三肽以及代谢、心血管和炎性病症的治疗

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年8月10日提交的美国序列号62/717,546的优先权。上述申请的全部内容并入本文中。

背景技术

“非酒精性脂肪肝病(NAFLD)”在世界范围内越来越普遍，尤其是在西方国家。在美国，它是慢性肝病的最常见形式，影响估计8000万到1亿人。非酒精性脂肪肝病为影响很少喝酒或不喝酒的人的一系列肝脏疾患的概括性术语。顾名思义，非酒精性脂肪肝病的主要特征为肝细胞中储存了太多的脂肪。肝脏中含有一些脂肪是正常的。然而，如果超过5％-10％的肝脏重量是脂肪，那么这种情况称为脂肪肝(脂肪变性)。

NAFLD的更严重形式称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NASH使肝脏肿胀并受损。NASH倾向于在过重或肥胖或患有糖尿病、高胆固醇或高甘油三酯或炎性疾患的人中发展。NASH是疾病的一种潜在严重形式，标志为肝细胞气球样变和肝炎，这可进展为瘢痕形成和不可逆损害。

发明内容

本公开的第一方面提供了用于治疗炎症疾病、代谢疾病和/或心血管疾病的方法，所述方法包括向患有炎症疾病、代谢疾病和/或心血管疾病中的一者或多者的受试者施用治疗有效量的甘氨酸或含甘氨酸的三肽分子。在各个实施方案中，含甘氨酸的三肽分子可包括DT-109(Gly-Gly-Leu)和DT-110(Gly-Gly-dLeu)中的一者或多者。在各个实施方案中，代谢疾病是指一组确定的病症，其中发生代谢错误、代谢不平衡或代谢欠佳。如本文所描述的代谢疾病还包括可通过调节代谢来治疗的疾病，不过疾病本身可能是或可能不是由特定代谢缺陷引起。此类代谢疾病可涉及例如葡萄糖和脂肪酸氧化路径。如本文所用，“代谢病症”或“代谢疾病”是指以代谢功能改变或紊乱为特征的疾患。“代谢性”和“代谢”为本领域中熟知的术语并且通常包括活有机体内发生的整个系列的生物化学过程。代谢和心血管疾病包括但不限于肥胖症、糖尿病、动脉粥样硬化、代谢综合征、血脂异常、冠心病、冠状动脉疾病、动脉硬化、动脉粥样化血栓性中风、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、高脂肪酸血症(hyperfattyacidemia)或代谢综合征或它们的组合。血脂异常可为高脂血症。高脂血症可为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或高胆固醇血症与高甘油三酯血症两者。NAFLD可为肝性脂肪变性或脂肪性肝炎。糖尿病可为2型糖尿病或2型糖尿病伴血脂异常。在各个实施方案中，本文所呈现的方法适用于与身体、循环或各种器官(例如肝脏)内的葡萄糖调控异常和/或脂质累积有关的代谢疾病，以及由其产生的病理后遗症，例如(非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、高血糖症、糖尿病前期、糖尿病(I型和II型)、肥胖症、胰岛素抗性、代谢综合征以及糖尿病性血脂异常。

代谢疾病、病症或疾患可以许多物理症状为特征。可使用本文所描述的甘氨酸三肽分子和方法来预防、治疗、改善或以其他方式调节本领域技术人员已知的与代谢疾病、病症或疾患有关的任何症状。在某些实施方案中，症状可为但不限于以下中的任一者：尿液产生过量(多尿)、过度口渴和流体摄入增加(烦渴)、视觉模糊、原因不明的体重减轻以及昏睡。

在某些实施方案中，炎性疾病、病症或疾患包括但不限于主动脉瓣狭窄、冠状动脉疾病(CAD)、阿茨海默氏病(Alzheimer's Disease)以及血栓栓塞性疾病、病症或疾患。某些血栓栓塞性疾病、病症或疾患包括但不限于中风、血栓形成、心肌梗塞以及周围性血管疾病。

在某些实施方案中，使用本文所描述的甘氨酸或甘氨酸三肽分子调节炎性疾病、病症或疾患的生理标记物或表型。举例来说，与未治疗的动物相比，向动物施用所述化合物可降低所述动物中的炎性细胞因子或其他炎性标记物水平。在某些实施方案中，调节生理标记物或表型可与用由化合物抑制肝脏DAG、降低葡萄糖以及降低血浆LDL水平相关。

在某些实施方案中，炎性疾病、病症或疾患的生理标记物可为可定量的。举例来说，可通过本领域中已知的标准测试来测量和定量细胞因子水平。对于此类标记物，在某些实施方案中，可使标记物降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，或这些值中的任何两个所界定的范围。

另外，本文提供了用于预防、治疗或改善有需要的受试者中与炎性疾病、病症或疾患相关的症状的方法。在某些实施方案中，提供了一种降低与炎性疾病、病症或疾患相关的症状的发作率的方法。在某些实施方案中，提供了一种用于降低与炎性疾病、病症或疾患相关的症状的严重程度的方法。在此类实施方案中，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的甘氨酸或甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐。

某些实施方案提供了用于预防、治疗、延迟、减慢有需要的受试者的代谢、心血管以及炎性疾病(特别是那些涉及胆固醇、甘油三酯和葡萄糖异常相关的疾病、病症以及疾患的病症)的进展和/或使其改善的组合物和方法。某些实施方案提供了用于预防、治疗、延迟、减慢有需要的受试者的甘油三酯和总胆固醇相关疾病、病症以及疾患的进展和/或使其改善的组合物和方法。在某些实施方案中，此类疾病、病症以及疾患包括炎性、心血管和/或代谢疾病、病症以及疾患。某些此类心血管疾病、病症或疾患包括但不限于主动脉瓣狭窄、动脉瘤(例如腹主动脉瘤)、心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、脑血管疾病、冠状动脉疾病、冠心病、血脂异常、高胆固醇血症、高脂血症、高血压、高甘油三酯血症、心肌梗塞、周围性血管疾病(例如周围性动脉疾病、周围性动脉阻塞病)、视网膜维管阻塞或中风。某些此类代谢疾病、病症或疾患包括但不限于高血糖症、糖尿病前期、糖尿病(I型和II型)、肥胖症、胰岛素抗性、代谢综合征以及糖尿病性血脂异常。某些此类炎性疾病、病症或疾患包括但不限于主动脉瓣狭窄、冠状动脉疾病(CAD)、阿茨海默氏病以及血栓栓塞性疾病、病症或疾患。某些血栓栓塞性疾病、病症或疾患包括但不限于中风、血栓形成(例如静脉血栓栓塞)、心肌梗塞以及周围性血管疾病。某些实施方案提供了特别是在与肝病相关时，除预防、治疗、延迟、减慢葡萄糖敏感性以及全身炎症和纤维化的进展和/或使其改善之外，用于预防、治疗、延迟、减慢膳食诱发的高脂血症以及线粒体/过氧化物酶体脂肪酸β氧化(FAO)受阻情况下的脂肪性肝炎的进展和/或使其改善的组合物和方法。

本公开的第一方面的一个实施方案提供了用于治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的方法，所述方法包括施用甘氨酸或DT-109(Gly-Gly-Leu)。本公开的第一方面的另一实施方案提供了用于治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，所述方法包括施用甘氨酸或DT-109(Gly-Gly-Leu)。本公开的第一方面的另一实施方案提供了用于治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的方法，所述方法包括施用DT-110(Gly-Gly-dLeu)。本公开的第一方面的一个实施方案提供了用于治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，所述方法包括施用甘氨酸或DT-110(Gly-Gly-dLeu)。任选可将这些三肽与如本文所描述的第二治疗剂组合施用。

本公开的第二方面提供了用于减轻患者中的纤维化的方法，所述方法包括施用所选的三肽或其药学上可接受的盐。本公开的第二方面的一个实施方案提供了用于减轻患者中的纤维化的方法，所述方法包括施用甘氨酸或DT-109(Gly-Gly-Leu)。本公开的第二方面的另一实施方案提供了用于减轻患者中的纤维化的方法，所述方法包括施用甘氨酸或DT-110(Gly-Gly-dLeu)。这些三肽任选可与他汀类(statin)组合施用。

本公开的第三方面提供了治疗肝性脂肪变性的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用一种或多种三肽分子或其药学上可接受的盐。在第三方面的一个实施方案中，所述方法使肝脏脂质中的甘油三酯水平降低或使肝脏脂质中的总胆固醇水平降低。

本公开的第四方面提供了一种用于治疗患有NAFLD或患有NASH的受试者的药盒，所述药盒包括所选的三肽、任选的他汀以及使用说明书。在药盒的一个实施方案中，药盒包括有效量的甘氨酸或DT-109(Gly-Gly-Leu)、任选的他汀以及使用说明书。在另一实施方案中，药盒包括甘氨酸或(DT-110(Gly-Gly-dLeu)、任选的他汀以及使用说明书。在另一药盒中，药盒包括甘氨酸或DT-109(Gly-Gly-Leu)和/或(DT-110(Gly-Gly-dLeu)、任选的他汀以及使用说明书。

附图说明

图1A至图1F：实验设计(图1A)，整个研究中的平均食物摄入量(图2B)，终点体重(图1C)，终点时相较于基线的总体重增加(图1D)(图1B至图1D中n＝8-10)，终点处腹膜腔的总体形态学(图1E)，血浆含甘氨酸的三肽分子水平(图1F)(n＝6-8)。*p＜0.05；**p＜0.01，相较于WD+H

图2A至图2E：急性OGTT(为小鼠加载葡萄糖与治疗或作为对照的水)(图2A)，慢性OGTT(单独为小鼠加载葡萄糖)(图2B)，用水或用治疗进行口服灌胃之前(灌胃前)和30min之后(灌胃后)测量的非空腹血糖水平(图2C)，终点血糖水平(6小时空腹后)(图2D)。调控葡萄糖摄入和糖异生的肝基因表达的qPCR分析(图2E)。(n＝8-10)*p＜0.05；**p＜0.01，***p＜0.001，相较于WD+H

图3A至图3C：肝组织的代表性H&E载玻片(图3A)，小泡性和大泡性脂肪变性分别用红色和黄色箭头标记。提取肝脂质，随后对(图3B)TG和(图3C)TC含量进行定量，**p＜0.01，***p＜0.001，相较于WD+H

图4A至图4E：调控脂质氧化路径的肝基因表达的qPCR分析(图4A和图4B)，调控胆固醇稳态的肝基因表达的qPCR分析(图4C)(n＝7-10)。蛋白质印迹分析和针对β-肌动蛋白规范化的ABCG8丰度的定量(图4D和图4E)(n＝4-6)。*p＜0.05；**p＜0.01，***p＜0.001，相较于WD+H

图5A至图5G：基线处(在无治疗情况下饲喂WD 1周)和终点处(在治疗或水对照情况下饲喂WD 12周之后)的血浆TC水平(图5A)。(图5B)TC、(图5C)LDL、(图5D)HDL以及(图5E)TG的终点血浆水平。在6小时空腹之后进行血液收集。(图5F)通过油红(Oil Red)O染色目视观察的动脉粥样硬化斑块的分析，以及(图5G)染色的主动脉的代表图。(n＝6-10)。*p＜0.05；**p＜0.01，***p＜0.001，相较于WD+H

图6A至图6E：IL-6(图6A)、抵抗素(图6B)以及MCP1(图6C)的终点血浆水平。(图6D)附睾脂肪组织(EAT)中以及(图6E)皮下脂肪组织(SAT)中的炎性细胞因子的qPCR分析。(n＝6-10)。*p＜0.05；**p＜0.01，***p＜0.001，相较于WD+H

图7A至图7C：肝脏中的炎性细胞因子的qPCR分析(图7A)。肝脏中的代表性F4/80免疫组织化学(图7B)，以及定量(图7C)。(n＝7-10)。*p＜0.05，相较于WD+H

图8.饲喂NASH-膳食的AGXT1

图8F至图8K.在饲喂CD情况下，AGXT1

图9A至图9K.基于甘氨酸的化合物。选择在结构上类似于甘氨酸的化合物来评估对甘氨酸骨架的结构、构象、电子以及等排修饰。(图9A)甘氨酸，(图9B)N-甲基甘氨酸，(图9C)N，N--二甲基甘氨酸，(图9D)N，N，N-三甲基甘氨酸，(图9E)乙醇酸，(图9F)甘氨酰胺，(图9G)2-氨基-N-甲基乙酰胺，(图9H)乙醇胺，(图9I)2-氧代哌嗪，(图9J)吗啉-2-酮，以及(图9K)(1H-四唑-5-基)甲胺。

图10A至图10I、图10K至图10N.NAFLD中受损的甘氨酸生物合成。为C57BL/6J小鼠饲喂CD或WD持续12周(n＝4-5)：(图10A)血浆TC，(图10B)肝脏组织学(比例尺：H&E 50μm，ORO 100μm)，(图10C)肝脏TG，(图10D)肝脏TC，(图10E)相对于CD的血浆AA，(图10F)相对于GAPDH的甘氨酸生物合成基因的肝表达。(图10G)细胞TG，以及(图10H)加载200μM PA或乙醇持续24h的HepG2细胞中的AGXT1表达(n＝3-4)。为C57BL/6J小鼠饲喂NASH-膳食或CD持续24周(n＝10)：(图10I)肝脏形态，H&E和天狼星红(Sirius Red)组织学(比例尺：50μm)。(图10K)根据来自CD或NASH小鼠的肝脏的RNA-测序，甘氨酸生物合成基因/路径显著下调(绿色)(n＝3，log2FC，log2倍数变化)。(图10L)患有膳食诱发的NASH的小鼠中相对于GAPDH的AGXT1表达(n＝8)。(图10M)根据来自健康和NASH患者的肝脏微阵列数据的荟萃分析，甘氨酸代谢基因显著下调(绿色)或上调(红色)。(图10N)来自移植供体的肝脏中的AGXT1表达与总肝脂肪之间的相关性(n＝206)。数据为平均值±SD，显示所有点和P值。

图10J.来自患有NASH的小鼠的肝脏的路径分析。来自饲喂CD或NASH-膳食持续24周的小鼠的肝脏的RNA-测序后的路径分析(n＝3)。富含上调的差异表达基因(DEG)的路径以红色绘制，而富含下调的DEG的路径以绿色绘制。

图11A至图11L.AGXT1

图11C、图11D、图11I.饲喂NASH-膳食的AGXT1

图12A至图12J.甘氨酸缺乏加重WD诱发的肥胖症。为ApoE

图13A至图13K.甘氨酸缺乏加重WD诱发的高脂血症和HS。为ApoE

图14A至图14G.基于甘氨酸的化合物对葡萄糖耐受性的影响。在12h空腹之后在C57BL/6J小鼠中进行OGTT(n＝6-8)。小鼠接受口服单独葡萄糖(每克体重2mg)、葡萄糖与每克体重0.5mg的甘氨酸或与每克体重0.5mg的基于甘氨酸的化合物：(图14A)N-甲基甘氨酸，(图14B)N，N-二甲基甘氨酸，(图14C)N，N，N-三甲基甘氨酸，(图14D)乙醇酸，(图14E)DT-110，以及(图14F)DT-109。(图14G)小鼠接受口服单独葡萄糖(每克体重2mg)、葡萄糖与DT-109(每克体重0.5mg)或等效水平的游离亮氨酸或甘氨酸(分别每克体重0.17或0.33mg)。数据为平均值±SE。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，相较于葡萄糖；

图15A至图15L.DT-109的降脂质作用。(图15A)为ApoE

图16A至图16D.甘氨酸或DT-109预防WD诱发的HS。终点肝脏分析(n＝8-10)：(图16A)腹膜腔的总体外观以及使用H&E和ORO的组织学(比例尺：H&E为50μm，ORO为100μm)，(图16B)肝脏TG，以及(图16C)肝脏TC。数据为平均值±SD，显示所有点和P值。(图16D)相对于GAPDH调控FAO和炎症的关键基因的qPCR分析。数据为平均值±SE。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，相较于WD+H

图17B至图17H.随机化至实验组之前NASH的确认。为C57BL/6J小鼠饲喂CD(n＝11)或NASH-膳食(n＝50)持续12周。(图17B)从下颌下静脉收集空腹血液用于血浆葡萄糖、TC、AST以及ALT的分析(数据为平均值±SD)。将小鼠的子集(CD：n＝3，NASH-膳食n＝5)处死以确认肝脏病变：(图17C)肝脏重量-体重比(LW/BW)。(图17D)腹膜腔的总体外观以及使用H&E、ORO以及天狼星红的组织学(比例尺：H&E和天狼星红为50μm，ORO为100μm)，(图17E)作为(图17F)脂肪变性、肝细胞气球样变以及小叶炎症得分的总和的NAS。数据为平均值±SD，显示所有点和P值。(图17G)在第18周时，在12h空腹之后进行OGTT(n＝8-9)。小鼠接受口服单独葡萄糖(每克体重2mg)、葡萄糖与每克体重0.5mg的DT-109或等效水平的游离亮氨酸(每克体重0.17mg)、甘氨酸(每克体重0.33mg)或H

图17L至图17R.在患有已确定的NASH的C57BL/6J小鼠中DT-109的新陈代谢效应。为C57BL/6J小鼠饲喂CD或NASH-膳食持续12周。在NASH确认之后，将小鼠随机化以在NASH-膳食情况下经由口服灌胃接受每天每克体重0.125或0.5mg DT-109或等效水平的亮氨酸或甘氨酸(每天每克体重0.17或0.33mg)或H

图17A、图17I、图17J、图17K以及图18A至图18G、图18I.DT-109防止膳食诱发的NASH。(图17A)为C57BL/6J小鼠饲喂CD或NASH-膳食持续12周。在NASH确认之后，将小鼠随机化以在NASH-膳食情况下经由口服灌胃接受每天每克0.125或0.5mg的DT-109或其等效水平的亮氨酸、甘氨酸(每天每克0.17，0.33mg)或H

图18H、图18J至图18M以及图20H至图20J.DT-109防止膳食诱发的NASH。为C57BL/6J小鼠饲喂CD或NASH-膳食持续12周。在NASH确认之后，将小鼠随机化以在NASH-膳食情况下经由口服灌胃接受每天每克体重0.125或0.5mg DT-109或等效水平的亮氨酸或甘氨酸(每天每克体重0.17或0.33mg)或H

图19A、图19B、图19F至图19I、图19K、图19L、图19N.基于甘氨酸的治疗校正NASH-膳食诱发的受损的FAO并且减轻HS。终点处所收集的肝脏的RNA-测序(n＝4)：(图19A)PCA，(图19B)与CD相比各组中DEG的火山图(绿色：下调；红色：上调)，(图19F)比较NASH+H

图19C.DT-109逆转NASH-膳食诱发的转录组改变。如通过与CD组相比的log2倍数变化所测定的所有实验组中的头50种DEG的基于热图的图示。每行表示一种基因，并且每列表示与CD组的一种比较(n＝4)。

图19D、图19E、图19J、图19M.来自饲喂CD与NASH-膳食的小鼠的肝脏的路径分析。(图19D)富含上调DEG的路径以红色绘制，而富含下调DEG的路径以绿色绘制。(图19E)通过来自CD或NASH小鼠的肝脏的RNA-测序以及路径分析所分析的甘氨酸生物合成基因/路径的变化(n＝4)。显著下调的基因/路径以绿色突出显示(log2FC、log2倍数变化)。(图19J)FAO相关DEG的qPCR验证(n＝8-9)。数据为平均值±SE。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，相较于CD；

