一种基于金纳米簇的比率荧光生物传感器及其制备方法与其在检测曲霉属霉菌中的应用

技术领域

本发明涉及食品安全生物技术领域，尤其涉及一种基于金纳米簇的比率荧光生物传感器及其制备方法与其在检测曲霉属霉菌中的应用。

背景技术

休闲食品是人们间隙、休憩时所吃的食品，主要分为谷物类制品、干果类制品、糖食类制品和肉制食品等。2020年休闲食品行业总产值达到3万亿元，预计2025年将超过4万亿元，由此可见，休闲食品行业发展速度迅猛，发展潜力巨大。其中坚果炒货行业年产值从452亿元迅速增长到1214亿元，年均复合增长率达15.2％，增速远高于整体休闲食品。同时，自2017年以来，全国各地已陆续查处、通报198起食品霉菌超标的情况，坚果炒货类目被通报霉菌超标的情况占通报总数的20％，该问题已逐渐成为行业发展的瓶颈之一。曲霉属作为一种常见的腐生菌，不仅能够产生大量的孢子，同时还具有不同的生化活性。因此其分布广泛，可以在不同环境和基质上成长，尤其是在潮湿温暖的环境下的植物性产品上进行繁殖并产生霉菌毒素。然而黄曲霉在腰果、开心果、栗子和杏仁等霉变污染中均有报道，是引起坚果霉变的主要污染物。

目前检测霉菌常用的方法为传统培养法和生化检测技术。传统培养法即国标法GB4789.15-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》，传统培养法结果准确，但检测周期较长，且操作步骤繁琐，不适合快速、高效检测的需求。生化检测技术即通过霉菌在生长和繁殖的过程中所产生的代谢产物与特定底物之间的特异性反应来进行种类和数量的检测。常用的检测方法有快速测试片法和ATP生物发光技术检测法，该类方法虽然操作简单，成本低廉，但检测结果准确性欠佳。

分子生物学技术基于核酸及其表达产物的相互关系和相互作用，为食品霉菌检测领域提供了新的思路和重要依据。目前，基于PCR的检测方法仍是检测食品中霉菌的首选方法。基于PCR的检测方法的有效性取决于其特异性地体外扩增靶标DNA序列，具有较高的特异性和灵敏度。但是，PCR检测无法达到定量，只能停留在定性的阶段。同时检测过程中开盖导致的气溶胶污染会造成检测结果的假阳性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于金纳米簇的比率荧光生物传感器及其制备方法与其在检测曲霉属霉菌中的应用。本发明以曲霉属霉菌基因组为靶标，通过DNAMAN软件比对序列，NEB LAMP PrimerDesignTool等软件设计LAMP引物，在确定引物特异性的基础上加入FITC@AuNCs进行LAMP反应。利用BSA保护的AuNCs作为荧光基团，FITC作为pH的响应信号，随着LAMP反应的进行，大量焦磷酸盐和氢离子被释放，导致FITC和AuNCs的比率荧光信号逐渐下降，可用于核酸检测的定量分析。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一个目的在于提供一种基于金纳米簇的比率荧光生物传感器，所述比率荧光生物传感器包括引物探针和FITC@AuNCs，所述引物探针包括上游外引物、下游外引物、上游内引物、下游内引物、上游环引物和下游环引物；

所述上游外引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游外引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述上游内引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游内引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述上游环引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述下游环引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明的其中一个实施例中，所述FITC@AuNCs，包括由FITC交联的金纳米簇材料：其中，所述的由FITC交联的金纳米簇直径约为5-8nm。

