一种水溶性复合佐剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药和疫苗技术领域，具体涉及一种水溶性复合佐剂及其制备方法和应用。

背景技术

疫苗作为对抗病原的一类重要生物制剂，能够有效地保护人类被各种病原所感染。亚单位疫苗是利用病原体自身的蛋白制备的一种疫苗，其具有纯度高，成本低，安全性能高的优点。尽管亚单位疫苗有诸多优势，但也具有一定的劣势。亚单位疫苗的免疫原性较弱，需要多次接种以增强免疫应答，亚单位疫苗的免疫原作为蛋白质在体内还容易被免疫系统快速地清除，因此需要在亚单位疫苗中添加佐剂增强机体免疫反应。

佐剂被用来增加抗原的免疫原性具有以下优点：(1)减少抗原的使用量；(2)减少免疫接种次数；(3)更快更持久的诱导相关抗体；(4)提高疫苗在新生儿、老年人或免疫功能低下人群中的疗效。根据作用机制不同，将佐剂分为两类：免疫增强剂和递送系统。一些由病原体相关分子模式或合成的模式识别受体激活剂组成的免疫增强剂激活先天性诱导随后产生细胞因子和趋化因子的免疫反应。由细胞或细胞因子组成的其他免疫增强剂，如树突状细胞、IL-12或GM-CSF，可以直接激活免疫。递送系统，包括脂质体、胶束、病毒体、纳米颗粒、微球、油/水乳液、病毒样颗粒和免疫刺激复合物，通常将抗原携带到靶细胞，并协助抗原呈递细胞摄取抗原。

铝盐的免疫增强作用在20世纪20年代首次报道，已在疫苗中得到应用。含铝佐剂主要诱导T辅助因子2(TH2)细胞反应，但不能诱导TH1或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。因此，通常认为含铝佐剂不能引发对病毒或肿瘤疫苗至关重要的细胞免疫反应。因此，迫切需要开发一种新型佐剂，激起细胞免疫反应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水溶性复合佐剂及其制备方法和应用，简化疫苗生产工艺、节约疫苗生产成本和增强疫苗免疫原性。

