一种表面增强拉曼散射基底及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及表面增强拉曼散射检测技术领域，具体涉及一种表面增强拉曼散射基底及其制备方法和应用。

背景技术

氟乙酸是一种禁用的高毒性杀鼠剂，被广泛用于用农业中，因其高急毒性及良好的化学稳定性，已经引发了多起重大食物中毒事件。其中，最著名的就是2009年恒天然集团发生的氟乙酸污染商业奶源供应事件，当时引起了巨大的恐慌，并造成了严重的经济损失。尽管氟乙酸已经被明令禁止并受到了严格的监管，但它仍然可能被非法用于蓄意的人身攻击以及恐怖活动中。作为食品防范措施，开发一种快速、低成本、方便的从食品和生物样品中检测氟乙酸的方法，对于降低农业恐怖事件的发生至关重要。目前主要的检测手段是通过实验室的精密仪器测定，如气相色谱-质谱（GC-MS）或液相色谱-质谱（LC-MS）以及毛细管电泳（CE）来确认氟乙酸，但无法满足食品恐怖事件中微量氟乙酸的现场快速早期识别的需求。现有的现场检测技术，如比色法，灵敏度低、特异性差；且氟乙酸化学结构简单、毒性大，限制了一些特异性识别特征（如适配体、抗体等）的获得。因此，建立不依赖于复杂仪器的现场检测方法具有极高的技术难度。开发氟乙酸的快速检测方法，不仅是国家安全和公共安全的迫切要求，也是推动快速检测技术创新的发展方向。

近年来，表面增强拉曼散射（SERS）技术以其低成本、高灵敏度和分析时间短的特点，显示出大范围快速筛选的卓越传感能力。表面增强拉曼散射基底一般包括一维、二维和三维的贵金属纳米结构。与一维纳米颗粒阵列相比，有序的二维纳米颗粒阵列的增强因子明显提升。然而，与上述两种类型相比，具有独特空间结构的三维纳米结构，在激光的辐照下具有提供更多“热点”的潜力，从而产生更强的电磁场增强效应，是一种理想的SERS基底。同时，它们具有相对更大的比表面积也有利于被测物质的吸附，从而更有利于拉曼信号的检测。

阳极氧化铝薄膜（Nano Anodic Aluminum Oxide, NAAO）具有均一的孔径、三维的尺度、大的比表面积，是一种具有均匀的三维多孔结构的薄膜。在其表面构建SERS基底既可获得较高的SERS活性，但是考虑到更实际的SERS信号的检测，必须要求制备得到质量稳定，沉积均匀的基底，才能做到检测的重复性好。目前，关于阳极氧化铝薄膜为模板的表面增强拉曼散射基底的构建，主要是针对于一维基底和二维基底的构建，目前三维基底构建的报道较少，尤其是在NAAO衬底上沉积大面积均一的银纳米结构 (AgNPs)未见报道。主要制约该技术发展走向实际应用的原因是这种SERS基底的制备成本较高、技术操作难度较大，而且难以得到能大面积、形成均匀致密的纳米银微粒的沉积层。

此外，虽然SERS技术具有低成本、高灵敏度和分析时间迅速的优点，但是对于SERS具有弱信号的物质，以及拉曼散射截面小甚至没有拉曼振动的物质，无法利用SERS进行检测。而不幸的是，氟乙酸正是一种对拉曼信号弱的物质。因此研发一种可靠的现场筛查技术，合成制备简单、成本低廉、精密度高表面增强拉曼散射基底，快速、灵敏、准确的检测氟乙酸的技术具有非常重要的研究意义和应用场景。

发明内容

本发明的目的在于提出一种表面增强拉曼散射基底及其制备方法和应用，提供了一种合成简单、性能优越、灵敏度高且成本低廉的表面增强拉曼散射基底制备方法，利用金属多酚配位聚合网络（MPNs）对NAAO薄膜进行包被，再通过包被在衬底表面的单宁酸/铁离子(TA/Fe

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种表面增强拉曼散射基底，为衬底-包被层-纳米金属微粒层的多层复合三维结构，衬底为阳极氧化铝薄膜，包被层是单宁酸/过渡金属离子的金属多酚配位聚合网络，纳米金属微粒大面积均匀地沉积在包被层上。

