7-(3,4-二甲氧基-5-硒甲基苯基)-吡咯并2,3-d嘧啶及其应用

技术领域：

本发明属于有机化合物领域，具体涉及7-(3,4-二甲氧基-5-硒甲基苯基)-吡咯并[2,3-d]嘧啶化合物，该化合物能够抑制癌细胞生长，可用于治疗肿瘤。

背景技术：

恶性肿瘤是危害人类健康最严重的一类疾病，它的发病率仅次于心脑血管疾病，是人类健康的第二大“杀手”，而其死亡率甚至超过心脑血管疾病，居于所有疾病的首位。因此，寻找和开发治疗肿瘤的新药是当前面临的重大课题。由于微管在肿瘤细胞的增殖和分裂中起到非常关键的作用，使得微管蛋白成为抗肿瘤药物比较理想的靶标。

微管在各种细胞过程中起重要作用，包括纺锤体形成，细胞形状维持和细胞内运输。微管在细胞有丝分裂中的功能使它们成为抗癌药物有吸引力的靶标，微管靶向剂破坏微管形成从而抑制癌细胞进入G2/M期，最终导致癌细胞凋亡。因此，微管蛋白抑制剂已广泛用于治疗癌症。

目前所有已经上市的微管蛋白抑制剂均与微管蛋白中的紫杉醇或长春碱结合位点结合,这些化合物的优点是抗肿瘤活性高，对多种癌症有效。而存在的主要问题是：①毒副作用大；②易产生耐药性(多药耐药/MDR)；秋水仙碱结合位点的微管蛋白抑制剂可以克服上述缺点并且具有优于紫杉烷和长春花生物碱结合位点的治疗优势，例如，它们由于有较好的水溶性并且可以口服给药；此外，它们不易发生多药耐药。迄今为止，已发现许多基于秋水仙碱结合位点的微管蛋白抑制剂作为有效的抗癌剂。其中一些已经达到临床试验，这说明基于秋水仙碱结合位点的抗肿瘤药物类似物有很大的发展前景。

基于秋水仙碱为靶点的微管蛋白抑制剂中，已经被专利保护并进入临床试验的药物被列举在附图1中。考不他汀(Combretastatin)CA-4是非洲树南非矮生柳树分离的考不他汀家族中最活跃的成员。CA-4通过结合至秋水仙碱位点展示出很强的抗微管蛋白活性并且已经经历II期和III期临床研究。利用羰基替换了CA-4的烯桥，产生phenstatin，其具有与CA-4类似的效力和作用机制。ABI-231是CA-4的类似物，显示出对微管蛋白聚合很强的抑制活性。Compd.9a是通过将ABI中的羰基和五元环并环得到的微管蛋白抑制剂，并且其中一个甲氧基用硒甲基代替，其对肿瘤细胞具有纳摩尔级别的IC

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是提供一种7-(3,4-二甲氧基-5-硒甲基苯基)-吡咯并[2,3-d]嘧啶类化合物，该化合物能够抑制肿瘤细胞增殖，为抑制肿瘤细胞增殖提供一种新的抑制剂。

本发明解决上述技术问题的方案如下：

本发明的7-(3,4-二甲氧基-5-硒甲基苯基)-吡咯并[2,3-d]嘧啶，其化学结构如下式(a)所示，

(a)式中，R

本发明所述的7-(3,4-二甲氧基-5-硒甲基苯基)-吡咯并[2,3-d]嘧啶优选下述化合物之一：

当R

当R

当R

当R

当R

当R

当R

当R

本发明的7-(3,4-二甲氧基-5-硒甲基苯基)-吡咯并[2,3-d]嘧啶是通过以下合成方法合成的，该合成方法(反应式如i所示)包括以下步骤：

首先将4-羟基-3-甲氧基苯乙酮(化合物1)在硝酸和醋酸的混合溶剂中，发生硝化反应得到化合物2；然后在硫酸二甲酯的作用下，得到化合物3；在钯碳和氢气的作用下，还原得到化合物4；然后通过生成重氮盐，加入硒氰酸钾后得到化合物5；在碘甲烷和硼氢化钠的条件下，得到化合物6；将化合物6和N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛反应生成化合物7；再将化合物7和3-溴-1H-吡唑-5-胺在醋酸溶剂中反应生成化合物8；然后将化合物8与芳香硼酸进行Suzuki反应生成式(a)所示的7-(3,4-二甲氧基-5-硒甲基苯基)-吡咯并[2,3-d]嘧啶。

上述方法的反应式如下所示：

Reagents and conditions:(a)HNO

经过实验发现，上述7-(3,4-二甲氧基-5-硒甲基苯基)-吡咯并[2,3-d]嘧啶能够抑制肿瘤增殖，可用于制备肿瘤增殖抑制剂，该抑制剂的抗肿瘤效果显著。

因此，本发明还提供了上述7-(3,4-二甲氧基-5-硒甲基苯基)-吡咯并[2,3-d]嘧啶在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明另外提供了一种抗肿瘤药物，其包括上述7-(3,4-二甲氧基-5-硒甲基苯基)-吡咯并[2,3-d]嘧啶作为活性成分。

