一种基于LC-MS/MS技术检测药物胺碘酮的方法

技术领域

本发明属于药物浓度检测领域，具体涉及一种采用高效液相色谱串联质谱技术测定人血浆胺碘酮的方法。

背景技术

心律失常是临床治疗中的难点问题。在心律失常治疗中，尤其是在心律失常急性期，药物治疗占据重要的临床地位。目前，用于心律失常治疗的药物非常有限，胺碘酮是其中常用的广谱抗心律失常药，具有扩张血管、减缓心率、改善心肌供血的作用，而且能够抑制交感神经活性，改善患者心功能，在心律失常的临床治疗中应用最为广泛。

胺碘酮1962年由Labaz实验室研制成功，1967年作为抗心绞痛药物在瑞士、比利时等国上市，由于副作用于1967年退市，在1974年发现其抗心律失常作用。盐酸胺碘酮片，是由Sanofi-Aventis France (法国赛诺菲-安万特)研发的第三类抗心律失常药，于1980年8月经英国药品和健康产品管理局 (MHRA)批准在英国上市，商品名Cordarone，规格100mg和200mg；于1985年12月由Wyethpharms (惠氏)公司在美国获得FDA批准上市；1986年12月在中国香港获批上市，商品名：Cordarone，规格：200 mg；1999年经国家药品监督管理局批准进口我国，商品名为可达龙，规格200mg。

由于胺碘酮治疗窗较窄，体内代谢过程存在较大的个体差异，所以对其血液中药物浓度的检测是调整剂量，减少不良反应的重要参考，在临床用药中具有重大意义。目前胺碘酮治疗药物检测的常见方法有：紫外分光光度法、高效液相色谱法。这些方法存在前处理复杂、定性定量不够准确、成本高、分析时间长、或对实验人员技术要求高等问题。液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)越来越广泛应用于药物、食品、环境、法医、临床等各个领域。LC-MS/MS具有灵敏度高，选择性强，准确性好等特点，在临床检测上适用范围远远超过放射性免疫检测和化学检测范围，是其他方法无可比拟的。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种基于液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术检测人血浆中胺碘酮药物的含量的检测方法，该方法前处理简单、质谱采集时间短、成本低廉、方便实验室进行大规模临床样本检测。

本发明所述的一种采用高效液相色谱串联质谱技术能分别定量检测血浆中胺碘酮的方法，包括以下步骤：

(1)血浆样品预处理

在黄光室温条件下，将待测样品100μL移取至96孔板，再加10μL氘代内标工作溶液，加入490μL 的乙腈，将样品涡旋5分钟后，在4000rpm、4℃条件下离心5分钟，用移液枪移取上清液400μL至新的96孔板中，在35℃条件下氮气流吹干；加入200μL的含乙腈：水(1：1)(含0.05％甲酸)溶液复溶，涡旋3分钟，在4000rpm、4℃条件下离心5分钟，得到待测样品；

(2)标准曲线和质控血浆样品的配制

使用甲醇配制标曲和质控工作溶液，取上述工作溶液10μL与490μL空白血浆混合配制成不同浓度的标准曲线样品和质控样品，用胺碘酮和内标的峰面积比和标准样品的浓度来建立标准曲线，得到相应的线性回归方程。

(3)采用液相色谱-质谱联用检测

①液相色谱条件：色谱柱：XSelect C18 2.1*50mm 3.5μm；

流动相：水相：2mM乙酸铵水溶液(PH＝3.2)，有机相：乙腈，洗针液：乙腈：水(1:1)(含0.2％甲酸)；

柱温：室温；自动进样器温度：25℃；

采用水相和有机相为混合流动相进行梯度洗脱，每个样品采集时间为5min，进样体积为10μL，流速为0.5mL/min，流动相梯度洗脱参数如下：0min，45％有机相；0.2min，45％有机相；2.2min，95％有机相；3.5min，95％有机相；3.6min，45％有机相；5min，停止。

②质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描正离子模式，离子化电压(IS) 分别为4500V，离子源温度(TEM)：500℃，气帘气(CUR)：35psi，入口电压(EP)分别为10V，碰撞气(CAD)：9psi，雾化气(Gas1)：50psi，涡轮气(Gas2)：45psi，离子对分别为：m/z646.7→58.1 (Amiodarone)，m/z 650.7→58.2(Amiodarone-d