本发明提供的表面增强拉曼散射基底对附着其表面的有机分子能有显著的拉曼增强，增强因子可以达到1x10

所述阳极氧化铝薄膜的孔道为20-500nm，优选100-200nm。

所述纳米金属微粒为纳米银微粒(AgNPs)或纳米金微粒，粒径为50-100nm，优选为60-80nm。

所述过渡金属离子选自Fe

所述纳米金属微粒的负载量为10-60wt%，优选为50-60wt%。

金属多酚配位聚合网络(MPNs)被定为金属离子和多个酚醛配体构建的超分子复合物。单宁酸(TA)是一种来源于植物的天然多酚类物质，具有顺式的二元醇基团。本发明通过TA和Fe

进一步地，本发明所述金属多酚配位聚合网络(MPNs)是通过以下步骤形成的：将阳极氧化铝薄膜(NAAO)依次浸泡在单宁酸（TA）和过渡金属离子水溶液，比如三价铁离子(Fe

更进一步地，所述金属多酚配位聚合网络是通过以下步骤形成的：将阳极氧化铝薄膜浸泡在单宁酸水溶液中，水洗除去多余的单宁酸，之后浸渍在过渡金属离子的水溶液中，取出后再次浸泡在单宁酸水溶液中，使多余的过渡金属离子络合位点和TA结合。

优选地，所述单宁酸水溶液浓度为1-10 mM，pH为7，阳极氧化铝薄膜浸泡在单宁酸水溶液中的时间为1-2h；所述过渡金属离子水溶液的浓度为1-10mM，浸泡在过渡金属离子水溶液的时间为1-10min。单宁酸水溶液的pH用碱，比如NaOH调节。

优选地，纳米金属微粒分两步沉积在包被层上，第一次是包被有单宁酸/过渡金属离子的金属多酚配位聚合网络的阳极氧化铝薄膜(NAAO@TA/过渡金属离子)，50-60℃浸泡在银氨溶液中得到NAAO@AgNS1；第二次是将上述所得NAAO@AgNS1水洗后，浸入到银增长介质中得到得到NAAO@AgNS2，所述银增长介质是含有还原剂和稳定剂的的银氨溶液。

所述还原剂选自抗坏血酸、葡萄糖，盐酸羟胺，硼氢化钠，苯酚、邻苯二酚、对苯二酚中的至少一种；所述稳定剂选自柠檬酸、PVP、PEG、壳聚糖中的至少一种；优选地，所述还原剂为抗坏血酸，所述稳定剂选自柠檬酸。

所述银氨溶液的制备是本领域所熟知的，将银离子的盐逐渐滴加氨水，得到透明的银氨溶液。在两步沉积AgNPs的步骤中，第一次浸泡的银氨溶液的浓度为0.05-0.5M，优选0.1-0.2M；浸泡的时间为2-6h；第二次浸泡在银增长介质中，其中银氨浓度为0.5-1mM，抗坏血酸浓度为5-10mM，柠檬酸浓度为0.05-0.2wt%。

本发明分为两次将阳极氧化铝薄膜浸泡在银氨溶液中，第一次银氨溶液的浓度大于第二次的银增长介质中，因为在界面沉积需要较高的银氨溶液浓度；第二次的银增长介质中因为只需要少量低浓度银氨溶液，因此银氨溶液的浓度不能太大，否则会形成很多不沉积在界面的纳米粒子。

当NAAO@TA/Fe

现有技术中有采用TA直接在溶液里还原得到银纳米颗粒，但是胶体溶液用于拉曼检测的均一性和重现性不好，构建均匀、大面积的二维纳米结构是良好的SERS检测基础。如果基底不均匀，或者形貌不好，拉曼信号就不均匀，有高有低，对于同一个浓度的样品检测信号不稳定。本发明的关键在于通过两步法进行纳米银微粒的沉积，通过引入涂层诱导均匀纳米结构的合成，得到大面积的均一的纳米银结构，建立了一种特别适合表面增强拉曼检测的纳米银粒子的二维平面纳米结构，信号均一，有利于拉曼信号的检测。

发明人发现，采用TA/Fe

为了实现SERS检测信号的进一步增强， 本发明进行了两步银的沉积。第二次沉积是在含有抗坏血酸和柠檬酸的银氨溶液中进行。由于第一步沉积时已经形成了均匀的银纳米结构沉积层，提供了丰富的，并且均匀的成核位点。经过第二轮生长后，在NAAO@AgNS1上形成了高密度的纳米银微粒，形成NAAO@AgNS2，AgNPs的直径为50-100nm，优选为60-80nm。

经过一次沉积后，AgNPs在基底上的负载量能达到10-20%，经过二次沉积后，银的负载量能达到50-60%。经过二次沉积后，AgNPs层增大了厚度，显著增加三维热点，显著增强了SERS的信号。这表明二次沉积得到的NAAO@AgNS2 不仅含有这些紧密堆积的AgNPs 之间的结点或空隙形成丰富的热点，而且还未空间负载探针提供了更大的表面积，有助于增强SERS信号。图1是本发明形成NAAO@AgNS2的示意图。