图20A至图20F、图20K、图20L.基于甘氨酸的治疗使NASH-膳食诱发的肝炎和纤维化减轻。(图20A)F4/80免疫组织化学和天狼星红组织学(比例尺：50μm)，(图20B)F4/80阳性面积，(图20C)血浆MCP-1，以及(图20D)抵抗素。数据为平均值±SD，显示所有点和P值(n＝6-9)。(图20E)炎症相关DEG的qPCR验证(数据为平均值±SE，n＝8-9)。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，相较于CD；

具体实施方式

如本文所用：“脂肪变性”可与“脂肪肝”互换，脂肪肝为脂肪在肝脏中累积。

受试者可为哺乳动物，并且哺乳动物可为例如实验室动物或人，并且人受试者包括成人、青年以及儿科受试者。

“脂肪变性”和“肝性脂肪变性”在本文中可互换使用。

“血浆(Blood plasma)”和“血浆(plasma)”在本文中可互换使用。

“血液”和“血浆”在本文中可互换使用。

西方膳食在本文中缩写为“WD”。

面部静脉在本文中缩写为“FV”。

“TG”为甘油三酯的缩写。

“TC”为总胆固醇的缩写。

OGTT”为口服葡萄糖耐受性测试的缩写。

除非上下文另外明确指示，否则如本文所用，单数形式“一个”、“一种”以及“所述”包括复数参考物。

“或”在一些情况下可意指“与……组合”，因此施用A或B，可为施用A、施用B或施用A和B。

除甘氨酸外，常见氨基酸全部含有至少一个手性碳原子。因此，这些氨基酸以多对指定为L-异构体和D-异构体的立体异构体的形式存在。大多数天然存在的蛋白质和肽排他地由L-异构形式组成。D-异构氨基酸可影响肽或蛋白质的构象并且可产生增加的稳定性或活性变化。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在确切医学判断范围内适合于与人和低等动物的组织接触而没有过分毒性、刺激、过敏反应等并且符合合理效益/风险比的那些盐。“药学上可接受的盐”意指本发明化合物的在向接受者施用后能够直接或间接提供本发明化合物的任何无毒盐或其酯的盐。药学上可接受的盐为本领域中熟知的。举例来说，Berge等在J.Pharmaceutical Sciences,66:1-19(1977)中详细描述了药学上可接受的盐。

适合于递送本发明的肽的药物组合物以及其制备方法将为本领域技术人员轻易显而易知的。在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,The Science and Practiceof Pharmacy,第20版,Lippincott Williams&White,Baltimore,Md.(2000)中可找到此类组合物和其制备方法。可对本发明的肽进行配制以进行立即释放和/或改良释放。

术语“治疗”(或所述词语的其他形式，诸如“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”)在本文中用于指本发明的组合物的施用缓解患者的疾患和/或减轻、抑制或消除与疾患相关的特定特征或事件。因此，术语“治疗”包括预防患者的疾患发生，特别是当患者容易罹患所述疾患时；减轻或抑制疾患；和/或改善或逆转疾患。在本发明方法是针对预防疾患的范围内，应了解术语“预防”不要求疾患完全被阻止。相反地，如本文所用，术语预防是指熟练技工确定易患疾患的群体，使得可在发生疾患发作之前进行本发明组合物的施用的能力。所述术语不暗示必须完全避免所述疾患。

如本文所用的“有效量”是指本发明的含甘氨酸三肽足以展现可检测的治疗作用的量。通过例如临床疾患的改善或并发症的预防、减轻或改善来检测所述效应。用于患者的精确有效量将取决于患者的体重、体型以及健康；疾患的性质和程度；以及选择用于施用的治疗剂或治疗剂组合。通过在临床医师的技术和判断范围内的常规实验来测定用于给定情况的治疗有效量。

如本文所用，“确定”或“选择患有代谢和/或心血管和/或炎性疾病的受试者”意味着确定或选择倾向于患有或已被诊断为患有代谢疾病、心血管疾病、全身或局部炎性疾病；或代谢综合征的受试者；或者，确定或选择具有包括但不限于高胆固醇血症、高血糖症、高脂血症、高甘油三酯血症、高血压增加的胰岛素抗性、降低的胰岛素敏感性、超常体重和/或超常体脂含量或它们的任何组合的代谢疾病、心血管疾病或代谢综合征的任何症状的受试者。此类鉴定可通过任何方法来实现，包括但不限于标准临床测试或评估，诸如测量血清或循环(血浆)胆固醇、测量血清或循环(血浆)血糖、测量血清或循环(血浆)甘油三酯、测量促炎性细胞因子或皮质醇、测量血压、测量体脂含量、测量体重等。

如本文所用，“葡萄糖”为由细胞用作能量来源和炎性中间物的单糖。“血浆葡萄糖”是指存在于血浆中的葡萄糖。

如本文所用，“高密度脂蛋白-C”或“HDL-C”意指与高密度脂蛋白粒子相关的胆固醇。典型地以mg/dL或nmol/L对血清(或血浆)中的HDL-C的浓度进行定量。“血清HDL-C”和“血浆HDL-C”分别意指血清和血浆中的HDL-C。

如本文所用，“HMG-CoA还原酶抑制剂”意指通过抑制HMG-CoA还原酶起作用的剂，诸如阿伐他汀(atorvastatin)、罗伐他汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)以及辛伐他汀(simvastatin)。

如本文所用，根据专家组报道的国家胆固醇教育规划(NCEP)成人高胆固醇治疗的检测、评估指南(参见Arch.Int.Med.(1988)148,36-39)，“高胆固醇血症”意指以胆固醇或循环(血浆)胆固醇、LDL-胆固醇以及VLDL-胆固醇升高为特征的疾患。

如本文所用，“高脂血症”或“高脂血”为以血清脂质或循环(血浆)脂质升高为特征的疾患。此疾患表现出异常高的脂肪浓度。循环血液中的脂质级分为胆固醇、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、乳糜微粒以及甘油三酯。高脂血症的弗雷德里克森分类(Fredricksonclassification)是基于如通过电泳或超离心所测量的TG和富含胆固醇的脂蛋白粒子的模式，并且常用于表征高脂血症的主要原因，诸如高甘油三酯血症(Fredrickson和Lee,Circulation,1965,31:321-327；Fredrickson等,New Eng J Med,1967,276(1):34-42)。

如本文所用，“高甘油三酯血症”意指以甘油三酯水平升高为特征的疾患。其病原学包括一级(即基因原因)和二级(其他潜在原因，诸如糖尿病、代谢综合征/胰岛素抗性、肥胖症、物理不活动性、吸烟、过量酒精以及膳食中碳水化合物含量极高)因素，或者，最常为两者的组合(Yuan等CMAJ,2007,176:1113-1120)。

在描述本发明组合物和方法之前，应了解本发明不限于所描述的特定过程、组合物或方法，因为这些可改变。还应了解，本说明书中所用的术语仅用于描述特定型式或实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅受随附权利要求书限制。本文提到的所有公布在它们支持本发明的程度上以全文引用的方式并入本文中。

本公开的发明人已研发对代谢、心血管和/或炎性疾病展现预防性或治疗性活性的甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐，所述疾病包括但不限于肥胖症、糖尿病、血脂异常、脂肪肝以及胰岛素抗性综合征。在某些实施方案中，代谢或心血管疾病包括但不限于肥胖症、糖尿病、动脉粥样硬化、血脂异常、冠心病、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、高脂肪酸血症或代谢综合征或它们的组合。血脂异常可为高脂血症。高脂血症可为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或高胆固醇血症与高甘油三酯血症两者。NAFLD可为肝性脂肪变性或脂肪性肝炎。糖尿病可为2型糖尿病或2型糖尿病伴血脂异常。

在各个实施方案中，DT-109含甘氨酸的三肽分子的氨基酸序列为Gly-Gly-Leu(SEQ ID NO：1)。DT-110含甘氨酸的三肽分子的氨基酸序列为Gly-Gly-dLeu(SEQ ID NO：2)。本发明的甘氨酸三肽分子还包括DT-109和DT-110的药学上可接受的盐。此类盐的实例包括金属盐、铵盐、有机碱情况下的盐、无机酸情况下的盐、有机酸酸情况下的盐、碱性或酸性氨基酸情况下的盐等。金属盐的优选实例包括碱金属盐，诸如钠盐、钾盐等；碱土金属盐，诸如钙盐、镁盐、钡盐等；铝盐等。有机碱情况下盐的优选实例包括三甲胺、三乙胺、吡啶、甲吡啶、2，6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己胺、双环己胺、N，N-二苯甲基乙二胺等情况下的盐。无机酸情况下的盐的优选实例包括盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等情况下的盐。有机酸情况下的盐的优选实例包括甲酸、乙酸、三氟乙酸、邻苯二甲酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等情况下的盐。在上述盐中，药学上可接受的盐为优选的。举例来说，当化合物具有酸性官能团时，诸如碱金属盐(例如钠盐、钾盐等)、碱土金属盐(例如钙盐、镁盐、钡盐等)等、铵盐等无机盐为优选的，并且当化合物具有碱性官能团时，例如无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等)情况下的盐，或有机酸(诸如乙酸、邻苯二甲酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、甲磺酸、对甲苯磺酸等)情况下的盐为优选的。

在各个实施方案中，甘氨酸三肽分子还可为合成的和/或作为其原始合成形式的前药施用。举例来说，甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐可呈前药形式。前药意指在活体中的生理条件下，归因于酶、胃酸等的反应的情况下转化为含甘氨酸的三肽分子的化合物，所述化合物为根据酶在氧化、还原、水解等情况下转化为含甘氨酸的三肽分子或其药学上可接受的盐的化合物；归因于胃酸通过水解等转化为含甘氨酸的三肽分子的化合物，等。

含甘氨酸的三肽分子或其药学上可接受的盐的前药的实例包括含甘氨酸的三肽分子的氨基发生了酰化、烷基化或磷酸化的化合物(例如含甘氨酸的三肽分子的氨基发生了二十烷酰化、丙氨酰化、戊基氨基羰基化、(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)甲氧基羰基化、四氢呋喃基化、吡咯烷基甲基化、新戊酰氧基甲基化或叔丁基化等的化合物)；含甘氨酸的三肽分子的羟基发生了酰化、烷基化、磷酸化或硼酸盐的化合物(例如含甘氨酸的三肽分子的羟基发生了乙酰化、棕榈酰化、丙酰化、新戊酰化、琥珀酰化、富马酰化、丙氨酰化或二甲基氨基甲基羰基化的化合物)；含甘氨酸的三肽分子的羧基发生了酯化或酰胺化的化合物(例如含甘氨酸的三肽分子的羧基发生了C1-6烷基酯化、苯基酯化、羧基甲基酯化、二甲氨基甲基酯化、特戊酰氧基甲基酯化、乙氧基羰基氧基乙基酯化、酞基酯化、(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基酯化、环己基氧基羰基乙基酯化或甲基酰胺化的化合物)等。其中，优选使用含甘氨酸的三肽分子的羧基用诸如甲基、乙基、叔丁基等C1-6烷基酯化的化合物。可通过本身已知的方法由含甘氨酸的三肽分子产生这些化合物。

含甘氨酸的三肽分子或其药学上可接受的盐的前药还可为在生理条件下转化成含甘氨酸的三肽分子的物质，诸如描述于IYAKUHIN no KAIHATSU(Development ofPharmaceuticals),第7卷,Design of Molecules,第163-198页,HIROKAWA SHOTEN出版(1990)中的那些物质。

例示性甘氨酸三肽分子为可根据本文描述并且本领域技术人员已知的肽合成法产生的三氨基酸聚合物。肽合成法可采用当前已知的方法，例如固相合成方法和液相合成方法。换句话说，根据所需序列，可通过能够构成甘氨酸三肽分子的部分肽或氨基酸、要合成的肽以及其余部分(其可由两个或更多个氨基酸构成)的重复缩合来产生本发明肽(例如甘氨酸三肽分子)或其药学上可接受的盐。当具有所需序列的产物具有保护基时，可通过消除保护基来产生本发明肽。要知晓的缩合方法和消除保护基的方法的实例包括以下(1)-(5)中所描述的方法。

(1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti:Peptide Synthesis,IntersciencePublishers,New York(1966)

(2)Schroeder和Luebke:The Peptide,Academic Press,New York(1965)

(3)Nobuo Izumiya等:Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken(Basics andexperiments of peptide synthesis),Maruzen Co.出版(1975)

(4)Haruaki Yajima和Shunpei Sakakibara:Seikagaku Jikken Koza(Biochemical Experiment)1,Tanpakushitsu no Kagaku(Chemistry of Proteins)IV,205(1977)

(5)Haruaki Yajima编:Zoku Iyakuhin no Kaihatsu(A sequel to Developmentof Pharmaceuticals),第14卷,Peptide Synthesis,Hirokawa Shoten出版。

可使用甘氨酸或如本文中所描述和例示的含甘氨酸的三肽分子或其药学上可接受的盐来预防和/或治疗有需要的受试者的一种或多种代谢、心血管以及炎性疾病。出于本公开的目的，“代谢疾病”是指广泛范围的内分泌系统的疾病和病症，包括例如胰岛素抗性、糖尿病、肥胖症、葡萄糖耐受性受损、高血液胆固醇、高血糖症、血脂异常和高脂血症以及肝病，例如NAFLD和NASH。如本文所描述的代谢疾病还包括可通过调节代谢来治疗的疾病，不过疾病本身可能是或可能不是由特定代谢缺陷引起。此类代谢疾病可涉及例如葡萄糖和脂肪酸氧化路径。

有需要的受试者为可经历代谢疾病和/或心血管疾病和/或全身炎性疾病或与这些疾病相关的一种或多种症状的哺乳动物，优选为人，或驯养哺乳动物或实验室哺乳动物。

在某些实施方案中，不希望受任何特定理论限制，相信向患有代谢疾病、心血管疾病以及慢性全身炎性疾病或与这些一般疾患中的任一者相关或相关联的症状的受试者施用甘氨酸或本发明的甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐使得脂质水平，包括甘油三酯水平、胆固醇水平、胰岛素抗性、葡萄糖水平或它们的组合降低。所述水平中的一者或多者可独立地降低5％、10％、20％、30％、35％或40％或更多。施用本发明的甘氨酸三肽分子或其其药学上可接受的盐可使得胰岛素敏感性或肝胰岛素敏感性得到改善。施用本发明的甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐可使得动脉粥样硬化斑块、肥胖、葡萄糖、脂质、葡萄糖抗性、胆固醇降低或胰岛素敏感性改善或它们的任何组合。

某些实施方案提供了甘氨酸或如本文所描述的甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐在制造用于治疗、改善、延迟或预防代谢疾病或心血管疾病中的一者或多者的药剂中的用途。

某些实施方案提供了一种用于治疗、预防或改善如本文所描述的代谢疾病或心血管疾病中的一者或多者的药盒，其中所述药盒包含：a)如本文所描述的甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐；以及任选b)如本文所描述的另一第二治疗剂或疗法。药盒可还包括用于使用药盒以使用甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐治疗、预防或改善代谢疾病或心血管疾病中的一者或多者的说明书或标签。

在本发明的一些实施方案中，甘氨酸或甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐具有有效的降葡萄糖/脂质效应。在患有确定的NASH的小鼠中，甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐(例如DT-109)能够减轻脂肪性肝炎、改善身体组成、降低循环脂质并且通过刺激FAO路径使肝酶和脂肪性肝炎正常或对其进行校正。已出人意料地证实了甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐通过抑制阻抑NF-κB和TGFα/SMAD路径降低或减轻小叶/全身炎症和肝纤维化。

如本文所用，术语“血脂异常”是指脂质异常的疾患，包括由异常脂蛋白代谢引起的高脂血症以及高胆固醇血症、高甘油三酯血症以及归因于血液中的脂肪水平增加的低HDL-胆醇血症。如本文所用，术语“脂肪肝”是指由于脂质代谢障碍脂肪在肝细胞中过分累积的疾患。它可能引起各种疾病，诸如心绞痛、心肌梗塞、中风、动脉硬化以及胰腺炎。如本文所用，术语“糖尿病”是指以胰岛素的相对或绝对缺乏为特征从而导致葡萄糖不耐受的慢性病。术语糖尿病包括所有种类的糖尿病，诸如1型糖尿病、2型糖尿病以及遗传糖尿病。1型糖尿病为胰岛素依赖性糖尿病，主要由β-细胞的破坏引起。2型糖尿病为非胰岛素依赖性糖尿病，由餐后胰岛素分泌不充分或胰岛素抗性引起。如本文所用，术语“胰岛素抗性”是指胰岛素对于降低血糖变得不太有效并且葡萄糖未由细胞有效消耗的生理情况。在高胰岛素抗性下，身体会产生过多的胰岛素，从而导致高血压或血脂异常以及心脏病、糖尿病等。具体地说，在2型糖尿病中，肌肉和脂肪组织未注意到胰岛素增加。如本文所用，术语“胰岛素抗性综合征”是指由胰岛素抗性引起的病症的组合，以细胞对胰岛素作用的抗性、高胰岛素血症、极低密度脂蛋白(VLDL)和甘油三酯增加、高密度脂蛋白(HDL)降低、高血压等为特征。它被认为是心血管疾病和2型糖尿病的危险因素(Reaven G M.,Diabetes,37:1595-607(1988))。另外，已知胰岛素抗性增加氧化压力并且与诸如高血压、糖尿病、吸烟等其他危险因素一起改变细胞中的信号转导系统，因此诱导炎性反应并且导致动脉粥样硬化(FreemanB A等,Lab.Invest.47:412-26(1982)；Kawamura M等,J.Clin.Invest.94:771-8(1994))。

如本文所用，术语“代谢疾病”是指涉及作为各种心血管疾病和2型糖尿病的危险因素的代谢障碍的一组疾病。它包括胰岛素抗性和与其相关的复杂并且多样的代谢病症。在1988年，Reaven提出胰岛素抗性为构成这些病症的基础的因素并且将一系列异常命名为胰岛素抗性综合征。然而，在1998年，世界卫生组织(WHO)引入术语代谢综合征或代谢疾病，因为通过胰岛素抗性不能解释症状的所有方面。

包含甘氨酸的三肽分子或其药学上可接受的盐作为活性剂的本公开组合物具有改善各种代谢疾病和/或其症状(例如肥胖症、糖尿病、高脂血、非酒精性脂肪肝、全身炎症和/或胰岛素抗性综合征)的倾向。本公开的组合物可以各种活性预防或治疗代谢疾病。

如本文所用，术语“高脂血症”是指由归因于脂质(诸如甘油三酯和胆固醇)代谢不良的较高水平的血液脂质引起的疾病。更具体地说，高脂血症的特征为血液中诸如甘油三酯、LDL胆固醇、磷脂以及游离脂肪酸的脂质的水平增加，包括高胆固醇血症和高甘油三酯血症。