本发明的其中一个实施例中，所述FITC@AuNCs通过以下方法制备得到：

将HAuCl

本发明的其中一个实施例中，pH值为9-11。

本发明的其中一个实施例中，所述FITC的醇溶液的浓度为1-2mg/mL。

本发明的第二个目的在于提供一种试剂盒，包括所述比率荧光生物传感器。

本发明的第三个目的在于提供所述的比率荧光生物传感器、所述的试剂盒在定量或定性检测霉菌中的应用。

所述试剂盒对曲霉属的检测限为7.4×10

进一步地，使用所述试剂盒检测坚果中的曲霉属霉菌方法，包括以下步骤：

(1)设计引物的特异性验证

分别提取曲霉属、青霉属与镰刀菌属标准样品基因组，加入引物组合，配置25μLLAMP体系，设置LAMP程序进行扩增实验，通过检测样品中所含菌属扩增产物电泳结果，确定所设计引物的特异性；

(2)曲霉属标准曲线的建立

分别配置不同浓度的曲霉属的标准品基因组，加入引物组合，配置25μLLAMP体系，设置LAMP程序进行扩增实验，通过检测不同浓度标准品溶液在反应结束后的荧光响应，建立曲霉属霉菌对应的标准曲线；

(3)坚果中所含曲霉属霉菌的检测：

将坚果样品预处理后，置于液体培养基培养，取培养基中的菌丝液氮破碎，将破碎后的组织，通过试剂盒法提取样品基因组，加入引物探针组合，配置25μL LAMP体系，设置LAMP程序进行扩增实验，通过检测坚果样品在反应结束后的荧光响应，结合对应的标准曲线计算出坚果中所含曲霉属霉菌基因组浓度。

本发明的其中一个实施例中，所述霉菌选自曲霉属霉菌、青霉属霉菌或镰刀菌属霉菌。

本发明的其中一个实施例中，所述曲霉属霉菌为黑曲霉、黄曲霉、集峰曲霉，所述青霉属霉菌为鲜绿青霉，所述镰刀菌属为尖孢镰孢。

本发明的其中一个实施例中，应用方法包括以下步骤：将所述引物探针、所述FITC@AuNCs和曲霉属霉菌的DNA模板混合进行LAMP反应，待反应结束取LAMP产物，并检测所述产物的荧光强度。

本发明的其中一个实施例中，LAMP反应还包括isothermal amplificationbuffer、dNTPs、DNA聚合酶和水。

本发明的其中一个实施例中，所述比率荧光生物传感器在检测坚果中曲霉属霉菌的应用。

本发明的其中一个实施例中，检测坚果中曲霉属霉菌的方法包括以下步骤：

S1：将含曲霉属霉菌的坚果加入灭菌水中振荡，取振荡后的溶液加入到培养基中培养，得到菌丝，通过菌丝提取样品基因组DNA；

S2：将S1所制备的样品基因组DNA与所述引物探针、FITC@AuNCs溶液进行LAMP反应，待反应结束取LAMP产物进行荧光检测。

本发明中不同于PCR的变性、退火和延伸所带来的温度变化要求，环介导等温扩增技术是一种高度灵敏的恒温核酸扩增技术。前期主要通过对靶标DNA链的六个区域设计一对外引物和一对内引物，在内引物设计区域之间还可设计一对环引物用于提高检测效率。向体系中加入靶标核酸、引物、Bst DNA聚合酶和dNTPs，在大约63℃下保持整个体系反应1h左右，通过链置换反应来完成核酸扩增过程。

本发明的机理：

本发明采用BSA保护的AuNCs作为参考信号，与FITC共轭形成的比率荧光探针FITC@AuNCs用于pH检测。此处，FITC作为pH的特异性识别元素，其荧光发射中心为517nm。当pH升高(OH

本发明的技术方案具有以下优点：

(1)本发明通过在NCBI的基因序列库中比对不同菌属基因序列，在保守位点处设计曲霉属通用LAMP引物，确保其具有检测坚果中常见曲霉属霉菌的通用性。

(2)本发明基于FITC@AuNCs的比率荧光值的变化进行定量检测，可以消除局部探针浓度和分布变化的不同所带来的影响，从而提高检测的准确性，其中比率荧光值指的是在488nm紫外激发光下，FITC在625nm处的荧光发射值与AuNCs在517nm处的荧光发射值的比值。

