一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，具体的说，涉及一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高，越来越多的人喜爱饲养小动物作为自己的宠物，人与动物的密切接触随之而来的是宠物疫病的发病率逐渐增加，特别是一些犬猫宠物源性人畜共患疫病，对人们的身体健康和生命安全构成严重威胁。为了宠物和人类的健康，珍爱生命，科学饲养，保护环境，宠物疫病的防控也显得越来越重要。

犬细小病毒(CanineParvovirus，CPV)是单链小DNA病毒。病毒为等轴对称的二十面体，外观呈圆形或六边形，无囊膜，粒径为21-24nm。该病毒在1977年首次从患有肠炎的病犬体内分离获得。主要以呕吐、出血性肠炎、白细胞减少为主要特征，幼犬的易感性很高，可引起心肌炎，发病率为50％以上，死亡率在50％以内，对犬业、经济动物养殖业影响很大，因此要建立快速有效的检测方法，并针对该病进行有效治疗。

犬腺状病毒(Canineadenovirus，CAV)是哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种病毒，有两个血清型。其病毒基因组为单分子的、线状、双股DNA，呈线状盘曲于衣壳之中，CAV-I的基因组长约31Kb，CAV-Ⅱ的基因组长约32Kb，二者同源性为70-75%。I型既可引起犬传染性肝炎，还可引起狐狸脑炎，故又称狐狸脑炎与犬传染性肝炎病。Ⅱ型可引起犬传染性喉气管炎和肠炎。犬腺病毒同其它腺病毒一样，病毒广泛分布于全世界，引起了各国重视，其引起的感染是养犬业、毛皮经济动物养殖业危害最大的疫病之一。

犬瘟热病毒(Caninedistempervirus，CDV)是副粘病毒科的一种带包膜ssRNA(单链RNA)病毒。CDV与牛瘟等病毒一样，属于麻疹病毒属。除了人畜共患的狂犬病毒外，犬瘟热病毒是犬类最严重的病毒性疾病，已鉴定出多种病毒株。通过吸入或接触感染犬的鼻腔和眼部分泌物、尿液和粪便传播，也可经胎盘传播，犬舍清洁用品等被污染后也可能在犬群之间传播病毒。CDV在宿主中传播，并导致不同器官系统的损伤。最后，病毒血凝素的不同决定了细胞的趋向性和细胞致病性。因此，临床症状是多变的。高达50%的病例表现为亚临床症状。总体死亡率在30-80%之间，在未接种疫苗的动物、幼犬、以及并发肺炎或脑炎的案例中死亡率尤其高。

目前，已经相对成熟的检测方法有抗体的血清学试验，比如血凝试验、血凝抑制试验、琼脂扩散试验等，除此之外，ELISA的方法也相对广泛，但是ELISA方法的操作相对复杂，而且需要配合酶标仪来判读结果，整体反应时间长，因此不适用于基层的快速诊断的需求；层析法等待时间较长，诊断速度慢、诊断效率低，无法满足客户肉眼观察的需求。另外，大多数的试剂是需要2-8℃冷藏贮存，需要冷链运输，增加运输成本，无法满足室温储存的需要。再者，目前的检测都是每种病毒分别检测，检测程序长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒及其制备方法，通过在硝酸纤维素膜上同时包被犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒相关抗原、羊抗鼠抗体四个条带，并采用酶或胶体金标SPA抗体，应用免疫渗滤法原理检测犬血清中的犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒免疫抗体，实现快速检测、室温储存的目的，克服了现有检测技术操作复杂、繁琐、无法用全血检测、检测时间长、需要仪器、需要冷链运输的不足。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒，包括检测卡和酶或胶体金标SPA抗体溶液，检测卡包括试纸条，试纸条包括吸水垫，吸水垫上设有硝酸纤维素膜，所述酶是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶或纳米酶；

辣根过氧化物酶标SPA抗体溶液的制备方法包括如下步骤：

（1）预先将辣根过氧化物酶按照5mg/mL溶于超纯水中得到辣根过氧化物酶溶液，将高碘酸钠溶液10mg/mL加入辣根过氧化物酶溶液中，室温下避光轻搅40min，用pH4.4的醋酸盐缓冲液0.1M透析24h，期间换液3次；