根据一个优选实施方案，通过本发明治疗的胰岛素抗性综合征包含肥胖症、高血压、动脉粥样硬化、高脂血症、高胰岛素血症、非酒精性脂肪肝以及2型糖尿病。

根据一个优选实施方案，本发明的组合物使血脂、肝脏脂肪或内脏脂肪的水平降低。术语“肝脏”或“内脏”用于涵盖器官、组织以及细胞。

根据本发明，饲喂含有甘氨酸或本发明的甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐的膳食的受试者使肝脏重量显著减轻并且改善血液和肝组织中的甘油三酯的脂质浓度和总胆固醇，并且使总内脏脂肪重量显著减轻。

根据一个更优选实施方案，通过本发明减少的脂肪包含甘油三酯、胆固醇以及游离脂肪酸。

根据一个更优选实施方案，通过本发明减少的内脏脂肪包含附睾脂肪、肾周脂肪、肠系膜脂肪和/或腹膜后脂肪。

根据一个优选实施方案，本发明的组合物使ALT(丙氨酸转氨酶)或AST(天冬氨酸转氨酶)的活性降低。作为肝功能指示物的ALT和AST为在肝脏损伤后在血液中展现水平增加的酶。

“非酒精性脂肪肝病(NAFLD)”在世界范围内越来越普遍，尤其是在西方国家。在美国，它是慢性肝病的最常见形式，影响估计8000万到1亿人。非酒精性脂肪肝病为影响很少喝酒或不喝酒的人的一系列肝脏疾患的概括性术语。顾名思义，非酒精性脂肪肝病的主要特征为肝细胞中储存了太多的脂肪。肝脏中含有一些脂肪是正常的。然而，如果超过5％-10％的肝脏重量是脂肪，那么这种情况称为脂肪肝(脂肪变性)。

NAFLD与包括肥胖症、胰岛素抗性、2型糖尿病以及血脂异常的代谢综合征的特征强烈相关；它被视为此综合征的肝部表现。

儿科NAFLD当前为儿童中肝病的主要形式。研究已证实腹部肥胖和胰岛素抗性被认为是NAFLD发展的主要贡献者。因为肥胖症在全世界变得越来越普遍，所以同时NAFLD的发病率已增加。在儿科NAFLD中显示真实有效的仅有的治疗为减重。

NAFLD的更严重形式称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NASH使肝脏肿胀并受损。NASH倾向于在过重或肥胖或患有糖尿病、高胆固醇或高甘油三酯或炎性疾患的人中发展。NASH是疾病的一种潜在严重形式，标志为肝细胞气球样变和肝炎，这可进展为瘢痕形成和不可逆损害。此损害类似于由酗酒引起的损害。宏观和微观来看，NASH的特征为小叶和/或门管区炎症、不同程度的纤维化、肝细胞死亡以及病理性血管生成。在最严重情况下，NASH可进展为肝硬化、肝细胞癌以及肝衰竭。当前例如通过膳食、处理胰岛素抗性或维生素施用(诸如维生素E或D)来治疗NAFLD和NASH。

可根据Kleiner(Kleiner DE.等,Hepatology,2005；41:1313)的准则计算NAFLD活性得分(NAS)。NAS得分0-2不被视为诊断为NASH，3-4的NAS得分被视为不诊断为NASH、NASH边缘或NASH阳性，而5-8的NAS得分很大程度上被视为诊断为NASH。对NASH的治疗效果包括消退、稳定化或疾病进展速率降低。可使用可能患有NASH的患者的依序肝脏活组织切片来评估NAS得分的变化并且用作疾病状态变化的指示。得分增加表明进展，得分不变表明稳定化，而得分降低表明NASH消退。在对照临床试验中，通常历经6个月至两年的持续时间评估安慰剂与测试物品治疗组之间的NAS得分差异可指示治疗效果，即使两组均发生进展。监管机构通常要求规定的点扩散以展示有意义的NASH变化。

本发明还提供了一种用于治疗肝性脂肪变性的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用一种或多种三肽分子或其药学上可接受的盐，其中肝性脂肪变性得到治疗。在一个实施方案中，三肽分子使肝脂质中的甘油三酯水平降低，而对亮氨酸阴性对照没有显著影响。在另一实施方案中，三肽分子使肝脂质中的总胆固醇水平降低，而对亮氨酸阴性对照没有显著影响。在以上实施方案中的任一者中，三肽分子为Gly-Gly-Leu或Gly-Gly-dLeu。

本发明还提供了一种用于增加或增强肝脂质氧化以降低甘油三酯水平或处理胆固醇累积的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用甘氨酸或一种或多种甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐，以及测量它对mRNA水平的影响，其中肝脂质氧化、甘油三酯水平、胆固醇累积或它们的任何组合得到增强或被处理。

用于增强肝脂质氧化、降低甘油三酯水平或处理胆固醇累积的方法包括向有需要的受试者施用甘氨酸三肽Gly-Gly-Leu或Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐，以及测量它对mRNA水平的影响，其中肝脂质氧化、甘油三酯水平、胆固醇累积或它们的任何组合得到增强或被处理。所述方法中含甘氨酸的三肽分子Gly-Gly-Leu或Gly-Gly-dLeu显著诱导肝脂质氧化的调控因子AMPKα1或PPARα的表达，由亮氨酸阴性对照来看没有影响。所述方法中三肽分子Gly-Gly-Leu或Gly-Gly-dLeu通过显著上调CPT1a、CACT或ACADI(线粒体β-氧化)或PNPLA2调控甘油三酯水解。所述方法中三肽分子Gly-Gly-Leu或Gly-Gly-dLeu通过显著上调线粒体阴离子载体UCP2调控甘油三酯水解。

所述方法中三肽分子Gly-Gly-Leu或Gly-Gly-dLeu通过显著增加ABCG5和ABCG8的表达调控肝脏中的胆固醇稳态。

一种对受试者的血浆脂质型态进行处理的方法包括向有需要的受试者施用一种或多种三肽分子或其药学上可接受的盐以降低受试者的血浆甘油三酯、血浆LDL水平或减少动脉粥样硬化斑块。

一种对受试者的血浆脂质型态进行处理的方法包括向有需要的受试者施用三肽分子Gly-Gly-Leu或Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐，以降低受试者的血浆甘油三酯、血浆LDL水平或减少动脉粥样硬化斑块。所述方法中Gly-Gly-Leu或Gly-Gly-dLeu使动脉粥样硬化斑块减少。对受试者的血浆脂质型态进行处理的方法包括向有需要的受试者施用三肽分子Gly-Gly-Leu以降低血浆总胆固醇、血浆LDL或它们的组合。

在本发明方法的任一实施方案中，可为受试者施用另一降脂质剂。所述方法中另一降脂质剂为胆固醇吸收抑制剂、PCSK9抑制剂、PPAR-α激动剂、非诺贝特(fenofibrate)、ACC抑制剂、ApoC-III抑制剂、ACL-抑制剂、处方鱼油或CETP抑制剂。在一些实施方案中，方法包括施用作为胆固醇吸收抑制剂的另一降胆固醇剂。所述方法中降胆固醇剂为胆固醇吸收抑制剂并且胆固醇吸收抑制剂为依替米贝(ezetimibe)。在一些实施方案中，降胆固醇剂为PCKS9抑制剂。

当将氧和营养物从你的心脏运输至你身体其余部分的血管(动脉)变得薄而硬(动脉硬化)时发生动脉粥样硬化。有时，这将血流限制至你的器官和组织。动脉粥样硬化可引起许多并发症，包括心肌梗塞、冠状动脉疾病、颈动脉疾病、颈动脉疾病、周围性动脉疾病、动脉瘤以及慢性肾病。

当到达心脏一部分的血流减小或停止从而对心肌产生损害时发生心肌梗塞(心脏病)。常见症状为胸中部或左侧疼痛、呼吸短促、恶心，或者它可引起心脏衰竭、心跳不规则、心原性休克或心脏停搏。

当动脉粥样硬化使靠近你心脏的动脉变窄时发生冠状动脉疾病，这可引起胸痛(心绞痛)、心脏病发作或心脏衰竭。

当动脉粥样硬化使靠近你脑部的动脉变窄时发生颈动脉疾病，这可引起暂时性缺血性发作(TIA)或中风。症状包括你的臂或腿部突然麻木或虚弱、一只眼睛暂时性视觉损失或面部肌肉下垂。

当动脉粥样硬化使你的臂或腿部的动脉变窄时发生周围性动脉疾病，这些循环问题称为周围性动脉疾病。这可使你对热和冷不太敏感，从而增加灼伤或冻伤的风险。偶尔地，臂和腿部的不良循环可引起组织死亡(坏疽)。症状为行走时腿疼(跛行)。

当动脉粥样硬化引起可在你身体的任何地方发生的严重并发症时可能会发生动脉瘤。动脉瘤为你动脉壁中的凸起，动脉瘤可为医疗急诊，并且如果它破裂，那么它可能是危及生命的事件。

在动脉粥样硬化导致动脉变窄从而使得肾脏阻止氧合血液到达它们时可引起慢性肾病。随时间推移，这可影响肾脏阻止废弃物离开身体的功能。症状为高血压或肾衰竭。

本发明提供了一种用于通过向有需要的受试者施用一种或多种甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐来治疗动脉粥样硬化的方法，其中含甘氨酸的三肽分子的施用治疗动脉粥样硬化。在一个实施方案中，所述方法为用于通过向受试者施用含甘氨酸的三肽分子Gly-Gly-Leu和/或Gly-Gly-dLeu来治疗动脉粥样硬化的方法。本发明还提供了一种治疗动脉粥样硬化的并发症的方法，所述方法通过向患有所述并发症的受试者施用含甘氨酸的三肽分子来治疗心肌梗塞、冠状动脉疾病、颈动脉疾病、颈动脉疾病、周围性动脉疾病、动脉瘤或慢性肾病。在一个实施方案中，治疗动脉粥样硬化的并发症的方法通过向患有所述并发症的受试者施用含甘氨酸的三肽分子Gly-Gly-Leu或Gly-Gly-dLeu来治疗心肌梗塞、冠状动脉疾病、颈动脉疾病、颈动脉疾病、周围性动脉疾病、动脉瘤或慢性肾病。

一种治疗脂肪组织中和循环中的炎症的方法包括向有需要的受试者施用一种或多种甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐，其中三肽分子的施用使得炎症减轻。

治疗脂肪组织中和循环中的炎症的方法包括向有需要的受试者施用Gly-Gly-Leu和/或Gly-Gly-dLeu或药学上可接受的盐，其中通过降低血浆MCP1的水平使循环中的炎症减轻。一种其中脂肪组织中的炎症位于附睾脂肪组织(EAT)或皮下脂肪组织(SAT)中的治疗炎症的方法包括向有需要的受试者施用Gly-Gly-Leu和/或Gly-Gly-dLeu，并且MCP1 mRNA的水平降低。

一种对受试者进行治疗以降低甘氨酸三肽分子的血浆水平的方法包括向有需要的受试者施用一种或多种三肽分子或其药学上可接受的盐，其中三肽分子的施用使血浆甘氨酸三肽分子的水平降低。

一种对受试者进行治疗以降低甘氨酸三肽分子的血浆水平的方法包括向有需要的受试者施用三肽Gly-Gly-Leu或Gly-Gly-dLeu。

一种对受试者进行治疗以降低膳食后葡萄糖的方法包括向有需要的受试者施用一种或多种三肽分子或其药学上可接受的盐。对受试者进行治疗以降低膳食后葡萄糖的方法包括向有需要的受试者施用甘氨酸三肽Gly-Gly-Leu和/或Gly-Gly-dLeu。

一种治疗受试者的方法包括向有需要的受试者施用Gly-Gly-Leu和/或Gly-Gly-dLeu，其中受试者患有肝病。

治疗受试者的方法包括向有需要的受试者施用Gly-Gly-Leu和/或Gly-Gly-dLeu，其中受试者患有肝病，其中肝病为非酒精性脂肪肝病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或酒精性肝性脂肪变性。

一种稳定或降低受试者的NAFDL活性得分(NAS)的方法包括向受试者施用治疗有效量的包含Gly-Gly-Leu和/或Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐的组合物。

稳定或降低受试者的NAFDL活性得分(NAS)的方法包括向受试者施用治疗有效量的包含Gly-Gly-Leu和/或Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐的组合物，其中所述方法包括减慢NAS的脂肪变性组分的进展、稳定或减少NAS的脂肪变性组分。所述方法包括减慢NAS的小叶炎症组分的进展、稳定或减少NAS的小叶炎症组分。所述方法包括减慢NAS的肝细胞气球样变组分的进展、稳定或减少NAS的肝细胞气球样变组分。

在根据稳定或降低NAFLD活性得分的方法中的任一者的方法中，在用治疗有效量的包含Gly-Gly-Leu和/或Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐的组合物治疗6个月之后，NAS相差不超过1.5个点。

一种减轻有需要的受试者的肝纤维化的方法包括向受试者施用治疗有效量的包含Gly-Gly-Leu和/或Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐的组合物。

一种用于降低有需要的受试者中的血浆纤维蛋白原水平的方法包括向受试者施用治疗有效量的包含Gly-Gly-Leu和/或Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐的组合物。

在用于降低有需要的受试者中的血浆纤维蛋白原水平的方法中，在向受试者施用治疗有效量的包含Gly-Gly-Leu和/或Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐的组合物之前，受试者的纤维蛋白原水平大于300mg/dL。

本发明的一个实施方案为一种用于治疗NAFLD的药盒，所述药盒包括DT-109、任选的他汀以及使用说明书。本发明的另一实施方案为一种用于治疗NASH的药盒，所述药盒包括DT-109、任选的他汀以及使用说明书。本发明的一个实施方案为一种用于治疗NAFLD的药盒，所述药盒包括DT-110、任选的他汀以及使用说明书。本发明的另一实施方案为一种用于治疗NASH的药盒，所述药盒包括DT-110、任选的他汀以及使用说明书。

本发明提供了用于减轻患者的肝纤维化的方法，所述方法包括施用DT-109或DT-110或其药学上可接受的盐。一个实施方案为一种减轻有需要的受试者的肝纤维化的方法，所述方法包括向受试者施用DT-109或DT-110。另一实施方案为一种减轻有需要的受试者中的肝纤维化的方法，所述方法包括向受试者施用DT-109或DT-110，其中受试者患有NASH。

纤维蛋白原(因子I)为一种哺乳动物糖蛋白，所述哺乳动物糖蛋白在血液凝块的形成中起作用。在血液凝块形成期间，纤维蛋白原由凝血酶转化为纤维蛋白。纤维蛋白原在肝细胞中合成。因此，纤维蛋白原可为许多疾病的预后指示物或血液标记物并且还可用以影响疾病状态的发作和进展。

在各个实施方案中，用于治疗哺乳动物受试者的高脂血症、脂肪肝、脂肪性肝炎、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎、肥胖症、高血糖症、代谢综合征、心血管疾病以及动脉粥样硬化中的至少一者的方法包括向有需要的受试者施用甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐。

在各个实施方案中，含甘氨酸的三肽分子使肝脂质中的甘油三酯水平显著降低，而对于亮氨酸阴性对照没有显著影响。

在各个实施方案中，含甘氨酸的三肽分子显著降低肝脂质中的总胆固醇水平，而对亮氨酸阴性对照没有显著影响。

在各个实施方案中，含甘氨酸的三肽分子为Gly-Gly-Leu、Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐。

本发明提供了一种用于在有需要的受试者中增强肝脂质氧化或利用、降低甘油三酯水平或治疗高胆固醇血症的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐，其中肝脂质氧化、甘油三酯水平、高胆固醇血症或它们的任何组合因治疗而得到改善。在这些实施方案的一个相关方面中，含甘氨酸的三肽分子为Gly-Gly-Leu、Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐。

在这些实施方案的一个相关方面中，含甘氨酸的三肽分子Gly-Gly-Leu、Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐显著诱导肝脂质氧化的调控因子AMPKα1或PPARα的表达，由亮氨酸阴性对照来看没有影响。

在这些实施方案的一个相关方面中，含甘氨酸的三肽分子Gly-Gly-Leu、Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐通过显著上调CPT1a、CACT或ACADI(线粒体β-氧化)或PNPLA2调控甘油三酯水解。

在这些实施方案的一个相关方面中，含甘氨酸的三肽分子Gly-Gly-Leu、Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐通过显著上调线粒体阴离子载体UCP2调控甘油三酯水解。

在这些实施方案的一个相关方面中，含甘氨酸的三肽分子Gly-Gly-Leu、Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐通过显著增加ABCG5和ABCG8的表达调控肝脏中的胆固醇稳态。

在这些实施方案的一个相关方面中，受试者的血浆脂质型态包括向有需要的受试者施用甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐，以降低受试者的血浆甘油三酯、血浆LDL水平或减少动脉粥样硬化斑块。在这些实施方案的一个相关方面中，含甘氨酸的三肽分子为Gly-Gly-Leu、Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐。

在这些实施方案的一个相关方面中，Gly-Gly-Leu、Gly-Gly-dLeu、甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐使动脉粥样硬化斑块减少。

在这些实施方案的一个相关方面中，Gly-Gly-Leu、Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐使血浆总胆固醇、血浆LDL或它们的组合降低。

本公开提供了一种治疗需要此类治疗的受试者中的脂肪组织中和循环中的炎症的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐，其中含甘氨酸的三肽分子或其药学上可接受的盐的施用使得受试者的脂肪组织中和循环中的炎症减轻。在这些实施方案的一个相关方面中，通过向受试者施用Gly-Gly-Leu、Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐降低血浆MCP1的水平来减轻循环中的炎症。在这些实施方案的一个相关方面中，脂肪组织中的炎症位于附睾脂肪组织(EAT)或皮下脂肪组织(SAT)中，并且MCP1mRNA的水平降低。

本公开提供了一种对受试者进行治疗以降低有需要的受试者中瘦素的血浆水平的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐，其中含甘氨酸的三肽分子的施用使血浆瘦素的水平降低。在这些实施方案的一个相关方面中，治疗使用Gly-Gly-Leu、Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐。

本公开提供了一种对受试者进行治疗以降低有需要的受试者中的膳食后葡萄糖的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用含甘氨酸的三肽分子或其药学上可接受的盐。

在这些实施方案的一个相关方面中，对受试者的治疗包括施用治疗有效量的甘氨酸三肽分子，例如Gly-Gly-Leu、Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐。

本公开提供了一种治疗罹患或可能发展肝病(例如特征为肝脏具有说明诸如NAFLD、NASH或肝脏的酒精性相关脂肪变性、肝硬化或肝炎等肝病的过量胆固醇、甘油三酯或其他脂质的肝病)的受试者的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用Gly-Gly-Leu、Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐，以治疗或预防肝病。

在这些实施方案的一个相关方面中，肝病为非酒精性脂肪肝病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或酒精性肝性脂肪变性。

在这些实施方案的一个相关方面中，本公开提供了一种稳定或降低受试者的NAFDL活性得分(NAS)的方法，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的具有氨基酸序列Gly-Gly-Leu、Gly-Gly-dLeu的甘氨酸三肽或其药学上可接受的盐。在这些实施方案的一个相关方面中，所述方法包括减慢NAS的脂肪变性组分的进展、稳定或减少NAS的脂肪变性组分。在这些实施方案的一个相关方面中，所述方法包括减慢NAS的小叶炎症组分的进展、稳定或减少NAS的小叶炎症组分。在这些实施方案的一个相关方面中，所述方法包括减慢NAS的肝细胞气球样变组分的进展、稳定或减少NAS的肝细胞气球样变组分。在这些实施方案的一个相关方面中，在用Gly-Gly-Leu、Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐治疗6个月之后，NAS相差不超过1.5个点。