为了实现上述目的，本发明提供了一种复合佐剂，包括人参皂苷、黄芪多糖和二价锰盐；

所述复合佐剂中人参皂苷和黄芪多糖的质量比为(1～10)：(1～10)；

所述复合佐剂中人参皂苷和二价锰盐的质量比为(1～10)：0.1；所述二价锰盐的质量以二价锰离子的质量计。

优选的，所述复合佐剂中人参皂苷的浓度为0.3～3g/L。

优选的，所述人参皂苷包括人参皂苷Rh2。

本发明还提供了上述技术方案所述复合佐剂的制备方法，包括如下步骤：

将人参皂苷和溶剂混合，充分溶解得人参皂苷溶液；

将黄芪多糖和溶剂混合，充分溶解得黄芪多糖溶液；

将二价锰盐和溶剂混合，充分溶解得锰盐溶液；

将所述人参皂苷溶液、黄芪多糖溶液和锰盐溶液按照(1～10)：(1～10)：0.1的质量比混合，充分溶解得所述复合佐剂。

所述人参皂苷溶液的质量以人参皂苷的质量计；

所述黄芪多糖溶液的质量以黄芪多糖的质量计；

所述锰盐溶液的质量以二价锰离子的质量计。

优选的，所述溶剂包括Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、生理盐水和水中的一种或多种。

本发明还提供了上述技术方案所述复合佐剂在制备疫苗中的应用。

优选的，所述疫苗包括亚单位疫苗。

优选的，所述亚单位疫苗包括猪瘟亚单位疫苗和/或伪狂犬亚单位疫苗。

本发明还提供了一种亚单位疫苗，包括抗原蛋白和佐剂；

所述佐剂为上述技术方案所述复合佐剂。

优选的，所述亚单位疫苗中复合佐剂和抗原蛋白的体积比为(1～1000)：1；

所述亚单位疫苗中抗原蛋白的浓度为10～300μg/ml。

优选的，所述抗原蛋白包括猪瘟病毒结构蛋白E2、猪伪狂犬病毒gB糖蛋白或猪伪狂犬病毒gD糖蛋白。

有益效果：

本发明提供了一种复合佐剂，包括人参皂苷、黄芪多糖和二价锰盐；所述复合佐剂中人参皂苷和黄芪多糖的质量比为(1～10)：(1～10)；所述复合佐剂中人参皂苷和二价锰盐的质量比为(1～10)：0.1；所述二价锰盐的质量以二价锰离子的质量计。本发明提供的复合佐剂能够结合蛋白质和各种抗原，被动物机体快速吸收，不产生副反应，具备安全性。与商业化佐剂对比，本发明复合佐剂与蛋白免疫原混合制备成亚单位疫苗后，可以增强蛋白免疫原对机体的免疫效果，用于制备亚单位疫苗。

本发明所提供的复合佐剂不同于传统佐剂，无需经过乳化步骤，只需使佐剂和蛋白混合均匀，即可制备疫苗，简化了疫苗生产程序，能够降低疫苗生产成本，增强疫苗免疫原性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为测试例1不同剂量复合佐剂对仔猪体温的影响；

图2为测试例2复合佐剂对蛋白热稳定性的检测结果；

图3为测试例3不同疫苗免疫小鼠后小鼠血清中和抗体水平的检测结果；

图4为测试例4不同疫苗对感染致死剂量伪狂犬病毒小鼠的保护效果。

具体实施方式

本发明提供了一种复合佐剂，包括人参皂苷、黄芪多糖和二价锰盐；

所述复合佐剂中人参皂苷和黄芪多糖的质量比为(1～10)：(1～10)；

所述复合佐剂中人参皂苷和二价锰盐的质量比为(1～10)：0.1；所述二价锰盐的质量以二价锰离子的质量计。

在本发明中，所述复合佐剂包括人参皂苷。本发明所述复合佐剂中人参皂苷的浓度优选为0.3～3g/L，进一步优选为0.5～2.5g/L，更优选为1.0～2.0g/L，最优选为1.5g/L。本发明所述人参皂苷优选包括人参皂苷Rh2，进一步优选为达玛烷型人参皂苷Rh2。

在本发明中，所述复合佐剂包括黄芪多糖。本发明所述复合佐剂中人参皂苷和黄芪多糖质量比优选为(1～10)：(1～10)，进一步优选为1：1。

在本发明中，所述复合佐剂包括二价锰盐。本发明所述复合佐剂中人参皂苷和二价锰盐质量比优选为(1～10)：0.1，进一步优选为1：0.1。本发明所述二价锰盐的质量以二价锰离子的质量计。本发明所述二价锰盐优选包括硫酸锰和/或四氯化锰。

黄芪多糖作是黄芪重要的活性成分，具有调节免疫和抗肿瘤等作用，调节免疫的功能体现在其调节Toll样受体、促进免疫细胞的增值、促进/抑制细胞因子的释放和影响免疫球蛋白的分泌；人参皂苷是人参中最重要的药理活性成分，具有抗肿瘤、抗炎等多种药理作用，但人参皂苷水溶性差和吸收性较差；锰参与多项生理活性过程，包括发育、生殖、神经元功能和抗氧化剂防御，能够提高DNA传感器cGAS及其下游衔接蛋白STING的灵敏度，是一种强大的先天免疫刺激因子，在没有任何感染的情况下诱导I型干扰素和细胞因子的产生，可以保护抗原蛋白在体内的不被清除，将黄芪多糖、人参皂苷和锰盐作为复合佐剂的成分，可以通过胶束、脂质体、纳米乳、金属纳米颗粒和白蛋白纳米颗粒在体内递送来解决人参皂苷水溶性差和吸收性差的缺点，三者协同增效，激起较高水平的免疫反应。