本发明还提供了一种上述表面增强拉曼散射基底在检测有机分子中的应用。

作为本发明的进一步改进，所述有机分子选自氟乙酸，具体方法为：

S1. 将制得的表面增强拉曼散射基底用SCN

S2. 取不同浓度的的氟乙酸标准溶液，和硫代水杨酸配置为缓冲液混合，待氟乙酸和硫代水杨酸充分反应后，溶液转移至上述表面增强拉曼散射基底进行孵育得到待测样品，测试样品表面增强拉曼散射光谱强度和氟乙酸标准溶液浓度为坐标做标准曲线；

氟乙酸和硫代水杨酸的比例是硫代水杨酸稍微过量，保证氟乙酸反应消耗完。

S3. 将待测样品在相同条件下进行测量，根据标准曲线得到待测样品中氟乙酸的含量。

进一步地，步骤S1中，SCN

进一步地，步骤S2中，所述不同浓度的氟乙酸标准溶液的浓度范围没有特别的限定，一般能能够满足检测限和实际需求即可。在本发明一个具体实施方式中，不同浓度的氟乙酸从0.01μmol/L-0.6μmol/L。缓冲溶液为1-5mM的NaOH和1-5mM的KI混合溶液，缓冲液中硫代水杨酸的浓度为0.6-1μmol/L。

步骤S2中，氟乙酸和硫代水杨酸充分反应的条件是在70-90℃反应0.5-1h，反应后表面增强拉曼散射基底进行孵育的时间为1-2h。

进一步地，步骤S2中，所述测试样品表面增强拉曼散射光谱强度是测试TSA在拉曼散射图谱中的特征峰的强度和内标SCN

进一步地，所述TSA在拉曼散射图谱中的特征峰在1035±30cm

更进一步地，所述测试样品表面增强拉曼散射光谱强度用I

在氟乙酸浓度为零时，SERS显示出TSA(0.6μM)的特征峰，随着氟乙酸浓度增加，该特征峰强度衰减，以I

氟乙酸在NAAO@AgNS2表现出相当弱的SERS信号，这可能时因为其和SERS基底的结合较弱，拉曼散射截面较小的原因。目前还没有可靠的识别元素，比如抗体或者配体用于开发可靠，灵敏度高的氟乙酸专用探针。本发明构建了通过氟乙酸和硫代水杨酸(TSA)的特异性反应，通过SERS测试TSA的消耗量即可简介计算得到体系中氟乙酸的量来解决该问题。

本发明还提供了所述表面增强拉曼散射基底在复杂基质中检测氟乙酸的用途。所述复杂基质包括人血清、各类食品、饮料、日用品、饮用水等。

正是由于氟乙酸和TSA的这种特异性反应(在食品，生物样品中不含有其他能和TSA反应的物质)，本发明提供的上述测试方法，能够对复杂基质中检测氟乙酸成为可能。本发明经过测试，在各种复杂基质中，对氟乙酸的回收率可以达到73-91%，这些结果表明，本发明方法准确可靠，可以快速在复杂基质中进行氟乙酸的痕量检测，该方法灵敏，简便，可靠，快速，成本低，可用于现场快速筛查样品中可能的氟乙酸威胁。

本发明具有如下有益效果：本发明提供了一种合成简单、性能优越、灵敏度高且成本低廉的表面增强拉曼散射基底制备方法，金属多酚配位聚合网络（MPNs）是由金属离子与多螯合位点的酚醛配体结合构建的超分子复合物，本发明采用分步组装法，利用金属多酚配位聚合网络（MPNs）对NAAO薄膜进行包覆，表面的Ta/Fe

由于目前没有特别适合氟乙酸的特异性识别元件，本发明利用氟乙酸和硫代水杨酸（TSA）的衍生反应，以TSA作为表面增强拉曼散射探针，其在制得的表面增强拉曼散射基底上的传感信号随着氟乙酸含量的增加而减少，间接检测氟乙酸。并用SCN