本公开提供了一种减轻有需要的受试者的肝纤维化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的甘氨酸三肽分子：Gly-Gly-Leu、Gly-Gly-dLeu，或其药学上可接受的盐。

本公开提供了一种治疗动脉粥样硬化的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的含甘氨酸的三肽分子或其药学上可接受的盐。在这些实施方案的一个相关方面中，含甘氨酸的三肽分子为Gly-Gly-Leu、Gly-Gly-dLeu或其药学上可接受的盐。

本公开提供了一种通过向患有所述并发症的受试者施用治疗有效量的用于治疗选自由心肌梗塞、动脉硬化、冠状动脉疾病、颈动脉疾病、周围性动脉疾病、动脉粥样化血栓性中风、动脉瘤或慢性肾病组成的组的并发症的含甘氨酸的三肽分子来治疗动脉粥样硬化的并发症的方法。

本公开还涵盖通过施用含甘氨酸的三肽分子与用于治疗代谢疾病、心血管疾病以及炎性疾病的第二治疗剂的组合来治疗此类例示代谢疾病、心血管疾病以及炎性疾病。在一些实施方案中，上文公开的方法还包括向有需要的受试者施用选自以下的第二治疗剂：胆固醇吸收抑制剂、PCSK9抑制剂、PPAR-α激动剂、ACE抑制剂、钙离子通道阻断剂、ARBs、肾素、GLP-1或其合成变体、胰岛素或其合成变体、二甲双胍、磺酰脲化合物、噻唑烷二酮(TZD)、PCSK9抑制剂、SGLT2抑制剂、DPP-IV抑制剂、HMGCoA还原酶的抑制剂、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)的抑制剂、依替米贝、吉非罗齐(gemfibrozil)、非诺贝特、氯贝特(clofibrate)、苯扎贝特(bezafibrate)、培马贝特(pemafibrate)、吉卡宾(gemcabene)(CI-1027)、贝派地酸(benpodoic acid)(ETC-1002)、ACC抑制剂、ApoC-III抑制剂、ACL-抑制剂、处方鱼油、CETP抑制剂抗纤维化剂以及它们的组合。

某些实施方案提供一种用于治疗、预防或改善如本文所描述的代谢疾病和/或心血管疾病和/或炎性疾病中的一者或多者的药盒，其中所述药盒包含：a)如本文所描述的含甘氨酸的三肽分子；以及任选b)如本文所描述的另一剂或疗法。药盒可还包括使用药盒来治疗、预防或改善代谢疾病和/或心血管疾病和/或炎性疾病中的一者或多者的说明书或标签。在这些实施方案的一个相关方面中，药盒是用于治疗患有NAFLD或患有NASH的受试者，所述药盒包括所选的三肽、任选的他汀以及使用说明书。在这些实施方案的一个相关方面中，药盒包括DT-109(Gly-Gly-Leu)和/或(DT-110(Gly-Gly-dLeu)、任选的他汀以及使用说明书。在这些实施方案的一个相关方面中，药盒还任选包含胆固醇吸收抑制剂、PCSK9抑制剂、PPAR-α激动剂、ACE抑制剂、钙离子通道阻断剂、ARBs、肾素、GLP-1或其合成变体、胰岛素或其合成变体、二甲双胍、磺酰脲化合物、噻唑烷二酮(TZD)、PCSK9抑制剂、SGLT2抑制剂、DPP-IV抑制剂、他汀、HMGCoA还原酶(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型)的抑制剂、依替米贝、吉非罗齐、非诺贝特、氯贝特、苯扎贝特、培马贝特、吉卡宾(CI-1027)、贝派地酸酸(ETC-1002)、ACC抑制剂、ApoC-III抑制剂、ACL-抑制剂、处方鱼油、CETP抑制剂抗纤维化剂以及它们的组合。在这些实施方案的一个相关方面中，药盒任选包含依替米贝。

制剂

如本文所用，术语“药学上可接受的”意味着由联邦或州政府管理机构批准或在美国药典或其他通常认可的药典中被列举用于动物，诸如人。术语“载体”是指与所述剂一起配制以便施用的稀释剂、佐剂、赋形剂、稳定剂或媒介物。医药载剂可为无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水为静脉内施用药物组合物时的典型载体。可采用盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液作为液体载体，特别是对于可注射溶液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、粉末、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。组合物(如果需要)还可含有微小量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。药物组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂等形式。还可使用传统结合剂和载体(诸如甘油三酯)将组合物配制成栓剂。

本发明的药物组合物包含甘氨酸的三肽分子或其药学上可接受的盐与至少一种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的混合物。药学上可接受的组合物含有用于修改、维持或保留组合物的例如pH值、渗透压、粘度、清澈度、颜色、等张性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或穿透作用的一种或多种配制材料。适合的配制材料包括但不限于氨基酸(诸如谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(诸如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(诸如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris HCl、柠檬酸盐、磷酸盐、其他有机酸)；增容剂(诸如甘露糖醇或甘氨酸)、螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(EDTA))；复合剂(诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β环糊精或羟丙基β环糊精)；填料；单糖；二糖和其他碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂；调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐反离子(诸如钠)；防腐剂(诸如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、甲基对羟基苯甲酸酯、丙基对羟基苯甲酸酯、洛赫西定(chlorhexidine)、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(诸如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(诸如普朗尼克(pluronics)、PEG、脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯(诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、曲通(triton)、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；稳定性增强剂(蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(诸如碱金属卤化物(在一个方面中为氯化钠或氯化钾、甘露糖醇山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。(Remington′s PharmaceuticalSciences，第18版，A.R.Gennaro编，Mack Publishing Company，1990)。

在本发明的一个方面中，以含有冻干饼状物的仅供一次使用的玻璃小瓶的形式供应含甘氨酸的三肽分子，所述冻干饼状物在达到pH4.25的由10mM谷氨酸、2％甘氨酸、1％蔗糖以及0.01％聚山梨醇酯20组成的配制缓冲液中制备。在用一定体积的无菌稀释剂(例如无菌等渗盐水或水)(例如0.5mL至约10mL，例如2.2mL的无菌水)复原后，饼状物产生1g/mL至约100g/mL浓度的甘氨酸三肽分子。在受控条件下将含甘氨酸的三肽分子储存于安全位置。在已将一次性使用的小瓶复原后，立即(复原之后不超过三小时)施用药物。在注射之前，允许研究药物达到室温(15至30℃)。

剂量和施用

如本文所用，“剂量”通常等于可每天施用一次或可一天施用若干次(例如单位剂量为所需日剂量的一部分)的活性成分的剂量。在各个实施方案中，各种剂量和给药方案适用于甘氨酸或本文所公开的含甘氨酸的三肽分子。举例来说，可用于本发明中的剂量为基于受试者体重所计算的5mg/Kg至2,000mg/Kg，或30mg/Kg至1,500mg/Kg，或40mg/Kg至1,250mg/Kg，或50mg/Kg至1,000mg/Kg，或60mg/Kg至5,000mg/Kg。如本文所用的术语“单位剂量”可用于指示包含预定量的活性化合物的离散量的治疗剂组合物。活性成分的量通常等于可每天施用一次或可一天施用若干次(例如单位剂量为所需日剂量的一部分)的活性成分的剂量。单位剂量还可用于指示总日剂量，所述总日剂量可每天施用一次或可以此类剂量的方便部分的形式施用(例如单位剂量为可以诸如一半或三分之一的剂量等分数增量给予的总日剂量)。

如本文所用，术语“起始日剂量”是指每天向先前尚未经受甘氨酸三肽分子滴定方案的开始含甘氨酸的三肽分子治疗的患者施用或开出的含甘氨酸的三肽分子的量。此量可以多个单元剂量或以单一单位剂量、一天中单次或一天中多次施用。

在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的量可为约1mg/kg/天至约10,000mg/kg/天、约1mg/kg/天至约1,000mg/kg/天、约0.1mg/kg/天至约1,000mg/kg/天、约I mg/kg/天至约1,000mg/kg/天、约1,000mg/kg/天至约10,000mg/kg/天或约1mg/kg/天至约500mg/kg/天。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的量可为约3mg/kg/天至约70mg/kg/天。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的量可为约7mg/kg/天至约40mg/kg/天。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的量可为约3mg/kg/天至约50mg/kg/天。

在一些实施方案中，剂量可为1000mg/天至100g/天，更优选为1000mg/天至75g/天。组合物中含甘氨酸的三肽分子的量可优选为约50mg至约100g、约100mg至约90g、约500mg至约75g、约600mg至约80g、约700mg至约75g。在一些实施方案中，组合物中含甘氨酸的三肽分子的量可为约100mg至约1,000g、约200mg至约500g、约300mg至约100g、约400mg至约75g、约500mg至约50g、约750mg至约25g、约1,000mg至约50g或1000mg至约25g。

在一些实施方案中，所要施用的含甘氨酸的三肽分子的治疗有效剂量为约100mg至约200g。此剂量可作为单一日剂量施用，或可分成一天内施用的若干剂量，例如每天1至5个剂量，优选两个或三个剂量。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的量为约250mg至约100g。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的量为约500mg至约90g。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的量为约750mg至约75g。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的量为约1000mg至约50g。在一些实施方案中，组合物适合于经口施用。在一些实施方案中，组合物为固体口服剂型。

对于含甘氨酸的三肽分子，组合物可具有至少99.5％、优选至少99.6％、优选至少99.7％、优选至少99.8％、优选至少99.9％、优选至少99.95％或更优选至少99.99％的手性纯度。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的手性纯度为100％。在一些实施方案中，对于含甘氨酸的三肽分子，组合物具有99.9％或更大的手性纯度。在一些实施方案中，对于含甘氨酸的三肽分子，组合物具有99.95％或更大的手性纯度。在一些实施方案中，对于含甘氨酸的三肽分子，组合物具有99.99％或更大的手性纯度。

在一些实施方案中，组合物适合于经口施用。在一些实施方案中，组合物为固体口服剂型。在一些实施方案中，组合物为胶囊。在一些实施方案中，组合物为片剂。在一些实施方案中，将组合物配制成口服或肠胃外溶液。

为简洁起见在本文中分开描述的关于组合物中含甘氨酸的三肽分子的量、手性纯度以及剂型的实施方案可以任何适合的组合相联合。

在另一方面中，本发明涉及包含对于甘氨酸三肽分子为手性纯的含甘氨酸的三肽分子的组合物。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的量可为基于受试者体重计算的约5mg/Kg/天至5000mg/Kg/天，或5mg/Kg/天至约2,000mg/Kg/天，或30mg/Kg/天至1500mg/Kg/天，或40mg/Kg/天至1250mg/Kg/天，或50mg/Kg/天至1000mg/Kg/天，或60mg/Kg/天至500mg/Kg/天。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的量可为约10mg/kg/天至约1000mg/kg/天。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的量可为约7mg/kg/天至约900mg/kg/天。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的量可为约5mg/kg/天至约800mg/kg/天。在一些实施方案中，剂量可为10mg/天至5,000mg/天，更优选100mg/天至2000mg/天。在一些实施方案中，以约500mg至约100g、约1,000mg至约75g、约1500mg至约50g或约2000mg至约25g的甘氨酸三肽分子的剂量施用组合物。在一些实施方案中，以约250mg至约500g、约500mg至约250g、约750mg至约200g、约1,000mg至约100g、约1,250mg至约75g、约1,500mg至约50g、约2,000mg至约25g或2,500mg至约20g的剂量施用组合物。在一些实施方案中，向有需要的受试者投用以预防或治疗代谢疾病和/或心血管疾病和/或炎性疾病的含甘氨酸的三肽分子的有效量可在约500mg至约200g范围内。此剂量可作为单一日剂量施用，或可分成一天内施用的若干剂量，例如每天1至5个剂量，优选每天两个至三个剂量。这些剂量的含甘氨酸的三肽分子优选含于化学纯度为97％或更大并且对于甘氨酸三肽分子手性纯度为99.6％或更大、99.7％或更大、99.8％或更大、99.9％或更大、优选99.95％或更大并且更优选99.99％或更大的制剂中。在一个优选实施方案中，对于含甘氨酸的三肽分子，包含含甘氨酸的三肽分子的组合物可具有100％的手性纯度。组合物可还包含载体。本发明的组合物可优选作为固体口服剂量并且更优选作为可为胶囊或片剂的固体口服剂量经口施用。在优选实施方案中，可将本发明的组合物配制成用于经口施用的片剂。

在另一方面中，本发明还提供了一种包含治疗有效量的甘氨酸三肽分子的组合物。组合物可还包含药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的治疗有效量可为约1mg/kg/天至约10,000mg/kg/天、约5mg/kg/天至约5,000mg/kg/天、约20mg/kg/天至约1,000mg/kg/天、约30mg/kg/天至约1,000mg/kg/天、约50mg/kg/天至约10,000mg/kg/天或约100mg/kg/天至约5,000mg/kg/天。

在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的治疗有效量可为约5mg/kg/天至约5,000mg/kg/天。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的治疗有效量可为约10mg/kg/天至约4,000mg/kg/天。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的治疗有效量可为约25mg/kg/天至约2,000mg/kg/天。在一些实施方案中，剂量可为10mg/天至1,000g/天，更优选为500mg/天至100g/天。组合物中含甘氨酸的三肽分子的治疗有效量可优选为约250mg至约500g、约500mg至约400g、约750mg至约200g、约1,000mg至约100g。在一些实施方案中，组合物中含甘氨酸的三肽分子的治疗有效量可为约300mg至约1,000g、约500mg至约500g、约600mg至约400g、约700mg至约300g、约800mg至约200g、约900mg至约150g或约1,000mg至约100g。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的量为约600mg至约300g。此剂量可作为单一日剂量施用，或可分成一天内施用的若干剂量，例如每天1至5个剂量，优选每天两个至三个剂量。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的治疗有效量为约500mg至约350g。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的治疗有效量为约750mg至约250g。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的治疗有效量为约1,000mg至约150g。在一些实施方案中，含甘氨酸的三肽分子的治疗有效量为约1,500mg至约100g。在一些实施方案中，组合物适合于经口施用。在一些实施方案中，组合物为固体口服剂型。在一些实施方案中，组合物为液体口服剂型。在一些实施方案中，组合物为液体肠胃外剂型。

在一些实施方案中，组合物适合于经口施用。在一些实施方案中，组合物为固体口服剂型。在一些实施方案中，组合物为胶囊。在一些实施方案中，组合物为片剂。

在另一方面中，(在一个方面中)通过肝脂质氧化、AMPKα1、葡糖激酶、过氧化物酶体增殖物激活受体-α、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ、PPARγ共激活剂1、丙酮酸激酶、固醇调控元件结合蛋白-1c、长链和极长链酰基辅酶A脱氢酶或硬脂酰基辅酶A去饱和酶的信使RNA或蛋白质表达的有利改变观察到甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐对受试者的肝功能的有益作用。在另一方面中，通过磷酸烯醇丙酮酸激酶、微粒体转移蛋白、芳基乙酰胺脱乙酰酶、载脂蛋白C2、肉毒碱棕榈酰转移酶II或磷脂酶D1的信使RNA或蛋白质表达的改善观察到甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐对受试者的肝功能的有益作用。

可通过任何适合的途径施用本发明的甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐。举例来说，可通过经口、经眼、真皮内、腹膜内、鼻内、皮下、肌肉内或静脉内途径施用本发明的组合物。

适合经口施用的制剂包括例如固体、半固体以及液体系统，诸如片剂；含有多微粒或纳米微粒、液体或粉末的软质或硬度胶囊；糖锭(包括液体填充的)；咀嚼物；凝胶；快速分散剂型；薄剂；珠剂；喷雾。在一些实施方案中，使用本领域中已知的递送媒介物将本发明的肽配制成用于经口施用，所述递送媒介物包括但不限于微球、脂质体、肠溶包衣干乳剂或纳米粒子。

用于经口施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆以及酏剂。除活性肽之外，液体剂型还可含有本领域中常用的惰性稀释剂，诸如水或其他溶剂；增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(具体地说，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油以及芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇以及脱水山梨醇的脂肪酸酯以及其混合物。除惰性稀释剂之外，口服组合物还可包括佐剂，诸如润湿剂、乳化和悬浮剂、增甜剂、调味剂以及芳香剂。

用于经口施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末以及颗粒。在此类固体剂型中，将活性肽与至少一种惰性、药学上可接受的赋形剂或载剂(诸如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下各项混合：a)填料或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇以及硅酸，b)结合剂，诸如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖以及阿拉伯胶，c)湿润剂，诸如甘油，d)崩解剂，诸如琼脂(agar--agar)、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐以及碳酸钠，e)溶解阻滞剂，诸如石蜡，f)吸收加速剂，诸如季铵化合物，g)润湿剂，诸如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂，诸如高岭土和膨润土，以及i)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠以及其混合物。在胶囊、片剂以及丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。活性化合物还可呈使用如上文所提到的一种或多种赋形剂的微囊封装形式。还可采用类似类型的固体组合物作为使用诸如乳糖(lactose或milksugar)以及高分子量聚乙二醇、泊洛沙姆等赋形剂的软质和硬度填充明胶胶囊中的填料。可将片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂以及颗粒的固体剂型制备成具有包衣和外壳，诸如肠溶衣和药物配制技术中熟知的其他包衣。可根据已知技术使用适合的分散或润湿剂以及悬浮剂配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂还可为于无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如作为于1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的媒介物和溶剂之中，可采用的是水、林格氏溶液(Ringer′s solution)(U.S.P.)以及等张氯化钠溶液。此外，常规地采用无菌、固定油作为溶剂或悬浮介质。出于此目的，可采用任何温和固定油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。此外，将诸如油酸等脂肪酸用于制备可注射物。可例如通过经细菌截留过滤器过滤或通过在呈可在使用之前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式中合并灭菌剂对可注射制剂进行灭菌。

本领域技术人员将了解，为治疗用途而施用的含甘氨酸的三肽分子多肽的量有所不同。在一个方面中，含有甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐的组合物基本上不含污染因子，污染水平小于0.02％(w/w)。例如通过将包含纯化的含甘氨酸的三肽分子和稳定盐的冻干样品用药理学上可接受的稀释剂复原来制备适合注射至患者中的含甘氨酸的三肽分子组合物。如本文以下详细论述，施用含甘氨酸的三肽分子组合物替代地为全身或局部的，并且包括施用治疗有效量的含甘氨酸的三肽分子蛋白质组合物。

组合治疗和组合物

除仅基于递送含有甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐的组合物的疗法之外，特别地涵盖组合疗法。在本发明的情形中，预期结合常用于治疗代谢疾病(例如脂肪肝病)的其他剂类似地使用含甘氨酸的三肽分子疗法。

在各个实施方案中，可将一种或多种第二治疗剂与甘氨酸三肽分子组合，特别是用于活性的协同增强。可通过向患者单独施用活性成分或以多个活性成分存在于一种药物制剂中的组合产品形式进行活性成分组合的施用。预期在用作单一剂时可以批准剂量投用第二治疗剂，或最初可以治疗有效浓度或以亚治疗有效浓度投用第二治疗剂，使得当组合施用时，第二治疗剂与甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐的组合在正在治疗的患者中提供治疗有效结果。