本发明还提供了上述技术方案所述复合佐剂的制备方法，包括如下步骤：

将人参皂苷和溶剂混合，充分溶解得人参皂苷溶液；

将黄芪多糖和溶剂混合，充分溶解得黄芪多糖溶液；

将二价锰盐和溶剂混合，充分溶解得锰盐溶液；

将所述人参皂苷溶液、黄芪多糖溶液和锰盐溶液按照(1～10)：(1～10)：0.1的质量比混合，得所述复合佐剂。

本发明将人参皂苷和溶剂混合时，优选将人参皂苷和溶剂按照1：(9～20)的质量比混合，进一步优选按照1：9的质量比混合。本发明将黄芪多糖和溶剂时，优选将黄芪多糖和溶剂按照1：(5～20)的质量比的混合，进一步优选按照1：19的质量比混合。本发明将二价锰盐和溶剂混合，优选将二价锰盐和溶剂按照1g：1L的质量体积比混合。本发明制备所述人参皂苷溶液、黄芪多糖溶液和锰盐溶液时，所述充分溶解的方式分别优选为60℃加热溶解。

在本发明中，所述溶剂优选包括Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、生理盐水和水中的一种或多种，进一步优选为磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液优选包括如下浓度的成分：磷酸二氢钾0.10～0.27g/L，磷酸氢二钠3.00～3.58g/L，氯化钠5～8g/L和氯化钾0.1～0.2g/L，进一步优选为磷酸二氢钾0.27g/L，磷酸氢二钠3.58g/L，氯化钠8g/L和氯化钾0.2g/L。本发明所述磷酸盐缓冲液优选以注射用水为溶剂。

本发明将所述人参皂苷溶液、黄芪多糖溶液和锰盐溶液按照(1～10)：(1～10)：0.1的质量比混合的方式优选包括：100～800rpm搅拌10～30min，进一步优选为800rpm搅拌30min。

本发明提供的复合佐剂生产成本低，可以降低疫苗成本，可以搭载不同抗原蛋白并增强蛋白的稳定性，不会引起猪的发热，具有很好的安全性，优化疫苗生产工艺。

本发明还提供了上述技术方案所述复合佐剂在制备疫苗中的应用。

在本发明中，所述疫苗优选包括亚单位疫苗，进一步优选包括猪瘟亚单位疫苗和/或伪狂犬亚单位疫苗；所述猪瘟亚单位疫苗优选以猪瘟病毒结构蛋白E2作为抗原蛋白；所述伪狂犬亚单位疫苗优选以猪伪狂犬病毒gB糖蛋白或猪伪狂犬病毒gD糖蛋白作为抗原蛋白，进一步优选以猪伪狂犬病毒gD糖蛋白作为抗原蛋白。

本发明还提供了一种亚单位疫苗，包括抗原蛋白和佐剂；

所述佐剂为上述技术方案所述复合佐剂。

在本发明中，所述亚单位疫苗中复合佐剂和抗原蛋白的体积比优选为(1～1000)：1，进一步优选为1：1。本发明所述抗原蛋白的体积优选为利用溶剂稀释抗原蛋白后的体积。本发明所述溶剂优选包括Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、生理盐水和水中的一种或多种，进一步优选为磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液优选包括如下浓度的成分：磷酸二氢钾0.10～0.27g/L，磷酸氢二钠3.00～3.58g/L，氯化钠5～8g/L和氯化钾0.1～0.2g/L，进一步优选为磷酸二氢钾0.27g/L，磷酸氢二钠3.58g/L，氯化钠8g/L和氯化钾0.2g/L。本发明所述磷酸盐缓冲液优选以注射用水为溶剂。本发明用于稀释抗原蛋白的溶剂优选与制备所述复合佐剂的溶剂一致。