(3)本发明对坚果中曲霉属霉菌进行DNA提取、LAMP扩增，实现定性、定量分析，操作简便快速，整个检测过程可在数小时内完成。

(4)本发明检测条件温和，避免了普通PCR检测过程中升温降温所需的大型仪器，使操作更加便携。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为本发明实施例1中AuNCs和FITC@AuNCs的表征图；其中图1(a)和1(b)分别为AuNCs和FITC@AuNCs的TEM图；图1(c)为AuNCs和FITC@AuNCs的XRD图；图1(d)为AuNCs和FITC@AuNCs的FT-IR图；图1(e)为AuNCs和FITC@AuNCs的紫外-可见吸收光谱图；图1(f)为AuNCs和FITC@AuNCs的荧光光谱图；

图2为本发明实施例2中28S rRNA基因序列Blast比对结果；

图3为本发明实施例2中28S rRNA基因序列及其引物位置与方向；

图4为本发明实施例2中LAMP引物特异性验证及灵敏度检测；

图5为本发明实施例3中LAMP的表征图；其中5(a)为LAMP反应温度优化的表征图：M：10kbp DNAMarker；泳道1-6：55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃；N：阴性对照；5(b)为LAMP反应时间优化的表征图：M：10kbp DNAMarker；泳道1-6：45min、50min、55min、60min、65min、70min；N：阴性对照；

图6为本发明实施例3中LAMP引物可行性验证；

图7为本发明实施例3中FITC@AuNCs-LAMP灵敏度检测及标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中，引物是由上海生工生物工程技术服务有限公司合成：

上游外引物的核苷酸序列为(如SEQ ID No.1所示)：

5’-GCAGAGGGTACTTTGGGT-3’

下游外引物的核苷酸序列为(如SEQ ID No.2所示)：

5’-CTCTACTTGTGGCGTATCGG-3’

上游内引物的核苷酸序列为(如SEQ ID No.3所示)：

5’-CTTTACACGGGCACGGACACCTAATCGTGCCCTGGAACGG-3’

下游内引物的核苷酸序列为(如SEQ ID No.4所示)：

5’-TCGACGAGTCGAGTTGGGGTTTTCTCCGGCCAGTATTTAGC-3’

上游环引物的核苷酸序列为(如SEQ ID No.5所示)：

5’-CCAAGACGTAGGTCTCACC-3’

下游环引物的核苷酸序列为(如SEQ ID No.6所示)：

5’-AATGCAGCAAATCTTGGGTGG-3’

本发明所用的曲霉属、青霉属及镰刀菌属具体为黑曲霉(Aspergillus nigerCICC 2487)、黄曲霉(Aspergillus flavus CICC 2219)、鲜绿青霉(Penicilliumviridicatum CICC 4029)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum CICC 41029)均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，集峰曲霉(Aspergillus nomius ACCC 32558)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。

实施例1FITC@AuNCs的合成及表征

金纳米簇(AuNCs)：在37℃下将10mL的HAuCl

FITC@AuNCs：将1mg/mL的FITC的乙醇溶液加入溶于用PBS缓冲液(pH＝7.4)复溶的AuNCs中，室温暗搅拌12h，随后用0.05mol/L的PBS缓冲液(pH＝7.4)透析8h，得到产物FITC@AuNCs，储存于4℃冰箱。

通过FT-IR和UV-Vis光谱等表征验证FITC和AuNCs的成功连接。其中图1(a)和1(b)分别为AuNCs和FITC@AuNCs的TEM图。由图1(a)和1(b)可见，所制备的AuNCs为单分散体系，平均粒径为5nm左右，同时在与FITC结合后，其分散性基本没有发生变化。

图1(c)为AuNCs和FITC@AuNCs的XRD图。由图1(c)可见，AuNCs位于38.69°的特征衍射峰(111)与Au标准立方相(标准卡PDF#04-0784)很好地对应。当与FITC结合后，该衍射峰位移至32.19°，这可能与Au的晶格增加有关。

