黄毛耳草提取物在制备抗氧化和抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及黄毛耳草提取物在制备抗氧化和抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

近年来，虽然癌症在早期筛查和治疗方面取得了很多重要进展，但其仍是仅次于心血管疾病的第二大致死原因。癌症的发病率和死亡率也呈现迅猛增长的势头。现有的化疗药物在发挥治疗作用的同时往往会引起各种严重的毒副作用。同时，易产生耐药性也在很大程度上影响了化疗药物的效果。因此，寻找高效低毒的新型抗肿瘤药物一直是药物研究的重要领域。

中草药和天然药物从古至今一直是药物发现和发展的重要源泉。越来越多来源于中草药的抗肿瘤药物引起了药物化学家的极大关注。从天然药物中寻找新的抗肿瘤药物也成为抗肿瘤药物研发的重要途径。我国幅员辽阔，药用植物、动物和矿物种类多样，各种中药材、民族药和民间药在预防、保健和疾病治疗方面发挥了重要作用。丰富的天然药物资源、悠久的中医药历史和深厚的中医药传统理论使我们具备了从中草药中发现新的抗肿瘤药物的独特优势。

黄毛耳草是一种多年生草本植物，广泛分布于我国亚热带和热带地区，主要分布于江西、安徽、江苏、浙江、福建、广东、广西等地，具有清热、除湿、利尿，平肝、固齿、明目、活血舒筋的作用，民间用于治疗黄疸、水肿、乳糜尿、痢疾、腹泻、跌打损伤、无名肿毒和乳腺炎等。黄毛耳草在临床上主要作为中成药肠炎宁的配方之一，用于急、慢性胃肠炎、腹泻、细菌性痢疾和小儿消化不良。目前对黄毛耳草的药理作用和发挥药效的物质基础研究尚较少，因此，对其进行深入的研究开发，将其应用于制备抗氧化和抗肿瘤药物具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供黄毛耳草提取物的制备方法及其在制备抗氧化和抗肿瘤药物中的应用。

本发明的第一个目的是提供黄毛耳草提取物在制备抗氧化或抗肿瘤药物中的应用。

优选，所述的黄毛耳草提取物为乙醇粗提物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物或正丁醇提取物，是通过如下方法制备得到的：

将黄毛耳草粉碎，用乙醇水溶液进行连续回流提取，提取液浓缩后得到乙醇粗提物；

取所述的乙醇粗提物分散于水中，依次分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分离各萃取液浓缩至恒重后，分别得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物。

优选，所述的乙醇水溶液为体积分数50％-95％的乙醇水溶液。

优选，所述的乙醇水溶液为体积分数80％的乙醇水溶液。

优选，所述的连续回流提取至少提取3次，每次1-2h。

优选，所述的浓缩为减压浓缩。

优选，所述的应用为黄毛耳草的乙酸乙酯提取物在制备抗氧化药物中的应用。

优选，所述的应用为黄毛耳草的石油醚提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选，所述的抗肿瘤药物，为抗乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、口腔表皮癌的药物。

优选，所述的抗肿瘤药物是为有如下(1)-(5)中至少一种功能的药物：

(1)抑制肿瘤细胞增殖；

(2)抑制肿瘤细胞迁移；

(3)抑制肿瘤细胞侵袭；

(4)诱导肿瘤细胞凋亡；

(5)增加肿瘤细胞内活性氧生成。

本发明相对于现有技术具有如下优点及效果：

(1)黄毛耳草提取物具有较好的抗氧化作用，特别是乙酸乙酯萃取物抗氧化作用最强，能够应用于制备抗氧化药物，具有临床应用的巨大潜力。

(2)黄毛耳草提取物具有较好的抗肿瘤作用，特别是石油醚提取物具有很强的抗乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、口腔表皮癌等多种癌症的活性，对肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭具有突出的抑制作用，同时能显著诱导肿瘤细胞凋亡，并通过升高肿瘤细胞内活性氧(ROS)水平而发挥促凋亡作用，能够应用于制备抗肿瘤药物，为抗肿瘤药物的研究开发提供了新的资源和思路。

(3)本发明所述提取物制备方法简单、易操作。

附图说明

图1是石油醚提取物对MDA-MB-231(a,b)和HCT-116(c,d)细胞迁移的影响(

图2是石油醚提取物对MDA-MB-231(a,b)和HCT-116(c,d)细胞侵袭的影响(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)；

图3是石油醚提取物对MDA-MB-231(a,b)和HCT-116(c,d)细胞凋亡的影响(

图4是石油醚提取物对MDA-MB-231(a)和HCT-116(b)细胞凋亡形态的影响；

图5是石油醚提取物对MDA-MB-231(a,b)和HCT-116(c,d)细胞内活性氧生成的影响(

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：黄毛耳草提取物的制备

将干燥的黄毛耳草全草(1.0Kg)粉碎，用80％(v/v)的乙醇水溶液连续回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至干燥得到乙醇粗提物总浸膏(crude，123.0g)。将总浸膏(100.0g)分散于水中，依次分别用等量的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分离各萃取液减压浓缩至恒重后，分别得到石油醚提取物(PE fraction，2.8g)、乙酸乙酯提取物(EtOAc fraction,3.58g)和正丁醇提取物(BuOH fraction，3.24g)。