在本发明中，所述亚单位疫苗中抗原蛋白的浓度优选为10～300μg/ml，进一步优选为50～200μg/ml，更优选为200μg/ml。本发明所述抗原蛋白优选包括猪瘟病毒结构蛋白E2、猪伪狂犬病毒gB糖蛋白或猪伪狂犬病毒gD糖蛋白，进一步优选为猪伪狂犬病毒gD糖蛋白。

本发明提供的疫苗将上述复合佐剂和抗原蛋白组合，不需要繁琐费时的步骤，与商业化佐剂相比可以激起更好的免疫反应从而更好的保护机体不被病毒感染，可以降低疫苗成本，快速和持久地激起机体免疫反应。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种水溶性复合佐剂及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明实施例所使用的试剂、菌株和设备，如无特殊说明，均可市售获得。本发明下述实施例，如无特别说明，均是常规的实验方法。

实验例1

一种复合佐剂的制备方法，由如下步骤组成：

1)将1g达玛烷型人参皂苷Rh2溶于9g的缓冲液(磷酸二氢钾0.27g/L，磷酸氢二钠3.58g/L，氯化钠8g/L和氯化钾0.2g/L，以注射用水为溶剂)中，水浴60℃加热使原料充分溶解，得到人参皂苷溶液；

2)将1g黄芪多糖溶于19g的缓冲液(磷酸二氢钾0.27g/L，磷酸氢二钠3.58g/L，氯化钠8g/L和氯化钾0.2g/L，以注射用水为溶剂)中，水浴60℃加热使原料充分溶解，得到黄芪多糖溶液；

3)将197.91g固体四水氯化锰溶于1L的缓冲液(磷酸二氢钾0.27g/L，磷酸氢二钠3.58g/L，氯化钠8g/L和氯化钾0.2g/L，以注射用水为溶剂)中，水浴60℃加热使原料充分溶解，得到锰盐溶液。

4)将人参皂苷溶液(以达玛烷型人参皂苷Rh2质量计)、黄芪多糖溶液(以黄芪多糖质量计)和锰盐溶液(以二价锰离子质量计)按照1：1：0.1的质量比混合，使用磁力搅拌器在800rpm下搅拌30min，使三种物质充分混合，得到复合佐剂。

测试例1

复合佐剂对猪体温影响

选取20头仔猪，随机分为4组，每组5只：

第一组(1ml水溶性复合佐剂/pig)：按照1ml/只的剂量取实施例1制备而成的复合佐剂，将其通过颈部肌肉给猪注射；

第二组(1.5ml水溶性复合佐剂/pig)：按照1.5ml/只的剂量取实施例1制备而成的复合佐剂，将其通过颈部肌肉给猪注射；

第三组(2ml水溶性复合佐剂/pig)：按照2ml/只的剂量取实施例1制备而成的复合佐剂，将其通过颈部肌肉给猪注射；

第四组(4ml水溶性复合佐剂/pig)：按照4ml/只的剂量取实施例1制备而成的复合佐剂，将其通过颈部肌肉给猪注射；

注射后检测猪体温变化，得到的结果见图1和表1。

表1注射不同剂量复合佐剂猪直肠体温

根据表1和图1可以看出，在仔猪颈部肌肉位置注射不同剂量复合佐剂(1，1.5，2，4ml/只)不会使仔猪的直肠温度上升到39.5℃以上，本发明涉及的复合佐剂对猪具有良好的安全性，可以作为一种新型佐剂应用于猪用疫苗。

测试例2

复合佐剂对与抗原蛋白热稳定性的影响

利用缓冲液(磷酸二氢钾0.27g/L，磷酸氢二钠3.58g/L，氯化钠8g/L和氯化钾0.2g/L，以注射用水为溶剂)稀释伪狂犬病毒糖蛋白gD嵌合IgG Fc的嵌合蛋白gD-Fc(Li J,Li X,Hao G,Zhang H,Yang H,Chen H,Qian P.Fusion of pseudorabies virusglycoproteins to IgG Fc enhances protective immunity against pseudorabiesvirus.Virology.2019Oct；536:49-57.)，然后与实施例1中的复合佐剂按照1：1的体积比混合，使嵌合蛋白gD-Fc的终浓度为200μg/ml，作为实验样品；