图1(d)为AuNCs和FITC@AuNCs的FT-IR图。由图1(d)可见，当FITC共轭在AuNCs的表面后，峰值出现在1662cm

图1(e)为AuNCs和FITC@AuNCs的紫外-可见吸收光谱图。由图1(e)可见，BSA在280nm处有一紫外吸收峰，当它合成BSA-AuNCs时，在280nm处的吸收峰降低。此外，FITC@AuNCs在280nm左右处吸收峰也表明与BSA的结合。

图1(f)为AuNCs和FITC@AuNCs的荧光光谱图。由图1(f)可见，在488nm激发光的激发下，观察到AuNCs的荧光发射集中在640nm处，溶液颜色呈亮红色(见图1(a)插图)。当与FITC结合后，溶液颜色由橙黄色变为黄绿色。在同波长的激发光下，其激发发射峰位移到630nm处，溶液颜色呈橙色(见图1(b)插图)。同时，FITC的发射峰从520nm移动到521nm，这表明FITC和AuNCs的成功共轭。

实施例2引物的设计和验证

(1)采用试剂盒法提取供试菌株基因组DNA

取活化的黑曲霉、集峰曲霉、鲜绿青霉和尖孢镰孢于马铃薯液体培养基中25℃，180r/min振荡培养40h，黄曲霉于麦芽汁液体培养基中28℃，180r/min振荡培养40h，取液体培养基中的菌丝球通过试剂盒提取真菌基因组(此处试剂盒为Biospin真菌基因组提取试剂盒购于杭州博日科技股份有限公司)。具体操作如下：

a：研钵、钵杵和药匙事先灭菌，试验台进行75％酒精擦拭。取部分液氮倒入研钵中，让研钵和钵杵进行预冷。随后将液体培养基中悬浮的黄曲霉菌丝球取出倒入研钵中，将真菌组织捣碎研磨至粉末，过程中不断加入液氮防止液氮完全汽化；

b：在1.5mL离心管中加入少量研磨后的真菌组织；冰浴条件下加入400μLLEBuffer和4μL的20mg/mL RNaseA，并混合均匀；

c：将离心管置于65℃水浴锅中恒温30min，期间每隔10min涡旋离心管，使溶液振荡均匀；

d：在离心管中加入130μL DABuffer，涡旋混合均匀后在冰浴条件下放置5min，15000r/min离心3min后，用移液枪吸取上清液加入到一个新的1.5mL离心管中；

e：在离心管中加入750μL的E Binding Buffer，涡旋混合均匀，将混合液体分两次转移到核酸纯化柱中，在10400r/min离心1min后，弃去接液管中液体；

f：依次向核酸纯化柱中加入500μL的G Binding Buffer、600μL的Wash Buffer、600μL的Wash Buffer，每次加入后13400r/min离心30s，并弃去接液管中液体；

g：将核酸纯化柱于13400r/min离心1min后弃去接液管，并将核酸纯化柱转移至一个新的1.5mL离心管；

h：加入150μL左右的ElutionBuffer到核酸纯化柱中，在约23℃下孵育1min；

i：将核酸纯化柱于14700r/min离心1min后保留离心管，离心管中为所提取的黄曲霉基因组DNA，于-20℃保存；同理得到黑曲霉、集峰曲霉、鲜绿青霉及尖孢镰孢菌的基因组DNA，于-20℃保存，以提取的全基因组为模板，Nanodrop测定提取DNA的浓度及纯度。