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明形成NAAO@AgNS2的示意图。

图2是NAAO薄膜（图2A）和NAAO@TA/Fe

图3是NAAO薄膜和NAAO@TA/Fe

图4是NAAO、NAAO@TA和NAAO@TA/Fe

图5是NAAO@AgNS1和NAAO@AgNS2的EDS能谱分析图。

图6是本发明实施例NAAO@AgNS1、NAAO@AgNS2，以及对比例商业NAAO@AgNPs的SEM图。

图7是在相同TSA浓度下，NAAO@AgNS1和NAAO@AgNS2的表面增强拉曼散射图。

图8是NAAO@AgNS2和TSA作用后，在1078 cm

图9是不同氟乙酸浓度下和TSA反应后的表面增强拉曼散射基底NAAO@AgNS2的拉曼光谱。

图10是不同氟乙酸浓度和I

图11是不同氟乙酸浓度下的NAAO@AgNS2的拉曼散射图谱。

图12是NAAO@AgNS2贮存一年的拉曼散射图谱强度变化曲线。

图13是不同孔径的NAAO的电镜照片。

图14是实施例2得到的NAAO@AgNS2对不同浓度2,3,5,6-四氟苯硫酚的SERS信号。

图15是实施例2得到的NAAO@AgNS2对不同浓度溴敌隆的SERS信号。

图16是实施例2得到的NAAO@AgNS2对不同浓度4-巯基吡啶的SERS信号。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

葡萄糖、TSA、TA、氨水、KI均购于Sigma-Aldrich化学公司；FeCl

所有的拉曼光谱在inVia 拉曼光谱(Renishaw ,英国)测试得到。

实施例1

表面增强拉曼散射基底的制备：

S1. NAAO@TA/Fe

S2. 银氨溶液的制备：将0.17gAgNO

S3. 表面增强拉曼散射基底的制备：将所述NAAO@TA/Fe

实施例2

表面增强拉曼散射基底的制备：

S1. NAAO@TA/Fe

S2. 银氨溶液的制备：将0.17gAgNO

S3. 银增长介质的制备：将1mL 5mmol/L银氨溶液、0.5mL 50mmol/L抗坏血酸、0.5mL 1%（w/v）柠檬酸钠水溶液加入12.5mL的水中，混合均匀，得到银增长介质；

S4. 表面增强拉曼散射基底的制备：将所述NAAO@TA/Fe

单宁酸中含有丰富的儿茶酚基团，可以与NAAO薄膜上的Al原子结合，并通过双齿氢键内作用进一步增强其结合力，通过多步组装过程，使得TA/Fe

图3是NAAO和NAAO@TA/Fe

图4是NAAO、NAAO@TA和NAAO@TA/Fe

通过对NAAO和NAAO@TA/Fe

图5是NAAO@AgNS1和NAAO@AgNS2的EDS能谱分析图，可以看出NAAO@AgNS1中Ag的含量为18.62%，NAAO@AgNS2中Ag的含量进一步增加到53.17%。

对比例1

S1. 银氨溶液的制备：将0.17gAgNO

S2. 银增长介质的制备：将1mL 5mmol/L银氨溶液、0.5mL 50mmol/L抗坏血酸、0.5mL 1%（w/v）柠檬酸钠水溶液加入12.5mL的水中，混合均匀，得到银增长介质；

S3. 表面增强拉曼散射基底的制备：将NAAO薄膜浸泡在2mL 0.1mol/L银氨溶液中，60℃下原位沉积4h，去离子水洗涤，然后浸泡在2mL银增长介质中，进一步负载，得到产物。

图6是本发明实施例NAAO@AgNS1、NAAO@AgNS2，以及对比例商业NAAO@AgNPs的SEM图。

其中图6A是NAAO@AgNS1的SEM图，图6B是NAAO@AgNS1的SEM局部放大图，图6C是NAAO@AgNS2的SEM图，图6D 是对比例商业未经表面修饰的NAAO负载AgNPs的SEM图。可以看出，对比例的NAAO没有经过TA/Fe

图7是在相同TSA浓度下（0.1 µM），NAAO@AgNS1和NAAO@AgNS2的表面增强拉曼散射图。可以看出经过两步沉积，NAAO@AgNS2的拉曼散射峰强度远高于表现出显著的对TSA的表面增强拉曼散射效果。可见，NAAO@AgNS2不仅含有紧密堆积的AgNPs形成的高活性位点，而且还为空间负载探针分子提供了较大的比表面积，从而使TSA的表面增强拉曼散射效果得到明显的增强。本发明经过两次纳米银沉积的NAAO@AgNS2显示出显著的表面增强拉曼散射效果，增强因子达到3.5x10