（2）加入0.1M的碳酸盐缓冲液；

（3）加入5mg/mL的SPA抗体，辣根过氧化物酶与SPA抗体的质量比为2:1，室温下避光轻轻搅动5h；

（4）加入5mg/mL的硼氢化钠溶液，室温反应5h，观察反应液中无气泡溢出；

（5）用pH7.4的PBS缓冲液透析24h，期间换液3次，得到辣根过氧化物酶标SPA抗体；

（6）按照使用比例将辣根过氧化物酶标SPA抗体用辣根过氧化物酶标SPA抗体稀释液稀释后得辣根过氧化物酶标SPA抗体溶液。

作为一种优化方案，碱性磷酸酶标SPA抗体溶液的制备方法包括如下步骤：

（1）预先将碱性磷酸酶按照5mg/mL溶于超纯水中得到碱性磷酸酶溶液，加入10mg/mL的SPA抗体，碱性磷酸酶与SPA抗体的质量比为2:1，室温下避光反应6h，之后用pH7.4的PBS缓冲液透析24h，期间换液3次；

（2）加入30uL 25%的戊二醛溶液，4℃反应20h；

（3）用pH7.4的PBS缓冲液透析24h，期间换液3次，得到碱性磷酸酶标SPA抗体；

（4）按照使用比例将碱性磷酸酶标SPA抗体用碱性磷酸酶标SPA抗体稀释液稀释后得碱性磷酸酶标SPA抗体溶液。

作为一种优化方案，纳米酶标SPA抗体溶液的制备方法包括如下步骤：

（1）将5mg EDC和5mg NHS涡旋溶解于1mL去离子水中，加入5mg纳米酶，在室温下孵育1h，收集功能化的纳米酶，用超纯水洗涤两次；

（2）收集沉淀，加入50mM pH6.0 NaAc缓冲液，然后加入1mg/mL SPA抗体，将混合物涡旋混匀，在4℃下孵化24h；

（3）用0.1M pH7.4的PBS缓冲液洗涤两次，得到纳米酶标SPA抗体；

（4）再次用0.1M pH7.4的PBS缓冲液洗涤，然后分散到1mL纳米酶标SPA抗体稀释液中得纳米酶标SPA抗体溶液。

作为一种优化方案，胶体金标SPA抗体溶液的制备方法包括如下步骤：

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，加入0.1mol/L K

作为一种优化方案，所述辣根过氧化物酶标SPA抗体稀释液包括50mM PBS缓冲液、0.1%BSA、1%海藻糖、0.1%PVP和0.1%Proclin-300。

作为一种优化方案，所述碱性磷酸酶标SPA抗体稀释液包括50mM TBS缓冲液、0.1%BSA、0.5%海藻糖、0.05%PVA和0.1%Proclin-300。

作为一种优化方案，所述纳米酶标SPA抗体稀释液包括50mM PBS缓冲液、3%BSA、0.5%蔗糖、0.05%PEG和0.1%Proclin-300。

作为一种优化方案，所述胶体金标SPA抗体稀释液包括50mM pH8.0的Tris缓冲液、1.5%BSA、5%蔗糖、0.5%PEG和0.1%Proclin-300。

作为一种优化方案，所述检测卡包括上盖、下盖，上盖上设有观察窗和检测孔，检测卡的制备方法包括如下步骤：

（1）硝酸纤维素膜的制备：

在硝酸纤维素膜上依次包被犬细小病毒抗原、犬瘟热病毒抗原、犬腺病毒抗原和羊抗鼠抗体作为检测T1线、检测T2线和检测T3线和质控C线，犬细小病毒抗原的浓度为0.7mg/mL，犬瘟热病毒抗原的浓度为0.8mg/mL，犬腺病毒抗原的浓度为0.6mg/mL，羊抗鼠抗体的浓度为2mg/mL；