将PBS和伪狂犬病毒糖蛋白gD嵌合IgG Fc的嵌合蛋白gD-Fc混合，使蛋白的终浓度为200μg/mL，作为对照样品

使用毛细血管吸满实验样品或对照样品后，利用NanoDSF仪器检测样品中gD-Fc的热变性温度Tm，结果如有图2所示。

根据图2可以看出，PBS配伍的gD-Fc的热变性温度Tm＝54.6℃，实施例1得到的复合佐剂配伍的gD-Fc热变性温度Tm＝57℃，本发明提供的复合佐剂可以使抗原蛋白的热变形温度提升2.4℃，作为新型佐剂应用于亚单位疫苗可以提升抗原蛋白在体内外的蛋白稳定性。

实施例2

一种亚单位疫苗，将实施例1制备的复合佐剂和伪狂犬病毒糖蛋白gD嵌合IgG Fc的嵌合蛋白gD-Fc混合得到，记为水溶性复合佐剂-gD-Fc，具体的，利用缓冲液(磷酸二氢钾0.27g/L，磷酸氢二钠3.58g/L，氯化钠8g/L和氯化钾0.2g/L，以注射用水为溶剂)稀释嵌合蛋白gD-Fc后，与实施例1得到的复合佐剂按照1：1的体积比混合得到。

其中，亚单位疫苗中嵌合蛋白gD-Fc的浓度为200μg/mL。

对比例1

一种亚单位疫苗，将商业化佐剂ISA201和伪狂犬病毒糖蛋白gD嵌合IgG Fc的嵌合蛋白gD-Fc混合，经过传统乳化步骤得到，记为ISA201-gD-Fc；

其中亚单位疫苗中嵌合蛋白gD-Fc的浓度为200μg/mL。

对比例2

一种亚单位疫苗，将商业化佐剂Gel01和伪狂犬病毒糖蛋白gD嵌合IgG Fc的嵌合蛋白gD-Fc混合，经过传统乳化步骤得到，记为Gel01-gD-Fc；

其中亚单位疫苗中嵌合蛋白gD-Fc的浓度为200μg/mL。

对比例3

一种亚单位疫苗，将商业化佐剂Al(OH)

其中亚单位疫苗中嵌合蛋白gD-Fc的浓度为200μg/mL。

测试例3

不同疫苗免疫小鼠后小鼠血清中和抗体水平

选取6～8周龄BALB/c小鼠25只，随机分为5组，每组5只。在第0，21天分别在五组小鼠大腿肌肉处进行两次免疫，其中：

第一组免疫剂量为100μL/次无菌PBS，共计200μL；

第二组免疫剂量为100μL/次实施例2得到的水溶性复合佐剂-gD-Fc，共计200μL；

第三组免疫剂量为100μL/次对比例1得到的ISA201-gD-Fc，共计200μL；

第四组免疫剂量为100μL/次对比例2得到的Gel01-gD-Fc，共计200μL；

第五组免疫剂量为100μL/次对比例3得到的Al(OH)3-gD-Fc，共计200μL。

通过眼眶采血的方式，采取小鼠首免后第10，21和35天血液，提取血清，将血清进行56℃，30min处理后检测血清中的猪伪狂犬病毒中和抗体滴度，每组重复检测两次，结果如表2和图3所示。

表2不同疫苗免疫小鼠后小鼠血清中和抗体水平

根据表2和图3可以看出，在首免后第35天，水溶性复合佐剂-gD-Fc组可以诱导和商业化佐剂Gel01组相当的中和抗体水平，与此同时，水溶性复合佐剂-gD-Fc组诱导的抗体水平要高于商业化佐剂ISA201和Al(OH)3佐剂组。本发明提供的复合佐剂配伍抗原蛋白gD-Fc可以激起机体产生较高水平的中和抗体。