实施例2：黄毛耳草提取物的抗氧化活性测定

将1,1-二苯基-2-[(2,4,6)-三硝基]苯肼(DPPH)(3.94mg)溶解于无水乙醇中，配制成0.4mmol/L的DPPH乙醇溶液。将乙醇粗提物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物分别配制成不同浓度梯度的乙醇溶液(乙醇粗提物浓度为50、100、150、200、250、300μg/mL；石油醚提取物浓度为100、150、200、250、300、350μg/mL；乙酸乙酯提取物浓度为100、200、300、400、500、600μg/mL；正丁醇提取物浓度为100、200、300、400、500、600μg/mL)。分别取不同浓度梯度的各提取物乙醇溶液1.5mL与上述配制的0.4mmol/L的DPPH乙醇溶液在室温下等量混合，避光反应30min，用紫外分光光度计在517nm下测定各混合溶液的吸光度值。以维生素C(Vc)为阳性对照。自由基清除活性抑制百分率的计算公式为：DPPH自由基清除活性抑制百分率(％)＝[1-(A

表1黄毛耳草提取物的自由基清除活性

从表1可看出，黄毛耳草乙醇粗提物具有一定的抗氧化活性(IC

实施例3：黄毛耳草提取物对肿瘤细胞增殖的抑制活性测定

采用MTT法测定乙醇粗提物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对5种人肿瘤细胞系(人乳腺癌细胞MDA-MB-231、结肠癌细胞HCT-116、肺癌细胞A549、宫颈癌细胞Hela和口腔表皮癌细胞KB)增殖的抑制作用。以DMSO为空白对照，5-氟尿嘧啶(5-FU)为阳性对照。

将上述5种肿瘤细胞以3×10

表2黄毛耳草提取物对肿瘤细胞增殖的抑制作用

结果表明，黄毛耳草乙醇粗提物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对5种肿瘤细胞的增殖都表现出不同程度的抑制作用，石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物的抗增殖作用明显强于乙醇粗提物。其中，石油醚提取物对人乳腺癌细胞MDA-MB-231和结肠癌细胞HCT-116两种肿瘤细胞增殖的抑制作用最强。

实施例4：石油醚提取物对肿瘤细胞迁移的抑制作用

将MDA-MB-231细胞和HCT-116细胞以5×10

结果显示，石油醚提取物能显著抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231(图1a、b)和结肠癌细胞HCT-116(图1c、d)的迁移，在1.5μg/mL的低浓度下就能有效抑制肿瘤细胞的迁移。

实施例5：石油醚提取物对肿瘤细胞侵袭的抑制作用

采用Transwell小室侵袭实验进行检测。用无血清培养基按1:4的比例稀释基质胶，在Transwell小室上室加入稀释后的基质胶(45μL/室)，置于37℃下2h，使基质胶转化为凝胶。用无血清的DMEM培养基制备浓度为3×10

由图2知，与未经石油醚提取物处理的细胞相比，用药组在3μg/mL和6μg/mL的浓度下对人乳腺癌细胞MDA-MB-231和结肠癌细胞HCT-116的侵袭具有显著抑制作用，且呈剂量依赖关系，说明石油醚提取物对两种肿瘤细胞的侵袭具有明显的抑制作用。

实施例6：石油醚提取物诱导肿瘤细胞凋亡的作用

将人乳腺癌细胞MDA-MB-231和结肠癌细胞HCT-116以2.5×10

结果显示，采用6μg/mL的石油醚提取物处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231和结肠癌细胞HCT-116 48h后，两种细胞群中凋亡细胞的比例均显著增加(图3)。形态学实验显示，细胞经Annexin V-FITC染色后显示绿色荧光，代表细胞凋亡的早期阶段。同时被Annexin V-FITC和PI染色的细胞，内部显示红色荧光，外部显示绿色荧光，代表细胞凋亡的后期阶段(图4)。与对照组相比，石油醚提取物处理显示出更高的荧光强度，说明其能显著诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231和结肠癌细胞HCT-116凋亡。

实施例7：黄毛耳草提取物增加肿瘤细胞内活性氧(ROS)生成的作用

将人乳腺癌细胞MDA-MB-231和结肠癌细胞HCT-116以2.5×10

从图5a和5c中可以看出，与对照组相比，石油醚提取物处理两种细胞后，显微镜下呈现的绿色荧光点数目和荧光强度都显著增加。统计学分析表明，在10、20和40μg/mL的浓度下，石油醚提取物使两种细胞中出现的绿色荧光点的荧光强度显著增强(图5b和5d)。这些结果表明，石油醚提取物可以明显增加人乳腺癌细胞MDA-MB-231和结肠癌细胞HCT-116内ROS的生成。由此推断，石油醚提取物可能是通过增加细胞内ROS的生成而发挥其诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

综上，黄毛耳草提取物具有抗氧化和抗肿瘤作用，其中乙酸乙酯提取物的抗氧化活性最强，石油醚提取物的抗肿瘤作用最强，特别是对宫颈癌和结肠癌细胞的作用最突出。石油醚提取物具有显著的抗肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭的作用，同时能诱导肿瘤细胞凋亡，并可能是通过增加细胞内ROS的生成来发挥促凋亡作用。

关于本发明的黄毛耳草提取物性质的进一步说明：

文献报道黄毛耳草提取物中的生物碱黄毛耳草碱对肿瘤细胞HL-60具有细胞毒作用；甾醇对人肝癌细胞SK-HEP-1具有细胞毒和抗细胞迁移作用，但不促进细胞凋亡，也不存在细胞周期阻滞作用。

在本实验中，我们通过显色反应对黄毛耳草提取物进行了鉴别，其中石油醚提取物对两种生物碱显色剂：改良碘化铋钾(Dragendorff)试剂和碘-碘化钾(Wagner)试剂均不显色，说明其中不含有生物碱成分。同时，石油醚提取物和乙酸乙酯提取物对三氯乙酸反应(Rosen-Heimer反应)和乙酸酐-浓硫酸反应(Liebermann-Burchard反应)也呈阴性，说明其中也不含三萜和甾族化合物。