(4)待测血浆中各物质的浓度测定

将待测血浆按步骤(1)样品制备的方法制备，取待测样品按步骤(3)采用液相色谱-质谱联用检测的方法检测，将测得的胺碘酮和内标的峰面积比值代入所建的标准曲线中，计算得到待测血浆中胺碘酮的浓度。

有益效果：

液相方法优化过程中，水相首先选择了0.1％甲酸水溶液，水中加入0.1％甲酸，有助于防止水溶液长菌，并且有促进待测物离子化效果，有机相选用乙腈，使用45％有机相的梯度，灵敏度高，保留时间好，峰形稍微的有一点拖尾；后更换水相为2mM乙酸铵水溶液(PH＝3.2)，峰形好，但响应较低，再优化液相方法，更换等度液相条件，采用梯度洗脱可以提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，且在LC-MS 中不会引起基线漂移；洗针液选择上，曾选择乙腈：水(1:1)，定量上限后跟的空白样品会有少许的残留，后选择乙腈：水(1:1)(含0.2的甲酸)，可以有效的改善高点对空白样品的干扰。

前处理提取方法上，首先选择操作简便、分析成本低的蛋白沉淀方法，使用甲醇和乙腈处理血浆，两者均有较好的提取回收率，但乙腈比甲醇提取回收率更高，且基质效应更小一些，所以最终选择了乙腈作为沉淀剂。

本研究建立了一种高效液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)，分别测定人体血浆中胺碘酮的方法。采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。本发明采用蛋白沉淀，前处理过程简单，灵敏度高，单个样品分析时间短，大大降低了耗材成本，缩短了操作时间，采用稳定的同位素内标定量结果准确，所有验证项均满足法规要求，在本发明条件下胺碘酮可准确定量，可用于临床药代动力学研究，为相应的药物浓度监测提供了一种稳定、可靠、简便的检测方法。

附图说明

图1为胺碘酮代表性标准曲线图。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

仪器：AB5500三重四级杆质谱仪(美国AB Sciex公司)，配岛津UPLC-30A超高效液相系统(日本岛津公司)；XPR2百万分之一天平(瑞士Mettler公司)；万分之一天平(双杰电子)；Milli-Q纯水仪 (默克化工)；Centrifuge 5810R离心机(Eppendorf，Hettich)；可调移液器(Eppendorf 2-20μL，10-100μL， 20-200μL，100-1000μL)；96孔板、样品瓶等。

空白基质、试剂和对照品：本发明所用空白基质均来自于江苏省省级机关医院；乙腈(HPLC，Merck)，水为自制超纯水，甲醇(HPLC，Merck)，甲酸(HPLC，Dikma)，乙酸铵(AR，永华化学)；胺碘酮(中检院，100065-201207，含量99.7％)，Amiodarone-d

实施例1 实验过程

1.血浆样品预处理；

移取100μL样品(空白样品和内标空白样品加100μL空白生物基质)至96孔板中，加入10μL内标工作溶液(空白样品加入10μL甲醇：水(1:1)代替)；分别加入490μL的乙腈，将样品涡旋5分钟后，在4000rpm、4℃条件下离心5分钟，用移液枪移取上清液400μL至新的96孔板中，在35℃条件下氮气流吹干；加入200μL的含乙腈：水(1：1)(含0.05％甲酸)溶液复溶，涡旋3分钟，在4000rpm、 4℃条件下离心5分钟，交由LC-MS/MS进样分析。

2.标准曲线和质控血浆样品的配制

(1)胺碘酮储备液和工作溶液的配制：

①胺碘酮储备液A(SS-A)

精密称取胺碘酮对照品，用适量的甲醇溶解，配制成浓度为1.00mg/mL的储备液SS-A(使用校正因子)。

②储备液B(SS-B)

取0.20mL的SS-A加到3.80mL的甲醇溶液中，混合均匀配制成储备液SS-B(50.0μg/mL。

③储备液C(SS-C)