为使用本发明的方法和组合物实现适当治疗结果，可提供包含含甘氨酸的三肽分子和至少一种或多种其他治疗剂(一种或多种第二治疗剂)的组合物。在本发明中，预期第二治疗剂可选自普兰林肽(pramlinitide)、肽YY(PYY)、艾塞那肽(exanatide)或胰岛素敏化剂(包括但不限于噻唑烷二酮或二甲双胍)或格列美脲(glimepiride)以及这些化合物中的任一者的类似物。用于控制血脂异常、糖尿病以及与动脉粥样硬化相关的心血管疾病的其他第二治疗剂为本领域中熟知的并且可与本发明的含甘氨酸的三肽分子组合使用。

以在代谢疾病，例如与以下中的一者或多者相关的代谢疾病的治疗中有效产生所需治疗结果的组合量提供组合疗法组合物：葡萄糖代谢异常；血脂异常，例如与胆固醇增加相关的血脂异常(纯或独立型高胆固醇血症)和/或仅甘油三酯(TG)增加(纯或独立型高甘油三酯血症)和/或胆固醇与TG均增加(混合或组合型高脂血症)；脂肪肝病，包括NAFLD、NASH；脂肪变性、肝炎、周围性动脉疾病、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、全身炎症以及与斑块相关血栓形成相关的缺血性中风。此方法涉及同时向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的第一治疗剂(即包含治疗有效量的甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐的组合物)以及任选一种或多种第二治疗剂或因子。这通过施用包括两种治疗剂的单一组合物或药理学制剂或通过同时施用两种独特组合物或制剂来实现，其中一种组合物包括含甘氨酸的三肽分子治疗性组合物，并且另一种包括第二治疗剂。

可用作与含甘氨酸的三肽分子组合使用的第二治疗剂的抗糖尿病药可包括胰岛素和胰岛素衍生物(诸如

抗糖尿病药还包括如例如WO2006121860中所描述的葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)受体的激动剂以及用于控制血糖和治疗糖尿病(包括II型糖尿病)的GLP-1和GLP-2以及其合成变体和突变体。

可用于与本文所公开的含甘氨酸的三肽分子组合的例示性第二治疗剂可包括口服有效的降血糖活性成分，优选为磺酰脲、双胍、美格替奈(meglitinide)、噁二唑烷二酮、噻唑烷二酮、葡糖苷酶抑制剂、糖原磷酸化酶的抑制剂、胰高血糖素拮抗剂、葡糖激酶激活剂、果糖-1,6-二磷酸酶的抑制剂、葡萄糖转运体4(GLUT4)的调节剂、谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)的抑制剂、GLP-1激动剂、钾通道打开剂(诸如吡那地尔(pinacidil)、克罗卡林(cromakalim)、二氮嗪或R.D.Carr等,Diabetes 52,2003,2513.2518中、J.B.Hansen等,Current Medicinal Chemistry 11,2004,1595-1615中、T.M.Tagmose等,J.Med.Chem.47,2004,3202-3211中或M.J.Coghlan等,J.Med.Chem.44,2001,1627-1653中描述的那些或Novo Nordisk A/S的WO 97/26265和WO 99/03861中已公开的那些)、二肽酰肽酶IV(DPP-IV)的抑制剂、胰岛素敏化剂、参与刺激糖异生和/或糖原分解的肝酶的抑制剂、葡萄糖摄入、葡萄糖转运以及葡萄糖重吸收的调节剂、11β-HSD1的抑制剂、蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的抑制剂、钠依赖性葡萄糖转运体1或2(SGLT1、SGLT2)的调节剂、改变脂质代谢的化合物(诸如抗高血脂活性成分和降脂活性成分)、减少食物摄入量的化合物、增加产热的化合物、PPAR和RXR调节剂以及作用于β细胞的ATP依赖性钾通道的活性成分。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如辛伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、阿伐他汀、西立伐他汀(cerivastatin)、罗伐他汀或L-659699等HMGCoA还原酶抑制剂组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如依替米贝、替喹胺(tiqueside)、帕马苷(pamaqueside)、FM-VP4(谷甾烷醇(sitostanol)/菜油固醇抗坏血酸磷酸酯；Forbes Medi-Tech，WO2005042692、WO2005005453)、MD-0727(Microbia Inc.，WO2005021497、WO2005021495)等胆固醇吸收抑制剂或与如WO2002066464、WO2005000353(Kotobuki Pharmaceutical Co.Ltd.)或WO2005044256或WO2005062824(Merck&Co.)或WO2005061451和WO2005061452(AstraZeneca AB)以及WO2006017257(Phenomix)或WO2005033100(Lipideon Biotechnology AG)中所描述的或如WO2004097655、WO2004000805、WO2004000804、WO2004000803、WO2002050068、WO2002050060、WO2005047248、WO2006086562、WO2006102674、WO2006116499、WO2006121861、WO2006122186、WO2006122216、WO2006127893、WO2006137794、WO2006137796、WO2006137782、WO2006137793、WO2006137797、WO2006137795、WO2006137792、WO2006138163中所描述的化合物组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与Vytorin

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与依替米贝与阿伐他汀的固定组合组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与依替米贝与非诺贝特的固定组合组合施用。

在本发明的另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与非诺贝特与罗伐他汀的固定组合组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与ISIS-301012(能够调控载脂蛋白B基因的反义寡核苷酸)组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如罗格列酮(rosiglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)、JTT-501、GI 262570、R-483、CS-011(利格列酮(rivoglitazone))等PPARγ激动剂组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与Competact

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与Tandemact

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与盐酸吡格列酮与血管紧张素II受体拮抗剂(诸如TAK-536)的固定组合组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如GW9578、GW-590735、K-111、LY-674、KRP-101、DRF-10945、LY-518674或如WO2001040207、WO2002096894、WO2005097076中所描述的那些PPARα激动剂组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与混合的诸如那格列扎(naveglitazar)、LY-510929、ONO-5129、E-3030、AVE 8042、AVE 8134、AVE 0847、CKD-501(硫酸罗格列酮)或如WO 00/64888、WO 00/64876、WO03/020269中或J.P.Berger等,TRENDSin Pharmacological Sciences 28(5),244-251,2005中所描述的PPARα/γ激动剂组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如GW-501516或如WO2006059744、WO2006084176、WO2006029699、WO2007039172-WO2007039178中所描述的PPARδ激动剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与美格达森(metaglidasen)或与MBX-2044或其他部分PPARγ激动剂/拮抗剂组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如非诺贝特、氯贝特或苯扎贝特等贝特组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如英普他派(implitapide)、BMS-201038、R-103757、AS-1552133或WO2005085226、WO2005121091、WO2006010423中描述的那些MTP抑制剂组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如托塞曲匹(torcetrapib)或JTT-705或WO2006002342、WO2006010422、WO2006012093、WO2006073973、WO2006072362、WO2006097169、WO2007041494中描述的那些CETP抑制剂组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如HMR 1741或如DE 102005 033099.1和DE 10 2005 033100.9、WO2007009655-56中所描述的那些胆酸吸收抑制剂(参见例如美国专利号6,245,744、美国专利号6,221,897或WO00/61568)组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如消胆胺(cholestyramine)或考来维仑(colesevelam)等聚合胆酸吸附剂组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如HMR1171、HMR1586或如WO2005097738中所描述的那些LDL受体诱导剂(参见美国专利号6,342,512)组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与如例如WO2006072393中所描述ABCA1表达增强剂组合施用。

在本发明的另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与PCSK9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型)的抑制剂(例如依伏库单抗(Evolocumab)、inclisiran)或针对PCSK9的RNAi治疗剂组合施用。在本发明的另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与针对PCSK9的抗体，例如可每两周投用75-150mg的阿利库单抗(Alirocumab，Praluent)；以及每两周投用140mg或每月投用420mg的依伏库单抗(Repatha)组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如阿伐米贝(avasimibe)或SMP-797等ACAT抑制剂组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如OPC-14117、普罗布考(probucol)、生育酚、抗坏血酸、β-胡萝卜素或硒等抗氧化剂组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如维生素B6或维生素B12等维生素组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如艾溴利平(ibrolipim)(NO-1886)等脂蛋白脂酶调节剂组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如SB-204990等ATP柠檬酸盐裂解酶抑制剂组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如BMS-188494、TAK-475或如WO2005077907、JP2007022943中所描述的角鲨烯合成酶抑制剂组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如吉卡宾(CI-1027)等脂蛋白(a)拮抗剂组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与GPR109A的激动剂(HM74A受体激动剂；NAR激动剂(烟酸受体激动剂)，诸如烟酸或延伸释放烟酸结合MK-0524A或WO2006045565、WO2006045564、WO2006069242、WO2006124490、WO2006113150、WO2007017261、WO2007017262、WO2007017265、WO2007015744、WO2007027532中描述的那些化合物组合施用。

在本发明的另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与如例如WO2006067531、WO2006067532中所描述的GPR116的激动剂组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如奥利司他(orlistat)或西替利司他(cetilistat)(ATL-962)等脂酶抑制剂组合施用。

在本发明的一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与胰岛素组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如甲苯磺丁脲、格列本脲(glibenclamide)、格列吡嗪(glipizide)、格列齐特(gliclazide)或格列美脲等磺酰脲组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如KCP-265(WO2003097064)或WO2007026761中描述的那些增强胰岛素分泌的物质组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如APD-668等葡萄糖-依赖性促胰岛素受体(GDIR)激动剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如二甲双胍等双胍组合施用。

在另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如瑞格列奈(repaglinide)、那格列奈(nateglinide)或米格列奈(mitiglinide)等美格列奈(meglitinide)组合施用。

在另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与米格列奈与格列酮(glitazone)(例如盐酸吡格列酮(pioglitazone hydrochloride))或马来酸罗格列酮(rosiglitazonemaleate)的组合或格列酮与格列美脲或二甲双胍的组合或它们的组合一起施用。

在另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与米格列奈与α-葡糖苷酶抑制剂的组合一起施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如曲格列酮(troglitazone)、噻格列酮(ciglitazone)、吡格列酮、罗格列酮或Dr.Reddy's Research Foundation的WO 97/41097中所公开的化合物(具体地说是5-[[4-[(3,4-二氢-3-甲基-4-氧代-2-喹唑啉基甲氧基]-苯基]甲基]--2,4-噻唑烷二酮)等噻唑烷二酮组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如米格列醇(miglitol)或阿卡波糖(acarbose)等α-葡糖苷酶抑制剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与作用于β细胞的ATP-依赖性钾通道的活性成分(诸如甲苯磺丁脲、格列本脲、格列吡嗪、格列美脲或瑞格列奈)组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与超过一种上述化合物组合，例如与磺酰脲和二甲双胍、磺酰脲和阿卡波糖、瑞格列奈和二甲双胍、胰岛素和磺酰脲、胰岛素和二甲双胍、胰岛素和曲格列酮、胰岛素和洛伐他汀等组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如PSN-357或FR-258900或如WO2003084922、WO2004007455、WO2005073229-31或WO2005067932中所描述的那些糖原磷酸化酶抑制剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如A-770077、NNC-25-2504或如WO2004100875或WO2005065680中所描述的胰高血糖素受体拮抗剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如LY-2121260(WO2004063179)、PSN-105、PSN-110、GKA-50或如例如WO2004072031、WO2004072066、WO2005080360、WO2005044801、WO2006016194、WO2006058923、WO2006112549、WO2006125972、WO2007017549、WO2007017649、WO2007007910、WO2007007040-42、WO2007006760-61、WO2007006814、WO2007007886、WO2007028135、WO2007031739、WO2007041365、WO2007041366、WO2007037534、WO2007043638、WO2007053345、WO2007051846、WO2007051845、WO2007053765、WO2007051847中所描述的那些葡糖激酶激活剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如FR-225654等糖异生抑制剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如CS-917(MB-06322)或MB-07803或WO2006023515、WO2006104030、WO2007014619中所描述的那些果糖-1,6-二磷酸酶(FBP酶)抑制剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如KST-48(D.-O.Lee等:Arzneim.-Forsch.Drug Res.54(12),835(2004))等葡萄糖转运体4(GLUT4)调节剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与如例如WO2004101528中所描述的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)的抑制剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如维格列汀(vildagliptin)(LAF-237)、西格列汀(sitagliptin)(MK-0431)、磷酸西格列汀、沙格列汀(saxagliptin)((BMS-477118)、GSK-823093、PSN-9301、SYR-322、SYR-619、TA-6666、TS-021、GRC-8200、GW-825964X、KRP-104、DP-893、ABT-341、ABT-279或其另一盐等二肽酰肽酶IV(DPP-IV)抑制剂或如WO2003074500、WO2003106456、WO2004037169、WO200450658、WO2005058901、WO2005012312、WO2005/012308、WO2006039325、WO2006058064、WO2006015691、WO2006015701、WO2006015699、WO2006015700、WO2006018117、WO2006099943、WO2006099941、JP2006160733、WO2006071752、WO2006065826、WO2006078676、WO2006073167、WO2006068163、WO2006090915、WO2006104356、WO2006127530、WO2006111261、WO2007015767、WO2007024993、WO2007029086中所描述的那些化合物组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与Janumet

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如BVT-2733、JNJ-25918646、INCB-13739或如例如WO200190090-94、WO200343999、WO2004112782、WO200344000、WO200344009、WO2004112779、WO2004113310、WO2004103980、WO2004112784、WO2003065983、WO2003104207、WO2003104208、WO2004106294、WO2004011410、WO2004033427、WO2004041264、WO2004037251、WO2004056744、WO2004058730、WO2004065351、WO2004089367、WO2004089380、WO2004089470-71、WO2004089896、WO2005016877、WO2005097759、WO2006010546、WO2006012227、WO2006012173、WO2006017542、WO2006034804、WO2006040329、WO2006051662、WO2006048750、WO2006049952、WO2006048331、WO2006050908、WO2006024627、WO2006040329、WO2006066109、WO2006074244、WO2006078006、WO2006106423、WO2006132436、WO2006134481、WO2006134467、WO2006135795、WO2006136502、WO2006138695、WO2006133926、WO2007003521、WO2007007688、US2007066584、WO2007047625、WO2007051811、WO2007051810中所描述的那些11-β-羟基固醇脱氢酶1(11β-HSD1)抑制剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与如例如WO200119830-31、WO200117516、WO2004506446、WO2005012295、WO2005116003、WO2005116003、WO2006007959、DE 10 2004 060542.4、WO2007009911、WO2007028145、WO2007081755中所描述的蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的抑制剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如KGA-2727、T-1095、SGL-0010、AVE 2268、SAR 7226以及舍格列净(sergliflozin)或如例如WO2004007517、WO200452903、WO200452902、PCT/EP2005/005959、WO2005085237、JP2004359630、WO2005121161、WO2006018150、WO2006035796、WO2006062224、WO2006058597、WO2006073197、WO2006080577、WO2006087997、WO2006108842、WO2007000445、WO2007014895、WO2007080170中或由A.L.Handlon in Expert Opin.Ther.Patents(2005)15(11),1531-1540所描述的钠依赖性葡萄糖转运体1或2(SGLT1、SGLT2)调节剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与如例如WO2007013689、WO2007033002中所描述的GPR40的调节剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与如例如WO2004041274中所描述的GPR119b的调节剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与如例如WO2005061489(PSN-632408)、WO2004065380、WO2007003960-62以及WO2007003964中所描述的GPR119的调节剂组合施用。

在另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与GPR120的调节剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与如例如WO2005073199、WO2006074957、WO2006087309、WO2006111321、WO2007042178中所描述的激素敏感性脂肪酶(HSL)和/或磷脂酶的抑制剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如WO199946262、WO200372197、WO2003072197、WO2005044814、WO2005108370、JP2006131559、WO2007011809、WO2007011811、WO2007013691中如所描述的那些乙酰辅酶A羧化酶(ACC)抑制剂组合施用。

在另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与黄嘌呤氧化还原酶(XOR)的调节剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如如WO2004074288中所描述的那些磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)抑制剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与如例如US2005222220、WO2005085230、WO2005111018、WO2003078403、WO2004022544、WO2003106410、WO2005058908、US2005038023、WO2005009997、US2005026984、WO2005000836、WO2004106343、EP1460075、WO2004014910、WO2003076442、WO2005087727或WO2004046117中所描述的糖原合酶激酶3β(GSK-3β)抑制剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与如例如WO2006072354中所描述的血清/糖皮质素调控激酶(SGK)抑制剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与如例如WO2007035355中所描述的RUP3受体激动剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如鲁伯斯塔(ruboxistaurin)等蛋白激酶Cβ(PKCβ)抑制剂组合施用。

在另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与编码共济失调毛细血管扩张突变(ATM)蛋白激酶的基因的激活剂(诸如氯喹)组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与诸如阿伏生坦(avosentan)(SPP-301)等内皮素A受体拮抗剂组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与如例如WO2001000610、WO2001030774、WO2004022553或WO2005097129中所描述的“I-κB激酶”抑制剂(IKK抑制剂)组合施用。

在一个实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与如例如WO2005090336、WO2006071609、WO2006135826中所描述的糖皮质素受体(GR)调节剂组合施用。

在另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与CART调节剂(参见"Cocaine-amphetamine-regulated transcript influences energy metabolism,anxiety andgastric emptying in mice"Asakawa,A.等:Hormone and Metabolic Research(2001),33(9),554-558)组合施用。

