼苗根系发育及其长势结果分析见图8和图9。

比较分析图8结果显示，经RxLR19781蛋白处理的番茄幼苗5叶期，幼根平均长度为3.8cm(统计30株幼苗根系)，而对照CK处理的番茄幼苗5叶期，幼根平均长度为1.8cm(统计30株幼苗根系)，前者较后者幼根平均长度增长2cm。

比较分析图9结果显示，经RxLR19781蛋白处理的番茄幼苗6叶期，幼苗平均高度为14.5cm(统计30株幼苗高度)，而对照CK处理的番茄幼苗6叶期，幼苗平均高度为11.5cm(统计30株幼苗高度)，前者较后者幼苗平均高度增加3cm。可见RxLR19781蛋白可明显促进番茄幼苗根系发育与长势。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。