取0.20mL的SS-B加到1.80mL甲醇中，混合均匀配制成储备液SS-C(5.00μg/mL)。

表1：按照下表使用甲醇配制标曲和质控工作溶液，标曲和质控工作液来自于不同的储备液

以下表为指导，用甲醇为溶剂来配制标准曲线工作液

以下表为指导，用甲醇溶液为溶剂来配制质控工作液

(3)内标储备液及工作液配制：

精密称取Amiodarone-d

取0.02mL的IS-A加到1.98mL甲醇溶液中，混合均匀配制成10.0μg/mL的内标储备液IS-B。

取0.10mL的IS-B加到1.90mL甲醇：水(1:1)溶液中，混合均匀配制成500ng/mL的内标工作溶液IS-C。

(4)标准曲线和质控血浆样品的配制：

各取上述工作溶液10μL与490μL空白血浆基质混合配制成不同浓度的标准曲线样品和质控样品，标曲浓度分别为：1.00ng/mL、2.00ng/mL、10.0ng/mL、100ng/mL、400ng/mL、600ng/mL、900ng/mL、 1000ng/mL；质控浓度分别为：1.00ng/mL、3.00ng/mL、30.0ng/mL、300ng/mL、800ng/mL、4000ng/mL)。

3.HPLC-MS/MS检测：

(1)液相色谱条件：

流动相(水相：2mM乙酸铵水溶液(PH＝3.2)，有机相：乙腈，洗针液：乙腈：水(1:1)(含0.2％甲酸))；色谱柱：XSelect C18 2.1*50mm 3.5μm；

柱温：室温；自动进样器温度：25℃；

采用水相和有机相为混合流动相进行梯度洗脱，详见表3，每个样品采集时间为5min，进样体积为 10μL，流速为0.5mL/min。

表3：流动相梯度洗脱参数

(2)质谱条件：

在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描的负离子模式，待测物及内标相应的质谱参数见表4。

表4：质谱参数

4.待测血浆中各物质的浓度测定：

将待测血浆按步骤(1)样品制备的方法制备，取待测样品按步骤(3)采用液相色谱-质谱联用检测的方法检测，用胺碘酮和内标的峰面积比和标准样品的浓度来建立标准曲线，得到相应的线性回归方程，将测得的胺碘酮和各自内标的峰面积比值代入所建的标准曲线中，计算得到待测血浆中胺碘酮的浓度。

实施例2 方法学考察

(1)准确度和精密度试验：各取上述对应工作液10μL与490μL空白基质混合，配制成LLOQ、 LQC、GMQC、MQC、HQC 5个不同浓度的质控样品，每个浓度6个重复，随行新鲜配制的标准曲线进行测定，结果显示，胺碘酮RE％在0.17～4.78之间，％CV在1.74～7.82之间。

(2)基质效应、提取回收率试验：以至少6个不同来源的空白人血浆制备的空白样品，前处理后加入一定量的待测物和内标，使其最终浓度分别与LQC、HQC的进样浓度一致，同时配制含有一定量待测物和内标的纯溶液，其最终浓度分别与LQC、HQC的进样浓度一致，每个浓度平行测定至少6份。对于每个来源基质，应该通过计算基质存在下的峰面积(由空白人血浆前处理后加入待测物和内标测得)，与不含基质的样品(待测物和内标的纯溶液)相应峰面积平均值的比值，计算每一待测物和内标的基质因子。进一步通过待测物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子。结果显示，胺碘酮经内标归一化基质效应因子分别为0.987和0.986，％CV分别为2.98和1.55。

(3)回收率试验：6个重复的LQC、MQC、HQC与18个混合空白血浆样品一同处理。处理后，将含有待测物和内标的溶液加入空白样品中，以使其最终浓度与高、中、低质控样品的进样浓度一致。通过比较单个质控样品中待测物或内标响应值与前处理后加入待测物、内标的空白样品的响应值的平均值来评价回收率。结果显示，胺碘酮待测物提取回收率分别为93.75％、80.31％、79.46％，％CV分别为 4.47、5.85、3.67，内标提取回收率为96.15％，％CV为5.57。

(4)稳定性试验：稳定性试验考察了稳定性样品在不同条件下(前处理过程中，制备后，冻融循环，长期稳定性，全血中)放置一段时间后，用新鲜配置的标准曲线定量稳定性样品与理论浓度的偏差，结果表明，胺碘酮基质样品在不同条件下放置一段时间后均保持稳定。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。