在另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与以下各项组合施用：NPY拮抗剂，诸如萘-1-磺酸{4-[(4-氨基喹唑啉-2-基氨基)甲基]环己基甲基}酰胺盐酸盐(CGP 71683A)；NPY-5受体拮抗剂，诸如L-152804或如例如WO2006001318中所描述；NPY-4受体拮抗剂，如例如WO2007038942中所描述；NPY-2受体拮抗剂，如例如WO2007038943中所描述；肽YY 3-36(PYY3-36)或类似化合物，诸如CJC-1682(经由Cys34与人血清白蛋白缀合的PYY3-36)、CJC-1643(在体内缀合至血清白蛋白的PYY3-36衍生物)或如WO2005080424、WO2006095166中所描述的那些；肽肥胖抑制素(obestatin)的衍生物，如WO2006096847中所描述；CB1R(大麻素受体1)拮抗剂(诸如利莫那班(rimonabant)、SR147778、SLV-319、AVE-1625、MK-0364或其盐或如例如EP 0656354、WO00/15609、WO2001/64632-64634、WO 02/076949、WO2005080345、WO2005080328、WO2005080343、WO2005075450、WO2005080357、WO200170700、WO2003026647-48、WO200302776、WO2003040107、WO2003007887、WO2003027069、美国专利号6,509,367、WO200132663、WO2003086288、WO2003087037、WO2004048317、WO2004058145、WO2003084930、WO2003084943、WO2004058744、WO2004013120、WO2004029204、WO2004035566、WO2004058249、WO2004058255、WO2004058727、WO2004069838、US20040214837、US20040214855、US20040214856、WO2004096209、WO2004096763、WO2004096794、WO2005000809、WO2004099157、US20040266845、WO2004110453、WO2004108728、WO2004000817、WO2005000820、US20050009870、WO200500974、WO2004111033-34、WO200411038-39、WO2005016286、WO2005007111、WO2005007628、US20050054679、WO2005027837、WO2005028456、WO2005063761-62、WO2005061509、WO2005077897、WO2006047516、WO2006060461、WO2006067428、WO2006067443、WO2006087480、WO2006087476、WO2006100208、WO2006106054、WO2006111849、WO2006113704、WO2007009705、WO2007017124、WO2007017126、WO2007018459、WO2007016460、WO2007020502、WO2007026215、WO2007028849、WO2007031720、WO2007031721、WO2007036945、WO2007038045、WO2007039740、US20070015810、WO2007046548、WO2007047737、WO2007084319、WO2007084450中所描述的那些化合物)；大麻素受体1/大麻素受体2(CB1/CB2)调节化合物，如例如WO2007001939、WO2007044215、WO2007047737中所描述；MC4激动剂(例如1-氨基-1,2,3,4-四氢萘-2-甲酸[2-(3a-苯甲基-2-甲基-3-氧代-2,3,3a,4,6,7-六氢吡唑并[4,3-c]吡啶--5-基)-1-(4-氯苯基)-2-氧代乙基]酰胺；(WO 01/91752))或LB53280、LB53279、LB53278或THIQ、MB243、RY764、CHIR-785、PT-141或WO2005060985、WO2005009950、WO2004087159、WO2004078717、WO2004078716、WO2004024720、US20050124652、WO2005051391、WO2004112793、WOUS20050222014、US20050176728、US20050164914、US20050124636、US20050130988、US20040167201、WO2004005324、WO2004037797、WO2005042516、WO2005040109、WO2005030797、US20040224901、WO200501921、WO200509184、WO2005000339、EP1460069、WO2005047253、WO2005047251、WO2005118573、EP1538159、WO2004072076、WO2004072077、WO2006021655-57、WO2007009894、WO2007015162、WO2007041061、WO2007041052中所描述的那些；食欲素受体拮抗剂(例如1-(2-甲基苯并噁唑-6-基)-3-[1,5]萘啶-4-基脲盐酸盐(SB-334867-A)或如例如WO200196302、WO200185693、WO2004085403、WO2005075458或WO2006067224中所描述的那些)；组胺H3受体激动剂(例如3-环己基-1-(4,4-二甲基-1,4,6,7-四氢咪唑并[4,5-c]吡啶-5-基-)丙-1-酮草酸盐(WO 00/63208)或如WO200064884、WO2005082893、WO2006107661、WO2007003804、WO2007016496、WO2007020213中所描述的那些)；组胺H1/组胺H3调节剂，诸如倍他司汀(betahistine)和其二盐酸盐；CRF拮抗剂(例如[2-甲基-9-(2,4,6-三甲基苯基)-9H-1,3,9-三氮杂芴-4-基]二丙基-胺(WO 00/66585))；CRF BP拮抗剂(例如尿皮素)；尿皮素激动剂；β-3肾上腺素受体的激动剂，诸如1-(4-氯-3-甲磺酰基甲基苯基)-2-[2-(2,3-二甲基-1H-吲哚-6--基氧基)乙氨基]乙醇盐酸盐(WO 01/83451)；或索拉贝隆(Solabegron)(GW-427353)或N-5984(KRP-204)或JP2006111553、WO2002038543、WO2007048840-843中所描述的那些；MSH(黑素细胞刺激激素)激动剂；MCH(黑色素浓集激素)受体拮抗剂(诸如NBI-845、A-761、A-665798、A-798、ATC-0175、T-226296、T-71、GW-803430或诸如WO2005085200、WO2005019240、WO2004011438、WO2004012648、WO2003015769、WO2004072025、WO2005070898、WO2005070925、WO2004039780、WO2004092181、WO2003033476、WO2002006245、WO2002089729、WO2002002744、WO2003004027、FR2868780、WO2006010446、WO2006038680、WO2006044293、WO2006044174、JP2006176443、WO2006018280、WO2006018279、WO2006118320、WO2006130075、WO2007018248、WO2007012661、WO2007029847、WO2007024004、WO2007039462、WO2007042660、WO2007042668、WO2007042669、US2007093508、US2007093509、WO2007048802、JP2007091649中所描述的化合物)；CCK-A激动剂(诸如{2-[4-(4-氯-2,5-二甲氧基苯基)-5-(2-环己基乙基)噻唑-2-基氨基甲酰基]-5,7-二甲基吲哚-1-基}乙酸三氟乙酸盐(WO 99/15525)、SR-146131(WO 0244150)或SSR-125180或如WO2005116034中所描述的那些)；混合羟色胺能和去甲肾上腺素能化合物(例如WO 00/71549)；5-HT受体激动剂，例如1-(3-乙基苯并呋喃-7-基)哌嗪草酸盐(WO 01/09111)；混合多巴胺/降肾上腺素/乙酰胆碱再摄取抑制剂(例如特索芬辛(tesofensine))；5-HT2C受体激动剂(诸如盐酸洛卡舍林(lorcaserinhydrochloride)(APD-356)、BVT-933或如WO200077010、WO20077001-02、WO2005019180、WO2003064423、WO200242304、WO2005035533、WO2005082859、WO2006077025、WO2006103511中所描述的那些)；5-HT6受体拮抗剂，诸如E-6837或BVT-74316或如例如WO2005058858、WO2007054257中所描述的那些；铃蟾素受体激动剂(BRS-3激动剂)；甘丙肽受体拮抗剂；生长激素(例如人生长激素或AOD-9604)；释放生长激素的化合物(6-苯甲基氧基-1-(2-二异丙基-氨基乙基氨基甲酰基)-3,4-二氢-1H-异喹啉-2-甲酸叔丁酯(WO 01/85695))；生长激素促分泌受体拮抗剂(饥饿肽拮抗剂)，诸如A-778193或如WO2005030734中所描述的那些；TRH激动剂(参见例如EP 0 462 884)；解偶联蛋白2或3调节剂；瘦素激动剂(参见例如Lee,Daniel W.；Leinung,Matthew C.；Rozhayskaya-Arena,Marina；Grasso,Patricia.Leptinagonists as a potential approach to the treatment of obesity.Drugs of theFuture(2001),26(9),873-881)；DA激动剂(溴隐亭(bromocriptine)或Doprexin)；脂酶/淀粉酶抑制剂(例如WO 00/40569)；二酰基甘油O-酰基转移酶(DGAT)的抑制剂，诸如BAY-74-4113或如例如US2004/0224997、WO2004094618、WO200058491、WO2005044250、WO2005072740、JP2005206492、WO2005013907、WO2006004200、WO2006019020、WO2006064189、WO2006082952、WO2006120125、WO2006113919、WO2006134317、WO2007016538中所描述；脂肪酸合酶(FAS)的抑制剂，诸如C75或如WO2004005277中所描述的那些；硬脂酰基辅酶A δ9去饱和酶(SCD1)的抑制剂，如例如WO2007009236、WO2007044085、WO2007046867、WO2007046868、WO20070501124中所描述；胃泌酸调节素；油酰基-雌激素酮或甲状腺激素受体激动剂或部分激动剂，诸如：KB-2115或如WO20058279、WO200172692、WO200194293、WO2003084915、WO2004018421、WO2005092316、WO2007003419、WO2007009913、WO2007039125中所描述的那些。

在另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与酒石酸伐仑克林(vareniclinetartrate)(α4-β2烟碱乙酰胆碱受体的一种部分激动剂)组合施用。

在另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与曲度奎明(trodusquemine)组合施用。

在另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与SIRT1酶的调节剂组合施用。

在另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与右旋安非他明(dexamphetamine)或安非他明(amphetamine)组合施用。

在另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与芬氟拉明(fenfluramine)或右芬氟拉明(dexfenfluramine)组合施用。

在另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与西布曲明(sibutramine)组合施用。

在另一实施方案中，将含甘氨酸的三肽分子与马吲哚(mazindole)或苯丁胺组合施用。

或者，含甘氨酸的三肽分子多肽治疗以数分钟至数周范围内的间隔位于第二剂治疗之前或之后。在第二治疗剂和含甘氨酸的三肽分子分开施用的实施方案中，将通常确保各递送时间之间不超过显著时间段，使得第二剂和含甘氨酸的三肽分子将仍能够发挥有利组合效应。在此类情况下，预期在距离彼此约12-24小时内并且在一个方面中在距离彼此约6-12小时内施用两种模式，延迟时间为仅约12小时为最优选的。在一些情况下，需要延长时间段以进行显著治疗，然而，其中相应施用之间过去了若干天(2、3、4、5、6或7天)至若干周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。

在一些实施方案中，用于治疗代谢疾病(例如脂肪肝病)的方法可包括施用含甘氨酸的三肽分子和第二治疗剂，例如ACC抑制剂、ApoC-III抑制剂、ACL-抑制剂、处方鱼油或CETP抑制剂。

向患者全身递送含甘氨酸的三肽分子表达构建体或肽为一种非常高效的递送治疗有效组合物以抵消疾病的立即临床表现的方法。或者，在某些情况下局部递送含甘氨酸的三肽分子和/或第二治疗剂为适当的。

本发明还提供了向哺乳动物施用本发明的组合物的方法。在一个方面中，哺乳动物为人。治疗上所要采用的组合物的有效量将例如取决于治疗背景和目标。本领域技术人员将了解，用于治疗的适当剂量水平因此将部分根据所递送的分子、使用组合物所用于的适应症、施用途径以及患者的体型(体重、身体表面或器官大小)和状况(年龄和总体健康)而变化。因此，临床医师可滴定剂量并且修改施用途径以获得最佳治疗效果。

在一个方面中，用于向哺乳动物递送包含含甘氨酸的三肽分子或其药学上可接受的盐的组合物的方案将包括施用5mg/Kg至2000mg/Kg，或30mg/Kg至1500mg/Kg，或40mg/Kg至1250mg/Kg，或50mg/Kg至1000mg/Kg，或60mg/Kg至5000mg/Kg，以日剂量或以更长或更短的间隔以等效剂量给予，例如每隔一天一次、每周两次、每周一次、每月一次、半每年一次或甚至每天两次或三次。施用可为经口、静脉内、皮下、鼻内、吸入、经真皮、经粘膜或通过本文论述的任何其他途径。

在另一方面中，以本文指定的剂量通过皮下注射施用含甘氨酸的三肽分子。然而，可通过本文论述和如本领域中已知的方法中的任一者来施用含甘氨酸的三肽分子。在另一方面中，在单一位点注射具有2.0ml的最大可容许体积。如果需要更大浓度的含甘氨酸的三肽分子，那么预期可在多个位点或以更大的剂量注射含甘氨酸的三肽分子。在另一方面中，每天在大致相同的时间施用含甘氨酸的三肽分子。然而，本发明中包括替代递送时间。

还可选择药物组合物用于肠胃外递送。或者，可选择组合物用于吸入或用于通过消化道(诸如经口)递送。此类药学上可接受的组合物的制备在本领域技术范围内。

在一个实施方案中，可将药物组合物配制成用于吸入。举例来说，可将含甘氨酸的三肽分子组合物配制成用于吸入的干燥粉末。还可将药物组合物吸入溶液与喷射剂一起配制用于气溶胶递送。在另一实施方案中，可使溶液雾化。PCT申请号PCT/US94/001875中进一步描述了经肺施用，所述申请描述了化学修饰蛋白的经肺递送。

还预期某些制剂可经口施用。在本发明的一个实施方案中，可在存在或不存在固体剂型(诸如片剂和胶囊)的混配中惯用的那些载体的情况下对以此方式施用的含甘氨酸的三肽分子组合物进行配制。举例来说，可将胶囊设计成在胃肠道中生物可用性最大化并且全身前降解最小化的点释放制剂的活性部分。可包括其他剂以有助于组合物的吸收。还可采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂以及结合剂。

另一含甘氨酸的三肽分子组合物可涉及有效量的含甘氨酸的三肽分子与适合于制造片剂的无毒赋形剂的混合物。通过将片剂溶解于无菌水或其他适当媒介物中，可将溶液制备成单位剂型。适合的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢盐、乳糖或磷酸钙；或结合剂，诸如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。

其他含甘氨酸的三肽分子组合物对本领域技术人员来说将为显而易见的，包括涉及持续或控制递送制剂中的组合物的制剂。用于配制多种其他持续或控制递送构件(诸如脂质体或胶束载体、可生物蚀解微粒或多孔珠粒以及贮库注射剂)的技术也是本领域技术人员已知的。

投药频率取决于所用制剂中的含甘氨酸的三肽分子组合物的药代动力学参数。典型地，临床医师将施用组合物直至达到实现所需效应的剂量。因此可以单个剂量，或随时间推移以两个或更多个剂量(所述剂量可能含或可能不含相同量的所需分子)，或经由植入装置或导管以连续输注形式施用组合物。适当剂量的进一步细化常规地由本领域一般技术人员进行并且在他们常规进行的任务范围内。可通过使用适当剂量反应数据来确定适当剂量。

除本文所公开的施用途径之外，可通过任何模式在哺乳动物中将本发明的组合物引入治疗，诸如但不限于静脉内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉内、病损内途径、关节内、肿瘤内、经脑脊髓、直肠内和经结肠、经表面、结膜下、膀胱内、阴道内、硬膜外、颅内、真皮内、经吸入、经真皮、经浆膜、颊内、经口、鼻内、溶解于口中或其他体腔中、滴注至气道、通过气道吹入、注射至脉管、肿瘤、器官等以及注射或沉淀至哺乳动物的体内空腔中。

替代地或另外，可经由植入膜、海绵或已吸收或囊封所需分子的另一适当材料局部施用组合物。在使用植入装置的情况下，可将装置植入任何适合的组织或器官中，并且可经由扩散、延时释放推注或连续施用递送所需分子。

在一些情况下，可能需要以离体方式使用组合物。在此类情况下，使已从患者移除的细胞、组织或器官暴露于组合物，随后将细胞、组织和/或器官移植回患者中。

本发明的组合物的施用可使用若干标准方法中的任一者，包括例如连续输注、快速注射、间歇性输注、吸入或这些方法的组合来进行。举例来说，一种可使用的施用模式涉及连续静脉内输注。在此类方法中，本发明组合物的输注剂量率可为例如每小时每千克体重0.001-0.5mg，更优选每小时每千克0.01-0.2mg以及最优选每小时每千克0.03-0.1mg，药物历经例如1-100、10-100或约12、24、48、72、84或96小时的过程进行输注。如果需要，那么本发明组合物的输注前面可为快速注射。以在约0.001至约10mg/kg范围内的剂量给予此类快速注射。本发明组合物的剂量和输注时间段可发生变化并且也包括在本发明中。

可使用注射器通过经例如中心接入管或周围静脉管进行的静脉内输注或通过直接注射给予单一快速注射。如果患者仅处于短期暴露于内毒素的风险中并且因此不需要延长的药物持久性，那么此类施用可为所需的。举例来说，如果适当，那么在手术患者中此施用模式可为所需的，诸如具有心脏手术(例如冠状动脉旁路移植手术和/或瓣膜替换手术)的患者。在这些患者中，可在手术之前和/或期间历经四小时的时间施以药物的单一快速输注。(注意，施用的药物量是基于患者的体重和状况并且由熟练从业者确定。)如由本领域技术人员确定为适当的，可使用更短或更长时间段的施用。

在需要更长期递送本发明的甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐的情况下，可进行间歇性施用。在这些方法中，如由本领域技术人员确定为适当的，施用加载剂量，随后施用(i)第二加载剂量和一个维持剂量(或多个维持剂量)，或(ii)一个或多个维持剂量，没有第二加载剂量。

为实现在患者中进一步递送甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐，可施用一个或多个维持剂量的化合物，使得患者血液中化合物的水平得以维持。可以小于所述一个或多个加载剂量的水平，例如以加载剂量的约1/6的水平施用维持剂量。维持剂量中施用的具体量可由医学专业人员确定，目标为至少维持化合物水平。可例如从第24小时开始每12小时施用维持剂量约2小时并且在例如第36小时、第48小时、第60小时、第72小时、第84小时、第96小时、第108小时以及第120小时继续施用。当然，如由医学专业人员所确定为适当的，可在此时间范围内的任何点停止维持剂量。

上文所描述的输注方法可使用导管(例如周围静脉、中心静脉或肺动脉导管)和本领域中广泛可获得的相关产品(例如输注泵和管)来进行。在选择用于这些方法中的导管和/或管时要考虑的一个重要准则为这些产品(或这些产品上的涂层)的材料对药物尺寸的影响。

可用于本发明方法中的其他导管相关产品可通过确定在与药物施用中所用的条件一致的条件下产品的材料是否改变化合物的尺寸来鉴定。此外，在患者已在不维持最佳药物尺寸的位置具有导管的情况下，可使用由相容材料(例如聚酰胺聚合物)制成或包括相容涂层的导管插入物，使得药物溶液不接触不相容导管的表面。此类插入物具有小到足以使它能够容易地插入现有导管的外径，同时维持大到足以容纳化合物的溶液流的内径，它被放置于现有导管内并且连接至用于递送药物的管或注射器。

适当的施用频率可由本领域技术人员确定并且可每天施用一次至若干次。本发明的组合物还可每天施用一次或每隔一天施用一次。在急性施用的情况下，治疗典型地进行数小时或数天的时间，而慢性治疗可进行数周、数月或甚至数年。

慢性与急性施用均可采用标准肝门施用制剂，所述标准肝门施用制剂可由本文别处所描述的制剂制成。通过此途径施用提供了若干优点，例如通过将甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐以较高局部浓度施用至所需作用位点使得快速发生作用。为使治疗剂部分发挥其所需效应，它需要与它的生理靶标(诸如存在于肝细胞上的受体)物理接触。位点特异性药物递送确保此类相互作用仅在肝脏的所需解剖学位置进行；因此，它必须满足以下准则：(i)它必须能够穿过解剖学屏障，诸如胃和肠的那些屏障，(ii)应由存在于肝脏细胞上的受体(诸如脱唾液酸糖蛋白)选择性识别，(iii)外源递送的用于靶向的配体应与内源产生的配体竞争，(iv)制作的递送系统必须为无毒的、生物相容的、可生物降解的并且在体内或体外在肝细胞中为物理化学稳定的，(v)它应具有均匀的窦状毛细管分布，(vi)应具有可控制并且可预测的药物释放速率，使得仅治疗量的甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐释放至肝细胞，(vii)药物释放不应影响药物分布，(viii)它应在其穿过胃、肠道以及其他身体部分期间显示最小药物漏失，(ix)用于封装甘氨酸三肽分子的载体必须从身体消除，而不产生任何毒性迹象并且载体不应诱导患病状态的调节，以及(x)最后，甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐递送系统的制备应为容易的或适当简单的、可重现的并且成本有效的。

甘氨酸三肽分子或其药学上可接受的盐可作为用于肝组织递送的药物递送系统的一部分而施用。用于使含甘氨酸的三肽分子偶联至肝脏特异性靶向部分的不同方法可包括：(a)使靶向部分偶联于预成形的纳米载体上，(b)通过插入后法偶联靶向部分，(c)通过亲和素/生物素复合物偶联靶向部分，(d)在纳米载体配制之前偶联靶向部分。NidhiMishra等，(2013)“Efficient Hepatic Delivery of Drugs：Novel Strategies andTheir Significance”，BioMed Research International，BioMed ResearchInternational，第2013卷中描述了可用于将本发明的组合物递送至特定肝细胞的例示性靶向部分和载体，所述文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