（2）吸水垫的制备：

将滤纸或卫生纸裁成2*2cm大小的小块，取6块用装订机装订在一起；

（3）检测卡的组装

先将吸水垫放于下盖的中间位置，然后将裁切好的硝酸纤维素膜放于吸水垫的正中间，将上盖对准硝酸纤维素膜按下密封。

作为一种优化方案，一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒，还包括样本稀释液，样本稀释液包括20mM PBS、0.2M SDS、0.5%吐温、0.1% S21、0.5% BSA和0.1%Proclin-300。

本发明采取以上技术方案，具有以下优点：

1、可同时检测猫瘟病毒、猫杯状病毒、猫疱疹病毒相关抗原的免疫抗体，减少了检测的程序，方便、快速、简捷；

2、可以使用全血，不需要昂贵的仪器设备、操作熟练的技术人员、较长的检测时间；

3、可常温保存12个月以上，适合在基层推广，不受样本量多少和种类的影响，适用于基层大批量检测，可应用于疫苗免疫效果的评估与检测，对预防和控制病毒的感染具有重要意义；

4、标记物是酶或胶体金标SPA抗体，应用于渗滤法上比层析法判读结果更快速；

5、检测准确率高。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为本发明一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒的检测卡的结构示意图；

图2为本发明一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒的检测卡的下盖和吸水垫的结构示意图；

图3为本发明一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒的检测卡的试纸条的结构示意图。

图中，

1-上盖，2-观察窗，3-吸水垫，4-下盖，5-硝酸纤维素膜，6-质控C线，7-检测T1线，8-检测T2线，9-检测T3线，10-检测孔。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中的百分数均为质量百分数。

实施例1：

如图1-3所示，一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒，包括检测卡和酶标SPA抗体溶液，检测卡包括上盖1、下盖4和试纸条，试纸条设置在上盖1和下盖4形成的容纳腔内，试纸条包括吸水垫3，吸水垫3上设有硝酸纤维素膜5。

上盖1上设有观察窗2和检测孔10，观察窗2的位置对应质控C线6、检测T1线7、检测T2线8和检测T3线9所在的位置。

一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒的制备方法包括酶标SPA抗体溶液的制备方法和检测卡的制备方法。

所述酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶标SPA抗体溶液的制备方法包括如下步骤：

（1）预先将辣根过氧化物酶按照5mg/mL溶于超纯水中得到辣根过氧化物酶溶液，将高碘酸钠溶液10mg/mL加入辣根过氧化物酶溶液中，室温下避光轻搅40min，用pH4.4的醋酸盐缓冲液0.1M透析24h，期间换液3次；

（2）加入0.1M的碳酸盐缓冲液；

（3）加入5mg/mL的SPA抗体，辣根过氧化物酶与SPA抗体的质量比为2:1，室温下避光轻轻搅动5h；

（4）加入5mg/mL的硼氢化钠溶液，室温反应5h，观察反应液中无气泡溢出；

（5）用pH7.4的PBS缓冲液透析24h，期间换液3次，得到辣根过氧化物酶标SPA抗体；

（6）按照使用比例将辣根过氧化物酶标SPA抗体用辣根过氧化物酶标SPA抗体稀释液稀释后得辣根过氧化物酶标SPA抗体溶液，按照每人份分装，然后真空冷冻干燥，密封后室温保存。

所述辣根过氧化物酶标SPA抗体稀释液包括50mM PBS缓冲液、0.1%BSA、1%海藻糖、0.1%PVP和0.1%Proclin-300。

BSA为能有效保护辣根过氧化物酶标SPA抗体活性的蛋白；海藻糖提高冻干固体复融、提高液体均匀分散及抗高温能力；PVP为便于提高辣根过氧化物酶标SPA抗体活性的大分子聚合物；Proclin-300为保护辣根过氧化物酶标SPA抗体稀释液稳定性的防腐剂。