(2)引物和探针的设计

从NCBI数据库下载坚果中常见的Aspergillus flavus、Aspergillus niger、Aspergillus nomius等霉菌基因序列，利用DNAMAN V6软件对6种曲霉属霉菌(GenBank：NG_069611.1、NG_055742、NG_055744.1、D84354.2、AB008418.1和NG_069608.1)的28S rRNA序列进行比对，对其高度相似部分进行Blast分析确认其具有曲霉属检测的特异性，分析结果如图2所示，28S rRNA序列对曲霉属检测具有良好的特异性，可用于LAMP引物设计。将筛选出来的基因片段以FASTA格式导入到NEB LAMP Primer Design，自动生成3套LAMP引物对，通过Blast分析引物特异性以及NUPACK验证引物间错配，最终确定发明用引物对(F3、B3、FIP和BIP)，随后将引物序列导入到Primer Explorer V5，确定2对环引物(LF和LB)。其中各个引物在靶序列中的位置如图3所示。

F3：上游外引物的核苷酸序列为(如SEQ ID No.1所示)：

5’-GCAGAGGGTACTTTGGGT-3’

B3：下游外引物的核苷酸序列(SEQ ID No.2)为：

5’-CTCTACTTGTGGCGTATCGG-3’

FIP：上游内引物的核苷酸序列(SEQ ID No.3)为：

5’-CTTTACACGGGCACGGACACCTAATCGTGCCCTGGAACGG-3’

BIP：下游内引物的核苷酸序列(SEQ ID No.4)为：

5’-TCGACGAGTCGAGTTGGGGTTTTCTCCGGCCAGTATTTAGC-3’。

LF：上游环引物的核苷酸序列为(如SEQ ID No.5所示)：

5’-CCAAGACGTAGGTCTCACC-3’

LB：下游环引物的核苷酸序列为(如SEQ ID No.6所示)：

5’-AATGCAGCAAATCTTGGGTGG-3’

(3)引物的特异性验证

LAMP反应体系25μL，包括8μL 2×isothermal amplificationbuffer，1.25μLdNTPs，1μLBst 2.0DNA聚合酶(上海生工生物工程技术服务有限公司)，外引物和内引物各0.6μL，环引物各0.3μL，实施例2步骤(1)提取的曲霉属、青霉属及镰刀菌属的DNA模板1.25μL，3.5μLFITC@AuNCs，3.5μL无菌超纯水。扩增程序为：63℃恒温55min；80℃灭酶5min。将2.5μL LAMP产物用1％琼脂糖凝胶电泳，经GelRed染色后于紫外灯下根据条带大小判定结果。如果能特异性扩增出阶梯型长度产物，即可判断设计引物可用于相应菌属检测。

通过针对曲霉属、青霉属和镰刀菌属的5种菌进行LAMP检测，检测结果如图4所示，3种曲霉属提取目的基因所在的泳道1’-3’均跑出LAMP连续阶梯条带，青霉属和镰刀菌属DNA所在的泳道4’和5’未跑出条带。验证所设计的LAMP引物可用于后续定量检测。

本发明设计的引物的核苷酸序列如下：

上游外引物的核苷酸序列(SEQ ID No.1)为：

5’-GCAGAGGGTACTTTGGGT-3’

下游外引物的核苷酸序列(SEQ ID No.2)为：

5’-CTCTACTTGTGGCGTATCGG-3’

上游内引物的核苷酸序列(SEQ ID No.3)为：

5’-CTTTACACGGGCACGGACACCTAATCGTGCCCTGGAACGG-3’

下游内引物的核苷酸序列(SEQ ID No.4)为：

5’-TCGACGAGTCGAGTTGGGGTTTTCTCCGGCCAGTATTTAGC-3’

上游环引物的核苷酸序列(SEQ ID No.5)为：

5’-CCAAGACGTAGGTCTCACC-3’

下游环引物的核苷酸序列(SEQ ID No.6)为：

5’-AATGCAGCAAATCTTGGGTGG-3’。

实施例3FITC@AuNCs-LAMP灵敏度检测及标准曲线的建立

(1)提取基因组

按照实施例2步骤(1)所述的方法分别提取黑曲霉、黄曲霉、集峰曲霉、鲜绿青霉以及尖孢镰孢基因组，所得黑曲霉基因组的浓度为7.2ng/μL、黄曲霉浓度为7.2ng/μL、集峰曲霉基因组浓度为6.9ng/μL、鲜绿青霉基因组浓度为3.3ng/μL、尖孢镰孢菌基因组浓度为14ng/μL。