所述的抗肿瘤药物优选为抗宫颈癌、乳腺癌、肺癌或黑色素瘤的药物。

进一步优选，所述的7-(3,4-二甲氧基-5-硒甲基苯基)-吡咯并[2,3-d]嘧啶的结构式如下任一所示：

优选，所述的抗肿瘤药物包括7-(3,4-二甲氧基-5-硒甲基苯基)-嘧啶并咪唑和医学上可接受的辅料。

本发明的7-(3,4-二甲氧基-5-硒甲基苯基)-吡咯并[2,3-d]嘧啶可以有效抑制肿瘤细胞的增殖，并且有很强的抑制微管蛋白的聚集能力，这为抑制肿瘤细胞增殖提供一种新型微管蛋白抑制剂。

附图说明

图1：列举了几类秋水仙碱结合位点的微管蛋白抑制剂。

图2：化合物9a体外抑制微管蛋白的聚集。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1本发明关键中间体的合成

(1)化合物2的合成：

将8.3g 4-羟基-3-甲氧基苯乙酮(化合物1)溶解在醋酸溶剂中，在0℃条件下，慢慢滴加4mL稀硝酸，室温条件下，搅拌3个小时。待反应结束后，将反应液倒入冰水中，析出沉淀，过滤并干燥后，得到化合物2，收率91.0％。

(2)化合物3的合成：

将6.3g化合物2溶解在丙酮中，分别加入10.4g碳酸钾和4.3mL硫酸二甲酯，80℃反应48小时。待反应结束后，加入氨水去除过量的硫酸二甲酯，利用乙酸乙酯进行萃取，浓缩溶剂后，得到化合物3，收率89.6％。

(3)化合物4的合成：

将化合物3溶解于甲醇溶剂中，加入适量的钯碳，在氢气环境下反应4个小时，待反应结束后，用硅藻土过滤掉溶液中固体，将反应液浓缩后，经柱层析得到化合物4，收率75.2％。

(4)化合物5的合成：

将195mg化合物4加入到水中，加入3mL的10％盐酸，冰浴下，100mg亚硝酸钠加入到溶液中，在0℃条件下搅拌1个小时，然后加入217mg硒氰酸钾，继续搅拌3小时，析出大量沉淀，过滤、干燥后得化合物5，收率89.5％。

(5)化合物6的合成：

将285mg化合物5溶解于甲醇中，先加入38mg硼氢化钠，然后加入0.1mL碘甲烷，室温下搅拌10分钟。待反应结束后，利用乙酸乙酯萃取，浓缩溶剂后，经柱层析得到化合物6，收率83.5％。

(6)化合物7的合成：

将1.0g的化合物6溶解于15mL乙醇中，再将5.0g的N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛加入上述溶液，加热回流，薄层色谱监测。反应结束后，将反应液旋干，用乙酸乙酯-水萃取，无水硫酸钠干燥乙酸乙酯层，浓缩溶液，二氯甲烷-甲醇100：3柱层析得到1.0g化合物7，收率79.2％。

将所得到的化合物7采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：

(7)化合物8的合成：

将1.0g的化合物7溶解于15mL醋酸中，然后加入0.61g的3-溴-1H-吡唑-5-胺，加热回流，薄层色谱监测。反应结束后，用乙酸乙酯-水萃取，无水硫酸钠干燥乙酸乙酯层，浓缩溶液，二氯甲烷-甲醇100：3柱层析得到1.25g化合物8。收率91.1％。

将所得到的化合物8采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：

实施例2化合物9a的合成

将115mg的化合物8溶解于5mL DMF与0.5mL水的混合溶剂中，再将47.6mg的对甲基苯硼酸，15.6mg的四(三苯基膦)钯和71.3mg的碳酸钠加入上述溶液，加热至95℃反应10h，薄层色谱监测。反应结束后，用乙酸乙酯-水萃取，无水硫酸钠干燥乙酸乙酯层，浓缩溶液，二氯甲烷-甲醇100：3柱层析得到93mg的化合物9a，收率78.8％。

将所得到的化合物9a采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：

实施例3化合物9b的合成

化合物9b的合成方法采用化合物8和5-(1-甲基吲哚)苯硼酸作为原料，其方法和实施例2相同，收率为80.2％。

将所得到的化合物9b采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：

实施例4化合物9c的合成

化合物9c的合成方法采用化合物8和5-(1-甲基吲唑)苯硼酸作为原料，其方法和实施例2相同，收率为81.6％。

将所得到的化合物9c采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：

实施例5化合物9d的合成

化合物9d的合成方法分为2步，第一步：采用化合物8和1-(苯磺酰基)-3-吲哚硼酸作为原料，其方法和实施例2相同，收率为88.7％；第二步：将第一步得到的产物溶解在乙醇和水的混合溶剂中，加入适量的氢氧化钠，水解得到化合物9d，收率为78.4％。