所述检测卡的制备方法包括如下步骤：

（1）硝酸纤维素膜5的制备：

在硝酸纤维素膜5上依次包被犬细小病毒抗原、犬瘟热病毒抗原、犬腺病毒抗原和羊抗鼠抗体作为检测T1线7、检测T2线8和检测T3线9和质控C线6，犬细小病毒抗原的浓度为0.7mg/mL，犬瘟热病毒抗原的浓度为0.8mg/mL，犬腺病毒抗原的浓度为0.6mg/mL，羊抗鼠抗体的浓度为2mg/mL；

（2）吸水垫3的制备：

将滤纸裁成2*2cm大小的小块，取6块用装订机装订在一起；

（3）检测卡的组装

先将吸水垫3放于下盖4的中间位置，然后将裁切好的硝酸纤维素膜5放于吸水垫3的正中间，将上盖1对准硝酸纤维素膜5按下密封。

一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒，还包括样本稀释液，样本稀释液包括20mM PBS、0.2M SDS、0.5%吐温、0.1%S21、0.5%BSA和0.1%Proclin-300。

SDS具有裂解作用；吐温和S21为便于样本渗滤的表面活性剂；BSA为保护液体稳定性的蛋白；Proclin-300为保护样本稀释液稳定性的防腐剂。

实施例2：

与实施例1的不同之处在于酶标SPA抗体溶液的制备方法，其他与实施例1相同。

所述酶为碱性磷酸酶，碱性磷酸酶标SPA抗体溶液的制备方法包括如下步骤：

（1）预先将碱性磷酸酶按照5mg/mL溶于超纯水中得到碱性磷酸酶溶液，加入10mg/mL的SPA抗体，碱性磷酸酶与SPA抗体的质量比为2:1，室温下避光反应6h，之后用pH7.4的PBS缓冲液透析24h，期间换液3次；

（2）加入30uL 25%的戊二醛溶液，4℃反应20h；

（3）用pH7.4的PBS缓冲液透析24h，期间换液3次，得到碱性磷酸酶标SPA抗体；

（4）按照使用比例将碱性磷酸酶标SPA抗体用碱性磷酸酶标SPA抗体稀释液稀释后得碱性磷酸酶标SPA抗体溶液，按照每人份分装，然后真空冷冻干燥，密封后室温保存。

所述碱性磷酸酶标SPA抗体稀释液包括50mM TBS缓冲液、0.1%BSA、0.5%海藻糖、0.05%PVA和0.1%Proclin-300。

BSA为能有效保护碱性磷酸酶标SPA抗体活性的蛋白；海藻糖提高冻干固体复融、提高液体均匀分散及抗高温能力；PVA为便于提高碱性磷酸酶标SPA抗体活性的大分子聚合物；Proclin-300为保护碱性磷酸酶标SPA抗体稀释液稳定性的防腐剂。

实施例3：

与实施例1的不同之处在于酶标SPA抗体溶液的制备方法，其他与实施例1相同。

所述酶为纳米酶，纳米酶标SPA抗体溶液的制备方法包括如下步骤：

（1）将5mg EDC（Sigma）和5mg NHS（Sigma）涡旋溶解于1mL去离子水中，加入5mg纳米酶，在室温下孵育1h，收集功能化的纳米酶，用超纯水洗涤两次；

（2）收集沉淀，加入50mM pH6.0 NaAc缓冲液，然后加入1mg/mL SPA抗体，将混合物涡旋混匀，在4℃下孵化24h；

（3）用0.1M pH7.4的PBS缓冲液洗涤两次，得到纳米酶标SPA抗体；

（4）再次用0.1M pH7.4的PBS缓冲液洗涤，然后分散到1mL纳米酶标SPA抗体稀释液中得纳米酶标SPA抗体溶液，按照每人份分装，然后真空冷冻干燥，密封后室温保存。

所述纳米酶标SPA抗体稀释液包括50mM PBS缓冲液、3%BSA、0.5%蔗糖、0.05%PEG和0.1%Proclin-300。

BSA为能有效保护纳米酶标SPA抗体活性的蛋白；蔗糖提高冻干固体复融、提高液体均匀分散及抗高温能力；PEG为便于提高纳米酶标SPA抗体活性的大分子聚合物；Proclin-300为保护纳米酶标SPA抗体稀释液稳定性的防腐剂。