(2)FITC@AuNCs-LAMP反应条件优化

对FITC@AuNCs-LAMP反应进行扩增条件摸索，针对反应温度55℃-65℃，反应时间45min-70min进行电泳验证。结果如图5所示，55℃-65℃的反应温度下均有条带跑出，同时，在45min-70min时间范围内，各条带亮度相似，后续对该体系进行重复性验证，确定优化温度为63℃，优化反应时间为55min。

(3)FITC@AuNCs-LAMP反应可行性验证

具体操作：针对获得的LAMP产物，通过F97 pro荧光分析仪进行荧光值分析，荧光分析仪条件设置为：激发光488nm，发射光范围设置为500nm-700nm。比率荧光值指的是在488nm紫外激发光下。FITC在625nm处的荧光发射值与AuNCs在517nm处的荧光发射值的比值。结果见图6。

由图6可见，黑曲霉、黄曲霉和集峰曲霉标准菌株核酸的比率荧光值处在4.8左右，而阴性对照鲜绿青霉和尖孢镰孢的比率荧光值维持在5.8以上。从图6(a)可以看出，曲霉属霉菌在517nm处的绿色发射峰强度小于空白对照以及阴性对照，说明该方法可用于检测LAMP反应中的特异性识别。

(4)FITC@AuNCs-LAMP灵敏度检测及标准曲线的建立

将7.4ng/μL的黑曲霉DNA的浓度按10倍梯度稀释，设置7个浓度梯度，进行FITC@AuNCs-LAMP实验，分别测定7个浓度梯度下的比率荧光值，根据比率荧光值(FGreen/FRed)的大小绘制标准曲线，每个浓度进行三个平行实验。

实验结果如图7所示，在该比率生物传感器中，有机分子FITC作为测定pH的响应信号，而AuNCs由于在不同pH下具有良好的稳定性而作为参考信号。随着LAMP反应的进行，该体系溶液pH的下降，FITC的绿色荧光不同程度地下降，而AuNCs的红色荧光基本保持不变。黑曲霉基因组浓度在10

实施例4样品检测

(1)样品处理

取25g样品坚果，加入225mL灭菌水中，振荡10min，取200μL振荡后的溶液加入到100mL马铃薯液体培养基中，28℃培养40h。

(2)样品DNA提取

取步骤(1)马铃薯液体培养基中的菌丝，按照实施例2步骤(1)的方法提取样品基因组DNA。

(3)坚果样品FITC@AuNCs-LAMP体系建立及检测

LAMP反应体系25μL，包括8μL 2×isothermal amplificationbuffer，1.25μLdNTPs，1μL Bst 2.0DNA聚合酶(上海生工生物工程技术服务有限公司)，外引物和内引物各0.6μL，环引物0.3μL，实施例4步骤(2)提取的曲霉属、青霉属及镰刀菌属的混合DNA模板1.25μL，7μL

为了验证本方法的实际适用性，将本方法与传统的平板菌落计数法相比较。结果如表1所示，两种方法结果无显著性差异，说明本方法可用于实际样品检测，其结果可靠准确。

表1本方法与传统平板菌落计数法分析坚果样品的结果比较

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种基于金纳米簇的比率荧光生物传感器及其制备方法与其在检测曲霉属霉

菌中的应用

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 1

gcagagggta ctttgggt 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 2

ctctacttgt ggcgtatcgg 20

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 3

ctttacacgg gcacggacac ctaatcgtgc cctggaacgg 40

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 4

tcgacgagtc gagttggggt tttctccggc cagtatttag c 41

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 5

ccaagacgta ggtctcacc 19

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 6

aatgcagcaa atcttgggtg g 21