测试例4

不同疫苗对攻毒小鼠的存活率的影响

选取6-8周龄BALB/c小鼠25只，随机分为5组，每组5只。在第0，21天分别在五组小鼠大腿肌肉处进行两次免疫，其中：

第一组免疫剂量为100μL/次无菌PBS，共计200μL；

第二组免疫剂量为100μL/次实施例2得到的水溶性复合佐剂-gD-Fc，共计200μL；

第三组免疫剂量为100μL/次对比例1得到的ISA201-gD-Fc，共计200μL；

第四组免疫剂量为100μL/次对比例2得到的Gel01-gD-Fc，共计200μL；

第五组免疫剂量为100μL/次对比例3得到的Al(OH)3-gD-Fc，共计200μL。

在首免后第42天，使用10×LD50/只的伪狂犬病毒剂量对小鼠进行攻毒，攻毒后检测14天内小鼠存活率，结果如表3和图4所示。

表3不同疫苗免疫小鼠后攻毒小鼠的成活率

根据表3和图4可以看出，在攻毒后的14天内，水溶性复合佐剂组的存活率为100％，佐剂Gel01，ISA201和Al(OH)3佐剂组小鼠存活率分别为100％，80％，80％。结果表明，本发明提供的复合佐剂作为一种新型佐剂应用于亚单位疫苗可以很好的保护被致死剂量病毒感染的小鼠，其保护力与当前兽用亚单位疫苗所用的商业化佐剂效果相当。

实施例3

一种亚单位疫苗，将实施例1制备的复合佐剂和猪瘟病毒结构蛋白E2(Ren X,QianP,Liu S,Chen H,Li X.Fc-Mediated E2-Dimer Subunit Vaccines of Atypical PorcinePestivirus Induce Efficient Humoral and Cellular Immune Responses inPiglets.Viruses.2021Dec 6；13(12):2443.doi:10.3390/v13122443.)混合得到，记为水溶性复合佐剂-E2；

其中，亚单位疫苗中猪瘟病毒结构蛋白E2的浓度为200μg/mL。

测试例5

不同疫苗免疫剂量免疫猪后血清中和抗体水平

选取8只体重在100-120kg的猪瘟抗体阴性的猪只，随机分为两组，每组四只。其中一组分别在第0，21天每头猪免疫0.5ml实施例3得到的水溶性复合佐剂-E2；另外一组分别在第0，21天每头猪免疫1.0ml实施例3得到的疫苗水溶性复合佐剂-E2。

在首免后第0，20，40天采集猪外周血获得猪血清，使用美国爱徳士猪瘟病毒抗体检测试剂盒(阻断ELISA)检测猪血清中的猪瘟抗体水平。结果见表4。

表4猪血清中和抗体水平

注：当血清中检测的猪瘟抗体水平(阻断率)大于40％时，说明血清猪瘟抗体阳性。

根据表4可以看出，在第二十天，虽然每组各有一只猪血清猪瘟抗体呈现阴性，但每组其余三只猪均呈现猪瘟抗体水平阳性。在第40天，两组所有猪只均呈现猪瘟抗体阳性，并且免疫0.5ml实施例3得到的疫苗水溶性复合佐剂-E2的猪只猪瘟抗体水平(阻断率)大于84.58％，免疫1.0ml实施例3得到的疫苗水溶性复合佐剂-E2的猪只猪瘟抗体水平(阻断率)大于75.92％。本发明提供的复合佐剂可以作为猪瘟病毒抗原蛋白E2的亚单位疫苗的佐剂，很好地激起猪瘟抗体的产生从而保护猪只感染猪瘟病毒。

根据上述内容可以看出，本发明提供的复合佐剂可用于结合蛋白质和各种抗原，能被动物机体快速吸收，不产生副反应，具备安全性，可以简化疫苗生产程序和降低疫苗生产成本，与商业化佐剂对比，可以增强疫苗免疫效果。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。