实施例4：

如图1-3所示，一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒，包括检测卡和胶体金标SPA抗体溶液，检测卡包括上盖1、下盖4和试纸条，试纸条设置在上盖1和下盖4形成的容纳腔内，试纸条包括吸水垫3，吸水垫3上设有硝酸纤维素膜5。

上盖1上设有观察窗2和检测孔10，观察窗2的位置对应质控C线6、检测T1线7、检测T2线8和检测T3线9所在的位置。

一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒的制备方法包括胶体金标SPA抗体的制备方法和检测卡的制备方法。

所述胶体金标SPA抗体溶液的制备方法包括如下步骤：

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，加入0.1mol/L K

所述胶体金标SPA抗体稀释液包括50mM pH8.0的Tris缓冲液、1.5%BSA、5%蔗糖、0.5%PEG和0.1%Proclin-300。

BSA为能有效保护胶体金标SPA活性的蛋白；蔗糖提高冻干固体复融、提高液体均匀分散及抗高温能力；PEG为便于提高胶体金标SPA活性的大分子聚合物；Proclin-300为保护胶体金标SPA抗体稀释液稳定性的防腐剂。

所述检测卡的制备方法包括如下步骤：

（1）硝酸纤维素膜5的制备：

在硝酸纤维素膜5上依次包被犬细小病毒抗原、犬瘟热病毒抗原、犬腺病毒抗原和羊抗鼠抗体作为检测T1线7、检测T2线8和检测T3线9和质控C线6，犬细小病毒抗原的浓度为0.7mg/mL，犬瘟热病毒抗原的浓度为0.8mg/mL，犬腺病毒抗原的浓度为0.6mg/mL，羊抗鼠抗体的浓度为2mg/mL；

（2）吸水垫3的制备：

将卫生纸裁成2*2cm大小的小块，取6块用装订机装订在一起；

（3）检测卡的组装

先将吸水垫3放于下盖4的中间位置，然后将裁切好的硝酸纤维素膜5放于吸水垫3的正中间，将上盖1对准硝酸纤维素膜5按下密封。

一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒，还包括样本稀释液，样本稀释液包括20mM PBS、0.2M SDS、0.5%吐温、0.1% S21、0.5% BSA和0.1%Proclin-300。

SDS具有裂解作用；吐温和S21为便于样本渗滤的表面活性剂；BSA为保护液体稳定性的蛋白；Proclin-300为保护样本稀释液稳定性的防腐剂。

实施例5：

1、检测：

一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒的检测方法包括以下步骤：

（1）样本准备：取5μL血清、血浆加入到样本稀释液中混匀，待液体澄清透明后使用；

（2）酶标SPA抗体液体准备：取300μL纯水加入到分装好的酶标SPA抗体冻干管内，待全部复溶后使用；

（3）将检测卡放在水平操作台上，在检测孔10内加入200μL TBST缓冲液，待洗涤液完全渗入后将步骤（1）得到的样本全部加入检测孔内，待样本完全渗入后再加入200μLTBST缓冲液，待洗涤液完全渗入后加入复溶后的酶标SPA抗体液体，待酶标SPA抗体液体完全渗入后加入200μL TBST缓冲液，待洗涤液完全渗入后加入200μL显色液，待显色液完全渗入后等待3min，加入200μL超纯水后立即观察结果。

2、检测说明：

若样本中含有犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒相关抗原的一种或多种抗体，则与检测卡中的酶标SPA抗体形成免疫复合物，通过渗滤作用，与包被在硝酸纤维素膜5上的犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒相关抗原反应，继续加入显色液、终止液，在检测T线处形成紫红色条带；无论样本中是否含有相应的抗体，酶标SPA抗体通过渗滤作用，与包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠抗体相互作用，在质控C线处形成紫红色条带。若酶标SPA抗体失效，此线就不会出现，说明检测卡失效。