图8是NAAO@AgNS2上滴加TSA（0.1 µM）作用后，在1078 cm

实施例3

S1. 将实施例2制得的表面增强拉曼散射基底NAAO@AgNS2用0.001mol/L KSCN水溶液孵育30min后，以SCN

S2. 取0.01μmol/L-0.6μmol/L的氟乙酸标准溶液和0.6μmol/L硫代水杨酸加入0.2mL含1.0mmol/L NaOH和1.0mmol/L KI的缓冲液中,在90℃下反应30min后，将溶液转移到放置了表面增强拉曼散射基底NAAO@AgNS2的圆形石英测量池中，孵育1h后，在显微镜下选择表面增强拉曼散射基底薄膜上的随机区域，发现拉曼强度基本没有变化，说明基底具有大面积的均一性。收集表面增强拉曼散射光谱I

S3. 将待测样品在相同条件下进行测量，根据上述标准曲线得到待测样品中氟乙酸的含量。

图11是不同氟乙酸浓度下的NAAO@AgNS2的拉曼散射图谱，可以看出本发明在NAAO@AgNS2上实现了低至100pM的可识别的表面增强拉曼散射信号，保证了高表面增强拉曼散射灵敏度。可见，NAAO@AgNS2工艺简单、成本低、均匀性和稳定性好、表面增强拉曼散射增强能力强,是理想的可滴式表面增强拉曼散射传感基片。

经过测试，批量样品的表面增强拉曼散射增强值对应的RSD为23.5%,证实了该方法具有良好的重现性。同时申请人还对NAAO@AgNS2的贮存稳定性进行了测试，存放一年，发现本发明的表面增强拉曼散射基底NAAO@AgNS2能保持良好的稳定性,即使在储存12月后,在785nm 的拉曼强度基本保持不变，表面增强拉曼散射能力仍然保持良好(图12)。说明本发明的NAAO@AgNS2具有优异的贮存稳定性，不需要先用现制，满足了现场快速检测的需要。

实施例4

其中，待测样品的制备方法为：

待测物质包括：人血清、鸡肉以及饮用水。

鸡肉样品的处理：将鸡肉样品称重并用甲醇/甲酸混合溶液(体积比9:1)稀释5分钟，然后在1,2000r/min的转速下离心2min，以去除大量的残留物。

人血清样品的处理：将人血清用甲醇/甲酸混合溶液(9:1)稀释10倍，然后以1,2000r/min的速度离心2min，去除蛋白质。

饮用水样品：饮用水按照商品购买的饮用水，不经过处理。

检测结果结果见表1。

结果显示，对加标待测样品中的氟乙酸进行了表面增强拉曼散射定量分析。所有样品都是用不同浓度的标准氟乙酸加标后在室温下孵育而成。通过比较样品中的确定浓度和添加浓度,计算出不同样品的回收率,不同样品的回收率为73%～91%。这些结果表明,原基质的非特异性干扰可以忽略不计。结果表明,该方法简单、灵敏、成本低,可用于现场快速筛查各种样品中的氟乙酸。

同时，为了检测这一方法的准确性，同时采用GC-MS分析法监测硫代水杨酸与氟乙酸的衍生反应。结果与本发明的利用本发明的表面增强拉曼散射基底NAAO@AgNS2检测结果基本一致。

与现有技术相比，本发明提供了一种合成简单、性能优越、灵敏度高且成本低廉的表面增强拉曼散射基底制备方法，金属多酚配位聚合网络（MPNs）是由金属离子与多螯合位点的酚醛配体结合构建的超分子复合物，本发明采用分步组装法，利用金属多酚配位聚合网络（MPNs）对NAAO薄膜进行包覆，表面的Ta/Fe

由于目前没有特别适合氟乙酸的特异性识别元件，本发明利用氟乙酸和硫代水杨酸（TSA）的衍生反应，以TSA作为表面增强拉曼散射探针，其在制得的表面增强拉曼散射基底上的传感信号随着氟乙酸含量的增加而减少，间接检测氟乙酸。并用SCN

实施例5

测试了在不同孔道NAAO表面沉积AgNPs的试验，具体按照实施例2相同的方法制备NAAO@AgNS2，区别在于NAAO孔道不同，分别为20nm，50nm，200nm。其电镜照片分别为图13(a)，13(b)和13(c)所示，可以看出，用不同孔道的NAAO，都能得到大面积均一的纳米银结构。

实施例6

测试了实施例2所得表面增强拉曼散射基底NAAO@AgNS2对于不同有机分子的拉曼信号增强效果。图14是NAAO@AgNS2对不同浓度2,3,5,6-四氟苯硫酚的SERS信号；图15是NAAO@AgNS2对不同浓度溴敌隆的SERS信号；图16是NAAO@AgNS2对不同浓度4-巯基吡啶的SERS信号。证实了本发明制备得到的表面增强拉曼散射基底对于不同的有机分子均具有明显的拉曼信号增强的效果，可以用于各种不同的场合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。