虽然已根据某些实施方案特定地描述了本文所描述的某些甘氨酸三肽分子和其药学上可接受的盐、组合物和方法，但以下实施例仅用于说明本文所描述的化合物并且不旨在对其进行限制。本申请中所叙述的参考文献各自以全文引用的方式并入本文中。

实施例

方法

动物程序

所有动物程序由密歇根大学机构动物护理和使用委员会(Institutional AnimalCare&Use Committee of the University of Michigan)批准(PRO00008239)并且根据机构指南进行。从Jackson Laboratories获得八周龄雄性载脂蛋白E缺陷型(apoE-/-)小鼠(B6.129P2-Apoetm1Unc/J，储备号：002052)。为小鼠饲喂西方膳食(WD，按重量计，42％的卡路里来自脂肪和0.2％胆固醇，Envigo TD.88137)。一周的WD饲喂之后，从面部静脉小心地收集血液以测定总胆固醇(TC)的基线血浆水平。然后，使小鼠维持WD饲喂并且随机分成5个实验组并且经由口服灌胃施以以下治疗，每周6次持续12周的时间：1)WD+H

OGTT和非空腹血糖

在第10周，在过夜空腹之后通过经由口服灌胃施用2mg/g的葡萄糖进行口服葡萄糖耐受性测试(OGTT)。为评估治疗的急性效应，将甘氨酸(0.67mg/g)、亮氨酸(0.33mg/g)、DT-109或DT-110(1mg/g)添加至葡萄糖溶液中并且经由口服灌胃施用。为评估治疗的慢性效应，单独为小鼠施用葡萄糖。在从尾巴端部收集血液之后使用血糖仪和测试条(NDC：0193-7308-50，Contour Next)测量基线葡萄糖水平。然后，在进行(急性)或不进行(慢性)治疗的情况下为小鼠施用葡萄糖并且每30min测量血糖水平，持续长达120min。为评估治疗对非空腹血糖水平的影响，在经由口服灌胃常规地施以治疗之前(灌胃前)和之后30min(灌胃后)从尾巴端部收集血液。使用血糖仪和测试条(NDC：0193-7308-50，Contour Next)测定葡萄糖水平。

血浆脂质、脂肪因子以及细胞因子

在密歇根糖尿病研究中心(Michigan Diabetes Research Center，MDRC)的化学实验室使用Cobas Mira化学分析仪(Roche Diagnostics)使用制造商提供的分析试剂和方案测量TC、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)以及高密度脂蛋白胆固醇(HDL)的血浆水平。在MDRC的化学实验室使用Luminex 200化学分析仪(Luminex Corporation)使用制造商提供的分析试剂和方案(Millipore Multiplex，MMHMAG-44K)测量甘氨酸三肽分子、抵抗素、白介素-6(IL-6)以及单核细胞趋化蛋白-1(MCP1)的血浆水平。

组织学分析

由密歇根大学的实验室动物医学单元(Unit for Laboratory Animal Medicine，ULAM)内的体内动物中心(In Vivo Animal Core，IVAC)组织学实验室进行组织学加工。通过分级乙醇对福尔马林固定的组织进行加工并且用二甲苯透明化，随后使用自动化VIP5或VIP6组织处理器(TissueTek,Sakura-Americas)用熔解的石蜡渗透。在使用Histostar包埋站(ThermoFisher Scientific)进行石蜡包埋之后，在M 355S轮转切片机(ThermoFisherScientific)上以4μm厚度对组织进行切片并且安装于载玻片上。在脱蜡以及使用二甲苯和分级乙醇水合之后，针对苏木精和曙红(H&E)使用哈里斯苏木精(ThermoFisherScientific，目录号842)将载玻片染色，用透明剂(ThermoFisher Scientific，目录号7401)透明化，用蓝化试剂(ThermoFisher Scientific，目录号7301)蓝化，用酒精性伊红Y(eosin Y)(ThermoFisher Scientific，目录号832)染色，然后脱水并且通过分级乙醇和二甲苯透明化并且使用Leica CV5030自动盖片机用显微载片(Micromount)(Leica目录号3801731)盖片。在IntelliPATH FLX自动化免疫组织化学染色器(Biocare Medical，目录号IPS0001US)上进行免疫组织化学染色，并且包括阻断内源性过氧化物酶和非特异性结合，使用基于不含辣根过氧化物酶生物素的聚合物的商业检测系统检测，使用二氨基联苯胺色原揭示，以及使用苏木精进行核复染。特定于F4/80(Bio-Rad ABD Serotec，目录号MCA497)，将大鼠单克隆第一抗体(克隆CI:A3-1)在DaVinci稀释剂(Biocare Medical，目录号PD900)中稀释至1:400并且孵育60min，随后使用大鼠基于小鼠HRP-聚合物(BiocareMedical，目录号RT517)2步探针聚合物分别孵育10和30min进行检测。

RNA分离、逆转录以及定量聚合酶链反应(qPCR)

使用QIAGEN的RNeasy试剂盒(QIAGEN)提取肝脏或脂肪组织样品的总RNA。使用SuperScript III和随机引物(Invitrogen)将RNA逆转录至cDNA中。通过使用iQ SYBR绿色超混物(Bio-Rad)的实时PCR系统(Bio-Rad)以及ΔΔCt阈值循环规范化方法来评估特定转录物水平。针对3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)对基因表达水平进行规范化。从IntegratedDNA Technologies获得用于qPCR的引物对并且列举如下：

肝脂质提取

从安乐死的小鼠快速移除肝脏并且保持在-80℃下。将冷冻肝脏样品(约100mg)在PBS中均质化并且离心(14,000RPM，20min)。收集上清液并且通过Bio-Rad布拉德福分析(Bradford assay)对蛋白质含量进行分析。为评估肝脏脂质组成，使用3:2比率(v:v)的己烷(≥99％，32293，Sigma-Aldrich)和异丙醇(≥99.5％，A426-4，Fisher Scientific)从上清液提取脂质，并且使己烷相蒸发48h。使用可商购获得的试剂盒(Wako Chemicals)以分光光度法测定肝脏TG或TC的量。针对蛋白质水平对数据进行规范化并且呈现为每毫克蛋白质的TG或TC微克数。

肝蛋白质萃取和蛋白质印迹法

使用补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche Applied Science)的放射免疫沉淀分析溶解缓冲液(RIPA缓冲液，Thermo Scientific)制备组织提取物。在10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中对蛋白质进行拆分并且转移至硝基纤维素膜(Bio-Rad)。将膜在室温下在含有5％脱脂乳的tris-缓冲盐水-吐温20(Tween 20)(TBST)中阻断1小时并且与第一抗体一起在4℃下孵育过夜。使用以下第一抗体：兔多克隆抗ABCG8(Santa CruzBiotechnology，sc-30111，工作稀释1:1000)和兔多克隆抗β-肌动蛋白(Cell signaling，4967S，工作稀释1:3000)。在TBST洗涤之后，将膜与第二抗体(LI-COR Biotechnology，驴抗兔IRDye 926-32213、926-68073，工作稀释1:10000)一起在室温下孵育1小时。在TBST洗涤之后，对条带进行目视观察并且使用奥德赛红外成像系统(Odyssey Infrared ImagingSystem)(LI-COR Biosciences，2.1版)定量。

动脉粥样硬化病变的分析

收集血液之后，通过心脏为小鼠灌注20mL的盐水溶液，随后灌注20mL的37％福尔马林。将小鼠用福尔马林固定并且在手术显微镜下解剖整个主动脉树。接下来，将主动脉树用油红O溶液(含0.2％油红O(w/v)的3.5:1的甲醇:1N NaOH)染色50min，随后使用70％乙醇持续30min。然后使主动脉树保持在DDW中。然后，清除主动脉树中的附着脂肪和结缔组织，并且用维纳斯剪刀(Vannas scissor)纵向打开以暴露动脉粥样硬化病变。使用数码相机获得整个主动脉树的图像，并且使用ImageJ分析软件(http://imagej.nih.gov/ij/)定量相对于总管腔表面积由油红O染色的斑块面积的百分比。

统计分析

使用SPSS 24.0软件(SPSS Inc.IBM)进行数据分析。将数据呈现为盒须图或平均值±SEM。对于各FIGFIG.图例，指定各研究中所用动物的数目。将单向方差分析(ANOVA)继之以图基事后检验(Tukey post hoc test)用于数据分析。在p<0.05下将差异视为统计显著的。

结果

实验1对体重和肥胖的影响

图1A中展示了实验设计。对apoE-/-小鼠进行一周的西方膳食(WD)饲喂之后，从面部静脉(FV)收集血液以测定TC的基线血浆水平。然后，使小鼠维持WD饲喂并且随机分成5个实验组，经由口服灌胃施以以下治疗，每周6次持续12周的时间：1)WD+H

实验2对葡萄糖稳态的影响

在WD饲喂的第10周，在过夜空腹之后进行OGTT。为测定治疗对血糖水平的急性效应，将甘氨酸(0.67mg/g)、亮氨酸(0.33mg/g)、DT-109或DT-110(1mg/g)添加至葡萄糖溶液(2mg/g)中并且经由口服灌胃施用。如图2A中所示，注意到在基线处各组之间的血糖水平没有显著差异。在存在或不存在治疗的情况下施用葡萄糖起30min之后，通过所有治疗血糖水平均明显降低，其中甘氨酸或DT-109的效应最显著。在随后的时间点(60-120min)，在用甘氨酸、DT-109以及DT-110治疗的小鼠中血糖水平显著降低，但在亮氨酸情况下未显著降低。为评估治疗的慢性效应，在WD饲喂的第11周重复OGTT，这次没有将治疗物添加至葡萄糖溶液中。在没有治疗的情况下在葡萄糖加载之后在各组之间没有注意到显著差异(图2B)。为评估治疗对非空腹血糖水平的影响，在经由口服灌胃常规地施以治疗之前(灌胃前)和之后30min(灌胃后)收集血液。与对照小鼠相比，在所有组中灌胃前葡萄糖水平显著更低。然而，尽管使用水或亮氨酸进行口服灌胃产生血糖增加的倾向，但使用甘氨酸、DT-109或DT-110进行口服灌胃使血糖水平显著降低(分别降低10％，p<0.05，21％，p<0.01或13％，p<0.05，图2C)。最后，在用甘氨酸或DT-109治疗的小鼠中，终点葡萄糖水平(在6h空腹后)显著更低(分别低41％，p<0.01或30％，％，p<0.05，图2D)。肝基因表达的分析表明通过甘氨酸治疗，调控葡萄糖摄入的基因(GLUT1、GLUT2以及GLUT4)上调，而调控糖异生的基因(G6pc、PCK1以及FBP1)的表达没有显著变化。在用DT-110治疗的小鼠的肝脏中还明显诱导了GLUT1表达(图2E)。总的来说，这些结果指示甘氨酸、DT-109以及DT-110的明显的降餐后葡萄糖特性。

实验3对肝脂质代谢的影响

肝脏样品的H&E染色揭示了在对照小鼠中以及施用亮氨酸的小鼠中明显的小泡性和大泡性脂肪变性。显著地，用甘氨酸、DT-109或用DT-110治疗消除了WD诱发的肝性脂肪变性(图3A)。因此，肝脂质的提取继之以TG和TC含量的定量表明用甘氨酸、DT-109或用DT-110治疗使肝TG(分别降低74％、73％或68％，p<0.01，图3B)和TC(分别76％、71％，p<0.01，或63％，p<0.01，图3C)显著降低，而在亮氨酸施用中没有显著效应。

实验4接下来评估肝脏中调控TG、脂肪酸以及胆固醇累积的基因的表达以解释所观测到的对肝性脂肪变性的影响。有趣的是，用甘氨酸、DT-109或DT-110治疗显著诱导肝脂质氧化的主调控因子(AMPKα1和PPARα)的表达，但在亮氨酸情况下并未显著诱导(图4A)。因此，在用甘氨酸、DT-109或DT-110治疗的小鼠的肝脏中，调控TG水解(PNPLA2)、线粒体β-氧化(CPT1a、CACT、ACADl)以及线粒体阴离子载体UCP2的主要靶基因显著上调(图4A、图4B)。就调控肝脏中的胆固醇稳态的基因来说，用甘氨酸、DT-109或DT-110治疗使ABCG5和ABCG8(胆固醇排泄至胆汁中的主要调控因子)的表达显著增加。在用DT-110治疗的小鼠的肝脏中发现LDLR的显著上调，甘氨酸和DT-109治疗的趋势类似(图4C)。通过蛋白质印迹确认了在用甘氨酸、DT-109或DT-110治疗的小鼠的肝脏中ABCG8的过表达(图4D和图4E)。总的说来，这些结果突出显示了甘氨酸、DT-109以及DT-110对与调控脂质氧化和胆固醇提取至胆汁中的基因的过表达有关的WD诱发的肝性脂肪变性的有效保护作用。

实验5对血浆脂质型态和动脉粥样硬化的影响

在随机化至实验组中之前，在一周的WD饲喂之后从小鼠收集血液以测定基线血浆TC水平。在与治疗或水对照一起进行12周的WD饲喂之后，在终点处再次测量血浆TC。如图5A中所示，通过用甘氨酸或DT-109治疗，时间依赖性血浆TC增加显著减轻，DT-110治疗中的趋势类似，但亮氨酸治疗中并不如此。因此，在用甘氨酸或DT-109治疗的小鼠中TC和LDL的终点血浆水平显著降低(TC：分别降低19％，p<0.05或25％，p<0.01；LDL：分别降低30％，p<0.01或36％，p<0.01)，DT-110治疗中具有类似趋势(图5B、图5C)。有趣的是，在用甘氨酸治疗的小鼠中血浆HDL水平显著更低(低35％，p<0.05)，但通过DT-109治疗得到保持(图5D)。注意到血浆TG水平没有显著变化(图5E)。最后，通过油红O染色进行的正面主动脉病变的分析揭示了在用甘氨酸、DT-109或DT-110治疗的小鼠中总动脉粥样硬化斑块显著减少(分别减少48％，p<0.01，62％，p<0.001或49％，p<0.01，图5F、图5G)，但在用亮氨酸治疗的小鼠中未显著减少。

实验6对全身炎症、肝炎以及脂肪组织炎症的影响

由于炎症在NAFLD与动脉粥样硬化的发病机理中发挥主要作用，所以接下来评估促炎性细胞因子和脂肪因子的血浆水平。尽管在各组之间关于IL-6和抵抗素的血浆水平没有注意到显著变化(图6A、图6B)，但在用甘氨酸、DT-109或DT-110治疗的小鼠中MCP1水平显著降低(图6C)。附睾脂肪组织(EAT)中以及皮下脂肪组织(SAT)中的基因表达的分析揭示了通过所有治疗在EAT中TNFα显著下调，其中DT-110的效应最显著(图6D)。根据较低的MCP1血浆水平，通过用甘氨酸、DT-109或DT-110治疗，在EAR中与SAT中MCP1表达显著受阻，但在亮氨酸情况下未显著受阻(图6D、图6E)。最后，虽然甘氨酸抑制了肝脏中的MCP1表达(DT-109具有类似趋势，图7A)，但注意到在通过免疫组织化学测定的组织F4/80中没有显著变化(图7B、图7C)。总的说来，这些结果表明甘氨酸、DT-109以及DT-110的一些消炎效应主要与脂肪组织中以及循环中MCP1的抑制相关。

实施例x针对NAFLD的基于甘氨酸的治疗

A.引言

NAFLD为最常见的慢性肝病，影响全世界25％的人口。NAFLD涵盖在肝性脂肪变性(HS)、以肝细胞损害和小叶炎症结合纤维化进展为特征的NASH以及可能会导致肝衰竭或肝细胞癌的肝硬化范围内的一系列肝脏病变。心血管代谢共病，包括肥胖症、2型糖尿病(T2D)、代谢综合征(MetS)以及血脂异常，在NAFLD患者中为普遍的。除肝特异性致死外，心血管疾病为NAFLD患者死亡的主要原因，特别是在NASH情况下。尽管NAFLD的全球负荷极重并且在药物开发方面进行了大量努力，但迄今为止尚没有疗法被批准。

特别是代谢组学和肠道微生物群的新发展加深了我们对NAFLD发病机理的了解，从而提出新的治疗靶标。尽管已知脂质和碳水化合物代谢异常与NAFLD有关，但当前基于代谢组学的研究表明特定氨基酸(AA)的代谢失调在NAFLD发病机理中起作用。具体地说，虽然在NAFLD患者中大多数循环AA有所增加，但甘氨酸水平降低。循环甘氨酸水平与HS、肝细胞气球样变以及小叶炎症的水平负相关。最近将血浆甘氨酸与已知生物标记物(例如天冬氨酸盐-转氨酶(AST)和PNPLA3基因型)一起包括在模型中以预测NASH。较低的血浆甘氨酸与较高的肥胖症、T2D、MetS、冠心病以及心肌梗塞发病率相关，而较高的血浆甘氨酸与有利的脂质型态相关(概括于表S1中)。

表S1.将较低的循环甘氨酸与NAFLD和心血管代谢疾病相关联的先前临床证据

作为一种非必需AA，甘氨酸是由主要在肝脏中的若干前体合成的。这些反应由驱使从丝氨酸(丝氨酸羟甲基转移酶，SHMT)、苏氨酸(苏氨酸脱氨酶，TDH)、胆碱经由肌氨酸(胆碱脱氢酶，CHDH；肌氨酸脱氢酶，SARDH)以及从丙氨酸到乙醛酸(AGXT)形成甘氨酸的关键酶催化。多个路径中使用甘氨酸来产生必需分子，包括核酸、血红素以及谷胱甘肽。在NAFLD或T2D中，谷胱甘肽合成因有限的甘氨酸可获得性而减少并且在膳食补充后恢复。除此抗氧化剂作用外，甘氨酸还在脂质和葡萄糖代谢中具有双重益处。甘氨酸摄取部分通过刺激胰腺β-细胞的胰岛素分泌而降低血糖。在基因肥胖/糖尿病KK-A

考虑NAFLD负荷、缺乏可获得的疗法以及使较低循环甘氨酸与NAFLD严重程度相关联的一致报道，有充足的理由更好地理解NAFLD中的甘氨酸代谢，这可产生新颖的治疗剂。在本文中，我们确定了在人和鼠NAFLD中甘氨酸生物合成基因(主要是AGXT1)的抑制。应用基因(AGXT1