将所得到的化合物9d采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：

实施例6化合物9e的合成

化合物9e的合成方法采用化合物8和苯硼酸作为原料，其方法和实施例2相同，收率为82.9％。

将所得到的化合物9e采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：

实施例7化合物9f的合成

化合物9f的合成方法采用化合物8和3-硝基-4-甲氧基苯硼酸作为原料，其方法和实施例2相同，收率为83.5％。

将所得到的化合物9f采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：

实施例8化合物9g的合成

化合物9g的合成方法采用化合物8和4-甲磺酰基苯硼酸作为原料，其方法和实施例2相同，收率为85.6％。

将所得到的化合物9g采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：

实施例9化合物9h的合成

将50mg化合物9d溶解于乙醇溶剂中，加入1mL甲醛溶液和1mL 10％氢氧化钠溶液，室温下搅拌4小时，待反应结束后，用乙酸乙酯萃取，浓缩溶剂后，经柱层析得到化合物9h，收率为80.6％。

将所得到的化合物9h采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：

实施例107-(3,4-二甲氧基-5-硒甲基苯基)-吡咯并[2,3-d]嘧啶类化合物对肿瘤细胞抑制效果研究

本发明化合物的对肿瘤抑制效果采用如下方法测试所证明。

这些效果表明本发明化合物对肿瘤细胞抑制效果明显，其可用于治疗癌症。具体测试方法如下：

一、实验目的及原理

实验目的：采用MTT法检测合成的一系列7-(3,4-二甲氧基-5-硒甲基苯基)-吡咯并[2,3-d]嘧啶类化合物对肿瘤细胞增殖的抑制效果。

实验原理：MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法，其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中，而死细胞缺少这一功能。二甲基亚砜(DMSO)可以溶解活细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪检测570nM下的吸光度值(OD值)，可以根据吸光度值反应活细胞的数量，在一定范围内，OD值越小，则表明细胞活性越弱，药物的抑制增殖效果越好。

二、试剂基本信息

三、试剂配制

1、RPMI-1640完全培养基

配置1L的RPMI-1640培养基，取相应量的RPMI-1640粉末，溶于含有800ml三蒸水的烧杯中，搅拌4h，直至粉末完全溶解。加入2g NaHCO

2、MTT

将50ml的离心管用锡箔纸包裹避光，精密称取MTT粉末250mg，加入到离心管中，加入50ml的PBS，使MTT粉末完全溶解，用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌并分装，在-20℃条件下避光保存。

3、化合物配置

取高压灭菌后的EP管用于称取化合物，向EP管中加入对应量的DMSO，使液体成100mM的母液，并分别按比例稀释到30mM，10mM，3mM，1mM。使用时用相应量的培养基稀释1000倍，即可配成浓度为0.1μM，0.3μM，1μM，10μM，30μM，100μM的工作液。

四、实验过程

(1)取对数生长期的宫颈癌细胞(Hela)、乳腺癌细胞(MCF-7)、肺癌细胞(A549)、黑色素瘤细胞(B16-F10)，消化，调整细胞数浓度为2.5×10

(2)吸出原有培养基，每组加入不同浓度的7-(3,4-二甲氧基-5-硒甲基苯基)-吡咯并[2,3-d]嘧啶系列化合物，每个化合物梯度浓度分别为0.1μM，0.3μM，1μM，10μM，30μM，100μM，每个处理3个重复。以0.1％的DMSO设为对照组，以紫杉醇(PTX)作为阳性对照，以不加细胞和化合物作为空白对照，在细胞培养箱中继续培养72h。

(3)每孔加入10μl MTT液，在培养箱中孵育4h。

(4)弃去培养基，每孔加入100μl DMSO，振荡15min充分溶解甲瓒结晶。

(5)用酶联免疫检测仪测定570nm下的吸光度值。

(6)按以下公式计算细胞生长抑制率：

抑制率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％

As：实验孔的吸光度(含细胞、MTT、化合物)

Ac：对照孔的吸光度(含细胞、MTT，无化合物)

Ab：空白孔的吸光度(不含细胞和化合物，含MTT)

结果见下表1。

表1化合物对肿瘤细胞生长的半数抑制浓度

从表1可以看出，7-(3,4-二甲氧基-5-硒甲基苯基)-吡咯并[2,3-d]嘧啶系列化合物可以有效抑制肿瘤细胞的生长，特别是化合物9a对Hela细胞和B16-F10细胞的抑制作用强于阳性对照PTX。化合物9b对A549细胞的抑制作用强于阳性对照PTX。

实施例11体外抑制微管蛋白聚集实验

使用基于荧光的微管蛋白聚合测定试剂盒(Cat.#BK011P，Cytoskeleton，Inc.，USA)，根据制造商的方案对需要测定化合物9a测试了对微管蛋白聚合的影响。将微管蛋白悬浮于冰冷的G-PEM缓冲液中(80mM PIPES，2mM MgCl