3、结果判断：

（1）若质控C线、检测T1线处形成紫红色条带，说明该样本中含有犬细小病毒抗体；

（2）若质控C线、检测T2线处形成紫红色条带，说明该样本中含有犬瘟热病毒抗体；

（3）若质控C线、检测T3线处形成紫红色条带，说明该样本中含有犬腺病毒抗体；

（4）若质控C线、检测T1线、检测T2线处形成紫红色条带，说明该样本中含有犬细小病毒和犬瘟热病毒抗体；

（5）若质控C线、检测T1线检测T3线处形成紫红色条带，说明该样本中含有犬细小病毒和犬腺病毒抗体；

（6）若质控C线、检测T2线、检测T3线处形成紫红色条带，说明该样本中含有犬瘟热病毒和犬腺病毒抗体；

（7）若质控C线、检测T1线、检测T2线、检测T3线处形成紫红色条带，说明该样本中含有犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒三种病毒的抗体；

（8）若仅在质控C线处出现一条紫红色条带，说明该样本不含有这三种病毒的抗体；

（9）若质控C线处不出现紫红色条带，说明检测卡失效。

实施例6：

1、检测：

一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒的检测方法包括以下步骤：

（1）样本准备：取10μL全血加入到样本稀释液中混匀，待液体澄清透明后使用；

（2）胶体金标记SPA抗体液体准备：取300μL纯水加入到分装好的胶体金标记SPA冻干管内，待全部复溶后使用；

（3）将检测卡放在水平操作台上，在检测孔10内加入200μL TBST缓冲液，待洗涤液完全渗入后将步骤（1）得到的样本全部加入检测孔内，待样本完全渗入后再加入200μLTBST缓冲液，待洗涤液完全渗入后加入复溶后的胶体金标记SPA抗体液体，待胶体金标记SPA抗体液体完全渗入后加入200μL TBST缓冲液，立即观察结果。

2、检测说明：

若样本中含有犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒相关抗原的一种或多种抗体，则与检测卡中的胶体金标记SPA抗体形成免疫复合物，通过渗滤作用，与包被在硝酸纤维素膜5上的犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒相关抗原反应，在检测T线处形成紫红色条带；无论样本中是否含有相应的抗体，胶体金标记SPA抗体通过渗滤作用，与包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠抗体相互作用，在质控C线处形成紫红色条带。若胶体金标记SPA抗体失效，此线就不会出现，说明检测卡失效。

3、结果判断：

（1）若质控C线、检测T1线处形成紫红色条带，说明该样本中含有犬细小病毒抗体；

（2）若质控C线、检测T2线处形成紫红色条带，说明该样本中含有犬瘟热病毒抗体；

（3）若质控C线、检测T3线处形成紫红色条带，说明该样本中含有犬腺病毒抗体；

（4）若质控C线、检测T1线、检测T2线处形成紫红色条带，说明该样本中含有犬细小病毒和犬瘟热病毒抗体；

（5）若质控C线、检测T1线检测T3线处形成紫红色条带，说明该样本中含有犬细小病毒和犬腺病毒抗体；

（6）若质控C线、检测T2线、检测T3线处形成紫红色条带，说明该样本中含有犬瘟热病毒和犬腺病毒抗体；

（7）若质控C线、检测T1线、检测T2线、检测T3线处形成紫红色条带，说明该样本中含有犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒三种病毒的抗体；

（8）若仅在质控C线处出现一条紫红色条带，说明该样本不含有这三种病毒的抗体；

（9）若质控C线处不出现紫红色条带，说明检测卡失效。

检测结果准确性实验：

采集23份犬细小病毒、25份犬瘟热病毒、22份犬腺病毒阳性血清，分别用实施例1-4得到的检测卡进行检测，检测结果的准确率均在95%以上。其具体结果如下：

检测结果稳定性实验：

分别采集三份包含犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒的阳性血清作为样本1、样本2和样本3，三份样本中涵盖了三种病毒在强、中、弱三个梯度的显色，三份样本分别用实施例1得到的检测卡常温保存15个月，每个月进行一次检测并记录结果。实验结果表明该试剂保存15个月后每个检测项目的结果均符合要求，为保证试剂的准确性，故该试剂的保质期可以确定为12个月。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。