B.缩写：

AA，氨基酸；ACAA，乙酰辅酶A酰基转移酶；ACAD，酰基辅酶A脱氢酶；ACOT，酰基辅酶A硫酯酶；ACOX，酰基辅酶A氧化酶；ACSL，酰基辅酶A合成酶长链；ACSM，酰基辅酶A合成酶中链；AGXT，丙氨酸-乙醛酸转氨酶；ALP，碱性磷酸酶；ALT，丙氨酸转氨酶；ApoE，载脂蛋白E；AST，天冬氨酸转氨酶；CACT，肉毒碱/酰基肉碱移位酶；Cas9，CRISPR相关蛋白9；CCL，C-C基序趋化因子配体；CCR，C-C基序趋化因子受体；CD，普通饮食；CHD，冠心病；CLAMS，综合实验室动物监测系统；CPT，肉毒碱棕榈酰基转移酶；CRISPR，成簇规律间隔短回文重复；DAG，二酰基甘油；DAO，D-氨基酸氧化酶；DEG，差异表达基因；ECI，烯酰基辅酶Aδ异构酶；FA，脂肪酸；FAO，脂肪酸β-氧化；HADH，羟酰基辅酶A脱氢酶；HS，肝性脂肪变性；LDA，线性判别分析；LEfSe，线性判别分析效应大小；MCP-1，单核细胞趋化蛋白-1；MetS，代谢综合征；NAFLD，非酒精性脂肪肝病；NASH，非酒精性脂肪性肝炎；NF-κB，激活B细胞的核因子κ-轻链-增强子；NMR，核磁共振；OGTT，口服葡萄糖耐受性测试；ORO，油红O；PGC1α，PPARG-共激活剂-1α(PPARGC1A)；PNPLA，含patatin样磷脂酶结构域的蛋白质；PPAR，过氧物酶体增殖物激活受体；RER，呼吸交换率；SARDH，肌氨酸脱氢酶；SERPINE，丝氨酸肽酶抑制因子E支(serinepeptidase inhibitor clade E)；SHMT，丝氨酸羟甲基转移酶；T2D，2型糖尿病；TC，总胆固醇；TDH，苏氨酸脱氨酶；TG，甘油三酯；TGFBR，转化生长因子β受体；TGFβ，转化生长因子-β；TIMP，金属蛋白酶组织抑制剂；TLR，钟样受体；TNF，肿瘤坏死因子；TNFRSF，TNF受体超家族；WD，西方膳食。

C.转录表达谱：

RNA-测序数据已保藏于NCBI的SRA或GEO(登录号：PRJNA556537或GSE126204)。宏基因组测序数据已保藏于NCBI的SRA(登录号：PRJNA544728)。

D.背景和目标：

全世界非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，包括脂肪性肝炎(NASH)的发病率增加并且没有批准药理学疗法。在NAFLD患者中一致地报道了较低的循环甘氨酸，但甘氨酸的诱发性作用和其治疗潜能仍然不清楚。我们应用了基因和膳食策略来研究NAFLD中的甘氨酸代谢并且评估了基于甘氨酸的治疗。

E.方法：

我们进行了患有NAFLD的人和小鼠的肝脏中的转录组学分析，揭示了甘氨酸生物合成基因(主要是丙氨酸-乙醛酸转氨酶-1(AGXT1))的抑制作用。我们使用CRISPR/Cas9产生了AGXT1

F.结果：

用于限制甘氨酸可获得性的基因(AGXT1

G.方法

(i)动物程序

动物程序由密歇根大学(U-M)机构动物护理和使用委员会批准(PRO00008239)并且根据机构指南进行。七周龄C57BL/6J或apoE-/-小鼠(B6.129P2-ApoetmlUnc/J，储备：002052)来自Jackson Laboratories。使用CRISPR/Cas9产生基于C57BL/6J背景的AGXT1-/-小鼠，向导-RNA靶向AGXT1的外显子1：5′-GGGTCCGGGGCCCTCCAACC-3′。整个过程中使用八周龄雄性C57BL/6J、apoE-/-或AGXT1-/-小鼠，并且不限量饲喂：标准普通饮食(CD，LabDiet5L0D，13％的卡路里来自脂肪)；高脂肪、高胆固醇西方膳食(WD，Envigo TD.88137，42％脂肪)；含有或不含甘氨酸的AA确定的WD(使用Envigo-Teklad定制膳食研发的，表S2)：WDAA+Gly(TD.170525)或WDAA-Gly(TD.170526)；高脂肪、高胆固醇、高果糖NASH膳食(研究膳食D17010103，40％脂肪)，我们确认所述膳食有效诱导小鼠中的NASH。当有指示时，为小鼠经口灌胃每天每克体重0.125-1mg的甘氨酸(Sigma-Aldrich G5417)、亮氨酸(Sigma-AldrichL8912)或DT-109(CSBio)或H

表S2.含有或不含甘氨酸的氨基酸确定的WD(WD

(ii)人数据

使用两个公共肝脏微阵列数据集对驱动甘氨酸生物合成的差异表达基因(DEG)进行分析：1)GSE83452，来自104个NASH患者和44个健康对照，2)GSE61260，来自24个NASH患者和24个健康肥胖对照。我们使用用年龄、性别以及BMI作为协变量的线性回归模型来鉴定与NASH相关的显著甘氨酸生物合成基因。为增加统计功效，我们还在固定效应模型情况下进行了两个研究的荟萃分析。使用我们先前公布的微阵列数据(GSE26106，n＝206个肝脏移植供体)来测试基因表达水平与肝脂肪含量之间的相关性。

(iii)组织学和免疫组织化学

由U-M体内动物中心组织学实验室(U-M In Vivo Animal Core，HistologyLaboratory)进行所有组织学程序。技术人员对实验组不知情。使用H&E或天狼星红染色对NAFLD活性(NAS)或纤维化进行评分。

(iv)基于甘氨酸的化合物的鉴定

选择在结构上类似于甘氨酸的化合物来评估对甘氨酸骨架的结构、构象、电子以及等排修饰。经由

(v)RNA-测序

由U-M DNA测序中心(U-M DNA Sequencing Core)在NovaSeq 6000测序系统(Illumina)上进行文库制备和测序。如所描述进行RNA-测序和路径分析。

(vi)综合实验室动物监测系统(CLAMS)

在U-M动物表型鉴定中心(U-M Animal Phenotyping Core)使用基于核磁共振(NMR)的分析仪(LF90II；Bruker Optics)评估身体组成。使用CLAMS(ColumbusInstruments)测量氧消耗(VO

(vii)粪便微生物组分析

如先前所描述进行粪便DNA提取，使用对16S rRNA的V4区具特异性的引物进行扩增，使用线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe)方法表征肠道微生物群，并且进行疾病参数情况下的相关性分析。

(viii)统计分析

使用GraphPad Prism 7.0进行统计分析。除非另有指示，否则值呈现为平均值±SD，显示所有点。针对正态性和等方差性对所有数据进行测试。如果通过了，那么使用学生t检验(Student t test)来比较两个组或使用单因素ANOVA继之以邦弗朗尼事后检验(Bonferroni post-hoc test)在＞2个组之间进行比较。否则，使用非参数检验(曼-惠特尼U(Mann-Whitney U)或克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis))。P值＜0.05被视为统计显著的。

(ix)使用CRISPR/Cas9产生AGXT1-/-小鼠

使用CRISPR/Cas9产生C57BL/6J背景下的AGXT1-/-小鼠。AGXT1基因的外显子1上的向导RNA靶位点为5′-GGGTCCGGGGCCCTCCAACC-3′。我们使用以下引物进行了基因型鉴定：正向：5’-ACACCTCCACTGTCCTGTCC-3’，反向：5’-GGTCAGATCTGCCTGCTACC-3’。使用以下引物：5′-GCAGAGCTAGCTGGGAAATG-3′的Sanger测序证实从前间隔序列相邻基序(PAM，图8A)起第3个碱基A缺失。在ORF的AA 53后的移码突变引入了早熟停止密码子，并且通过蛋白质印迹确认不存在AGXT1(图8B)。如使用CRISPOR所评估，未检测到CRISPR脱靶效应。

(x)人数据

使用两个公共数据集对NASH患者中的差异表达甘氨酸生物合成基因进行分析。第一项研究由从104个NASH患者和44个正常对照获得的肝脏微阵列数据(GSE83452)组成。使用线性回归来测试基因表达水平与NASH之间的相关性。将年龄和性别调整为协变量。第二数据集包括从24个NASH患者和24个健康肥胖对照收集的肝脏微阵列数据(GSE61260)。类似地，我们使用具有年龄、性别以及BMI作为协变量的线性回归模型来鉴定与NASH相关的显著甘氨酸生物合成基因。为增加统计功效和比较结果，我们还使用metafor R包在固定效应模型情况下进行了两个研究的荟萃分析。本杰米尼-霍赫伯格调整的p值(Benjamini-Hochberg adjusted p value)＜0.05并且科克伦氏Q异质性检验(Cochran′s Qheterogeneity test)p值＞0.05的基因被视为显著的。

使用我们先前公布的从肝脏移植供体(n＝206)收集的微阵列数据(GSE26106)测试基因表达水平与肝脂肪含量之间的相关性。如先前所描述进行组织解剖、样品排除以及微阵列数据生成。如先前所描述，使用有机溶剂(己烷/异丙烷3∶2)对供体肝脏的肝脂肪含量进行定量。针对总蛋白浓度对所提取的总脂肪含量进行规范化并且转化为log10尺度用于后续分析。使用皮尔森相关性(Pearson correlation)来测定肝脂肪与甘氨酸生物合成基因的表达相关联的显著性。

(xi)组织学、免疫组织化学以及NAFLD活性和纤维化评分

由对实验组不知情的技术人员在密歇根大学的体内动物中心(IVAC)组织学实验室进行组织学程序。通过分级乙醇对福尔马林固定的组织进行加工并且用二甲苯透明化，随后使用自动化VIP5或VIP6组织处理器(TissueTek，Sakura-Americas)用熔解的石蜡渗透。使用Histostar包埋站(ThermoFisher Scientific)，然后在M355S轮转切片机(ThermoFisher Scientific)上以4μm厚度对组织进行切片并且安装于载玻片上。针对苏木精和曙红(H&E，ThermoFisher Scientific)对载玻片进行染色。对于天狼星红染色，用0.2磷钼酸将载玻片处理3min并且转移至于苦味酸中饱和的0.1％天狼星红(RowleyBiochemical Inc.)中持续90min，然后转移至0.01N盐酸持续3min。

使用H&E染色对NAFLD活性进行评分。将脂肪变性评分为0-3(0：＜5％脂肪变性；1：5-33％；2：34-66％；3：＞67％)。将肝细胞气球样变评分为0-2(0：正常肝细胞，1：正常尺寸并且具有淡色细胞质，2：淡色并且增大的肝细胞，至少2倍)。基于在20X下计数的炎症病灶将小叶炎症评分为0-2(0：无，1：＜2个病灶；2：≥2个病灶)。将NAFLD活性得分(NAS)计算为脂肪变性、肝细胞气球样变以及小叶炎症得分的总和。使用天狼星红染色将肝纤维化评分为0-4(0：没有纤维化；1：窦周或门管区纤维化；2：窦周和门管区纤维化；3：桥接纤维化；4：肝硬化)。

使用冰冻切片加工进行油红O(ORO)染色。将福尔马林固定的肝脏样品在20％蔗糖中在4℃下冷冻保护过夜，形成印迹，然后在O.C.T Compound(Tissue-Tek，目录号4583)中液氮快速冷冻，并且储存在-80℃下直至准备好用于低温切片。在切片之前，将冷冻块升至约-20℃，然后在Cryotome SME(Thermo-Shandon，目录号77200227)上以5μm进行切片。将载玻片储存在-80℃下直至进行染色。在染色之前，将肝脏载玻片解冻至室温持续30min。将载玻片随后在10％中性缓冲福尔马林中固定20min，在DDW中冲洗，随后在60％异丙醇中冲洗，然后在工作ORO-异丙醇染色剂(Rowley Biochemical Inc.，H-503-1B)中放置5min。然后将载玻片在60％异丙醇中冲洗，随后三次更换DDW。然后，在哈里斯苏木精(HarrisHematoxylin)中对载玻片进行核复染并且安装在Aqua-Mount(Lerner Laboratories，目录号13800)水性固定介质上。

在IntelliPATH FLX自动化免疫组织化学染色器(Biocare Medical)上进行免疫组织化学染色，阻断内源性过氧化物酶和非特异性结合，随后使用基于不含辣根过氧化物酶生物素的聚合物的商业检测系统进行检测，使用二氨基联苯胺色原揭示，并且使用苏木精进行核复染。特定于F4/80(Bio-Rad ABD Serotec，目录号MCA497)，将大鼠单克隆第一抗体(克隆CI：A3-1)在DaVinci稀释剂(Biocare Medical，目录号PD900)中稀释至1∶400并且孵育60min，随后使用大鼠基于小鼠HRP-聚合物(Biocare Medical，目录号RT517)2步探针聚合物分别孵育10和30min进行检测。

(xii)血浆分析

在密歇根糖尿病研究中心(Michigan Diabetes Research Center，MDRC)的化学实验室使用制造商提供的试剂和方案或在我们的实验室使用可商购获得的试剂盒(WakoChemicals 999-02601和994-02891)使用Cobas Mira化学分析仪(Roche Diagnostics)测量完整血浆脂质型态(TC、TG、LDL以及HDL)。在MDRC使用多重分析(Multiplex Assay)(MMHMAG-44K，Millipore)在Luminex 200平台(Luminex)上测量血浆含甘氨酸的三肽分子和抵抗素。使用小鼠CCL2/JE/MCP-1 Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems)测量血浆MCP-1。由密歇根大学IVAC在Liasys 330化学分析仪(AMS Diagnostics)上使用制造商提供的试剂和方案进行对ALT、AST以及ALP的临床化学分析。使用草酸盐分析试剂盒(Abcam，ab196990)测量血浆草酸盐。使用血糖仪和测试条(NDC：0193-7308-50，Contour Next)测量血浆葡萄糖。由密歇根大学代谢组学中心(University of Michigan Metabolomics Core)进行血浆AA分析。根据EZ Faast氨基酸分析试剂盒(Phenomenex)的说明书衍生化并且制备二十μL的血浆用于GC-MS分析。简单来说，对样品进行柱净化并且转移至GC自动取样器小瓶。然后，对样品进行衍生化，在室温下在温和氮气流下干燥，并且进行再悬浮用于在Agilent 69890N GC-5975MS检测器上进行GC分析，使用以下参数：将1μL样品以1∶15分流比注射于ZB-AAA 10m柱(Phenomenex)上，He气体流速为1.1mL/min。GC烘箱初始温度为110℃并且按每分钟30℃增加至320℃。入口温度为250℃并且MS离子源和四级杆温度分别为230°和150℃。使用MassHunter定量分析B.07.00版对数据进行处理。针对最靠近的同位素标记的内标物对代谢产物进行规范化并且使用2次重复注射的5个标准物进行定量，以形成针对各标准物的准确性优于80％的线性校准曲线。使用峰面积进行各组间的差异分析。

(xiii)定量实时PCR分析

使用QIAGEN的RNeasy试剂盒(QIAGEN)提取小鼠肝脏样品的总RNA。使用SuperScript III和随机引物(Invitrogen)将RNA逆转录至cDNA中。通过使用iQ SYBR绿色超混物(Bio-Rad)的实时PCR系统(Bio-Rad)以及ΔΔCt阈值循环规范化方法来评估特定转录物水平。针对3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)对基因表达水平进行规范化。从IntegratedDNA Technologies获得用于qPCR的引物对并且列于表S3中。

表S3.用于qPCR分析的引物

(xiv)RNA-测序和数据分析

如上文所描述从小鼠肝脏样品提取总RNA。由密歇根大学DNA测序中心(University of Michigan DNA Sequencing Core)进行文库制备和测序。使用TapeStation(Agilent，Santa Clara，CA)评估RNA的质量。所有样品均具有＞8.5的RNA完整指数(RIN)。使用用于Illumina的NEBNext Ultra II定向RNA文库制备试剂盒(NEB，E7760L)加上Poly(A)mRNA磁性分离模块(NEB，E7490L)以及用于Illumina Unique dual的NEBNext多重寡核苷酸(NEB，E6440L)制备样品，其中对10ng-1μg的总RNA进行mRNA polyA纯化。然后将mRNA片段化并且使用逆转录酶和dUTP混合物拷贝至第一股cDNA中。样品经历末端修复和dA加尾步骤，随后连接NEBNext衔接子。将产物纯化并且通过PCR富集以形成最终cDNA文库。使用Kapa的用于Illumina测序平台的文库定量试剂盒(Kapa Biosystems KK4835)通过TapeStation(Agilent)和qPCR针对数量和质量对最终文库进行检验。在NovaSeq6000测序系统(Illumina)上对文库进行双端测序。

通过FastQC v0.11.8(https：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)对原始Fastq文件的质量进行检验。使用Trimmomaticv.0.35修整低质量读段，参数为：SLIDINGWINDOW：4：20MINLEN：25。12然后使用HISAT2 v.2.1.0将所得高质量读段定位至小鼠参考基因组(GRCm38.90)。13使用HTSeq-counts v0.6.0基于GRCm38.90基因组注释进行基因水平定量。14然后使用R包DESeq2来鉴定显著差异表达基因。15我们将经调整的P值小于0.05并且绝对倍数变化大于2的基因视为显著差异表达基因(DEG)。然后针对显著富集的KEGG路径使用clusterProfiler程序包分别对上调和下调的DEG进行分析。16通过右尾费舍尔精确检验(right-tailed Fisher′s exact test)继之以本杰米尼-霍赫伯格多重检验调整(Benjamini-Hochberg multiple testing adjustment)确定富集显著性。

(xv)肝脂质分析

从安乐死的小鼠快速移除肝脏，使用液氮快速冷冻，并且保持在-80℃下。将冷冻肝脏样品(100mg)在PBS中均质化并且离心(14，000RPM，20min)。收集上清液并且使用Bio-Rad布拉德福分析对蛋白质含量进行分析。为评估肝脏脂质组成，使用3∶2比率(v：v)的己烷(≥99％，Sigma-Aldrich 32293)和异丙醇(≥99.5％，Fisher Scientific A426-4)从上清液提取脂质，并且使己烷相蒸发48h。使用可商购获得的试剂盒(Wako Chemicals 999-02601和994-02891)以分光光度法测定肝脏TG或TC的量。使用ELISA试剂盒(Aviva SystemsBiology，OKEH02607)根据制造商的说明书测定肝脏二酰基甘油(DAG)。针对蛋白质水平对肝TG、TC以及DAG数据进行规范化。

(xvi)蛋白质印迹分析

将肝脏样品在补充有蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物(Roche Applied Science)的放射免疫沉淀分析溶解缓冲液(RIPA缓冲液，Thermo Scientific)中溶解。在10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中对蛋白质进行拆分并且转移至硝基纤维素膜(Bio-Rad)。将膜在室温下在含有5％脱脂乳的tris-缓冲盐水-吐温20(TBST)中阻断1小时并且与第一抗体一起在4℃下孵育过夜。使用以下第一抗体：AGXT1(Santa CruzBiotechnology sc-517388，1：500)、HADHA(Proteintech 10758-1-AP，1∶1000)、ACAA2(ABclonalA15778，1∶500)、磷酸-SMAD2(Ser465/467，Cell Signaling，#3108S；1∶1000)、SMAD2(Cell Signaling Technology，#5339S；1∶1000)、GAPDH(Santa Cruz Biotechnologysc-365062；1∶2000)或β-肌动蛋白(Cell Signaling Technology#3700)。将膜用TBST洗涤，然后与IRDye-缀合的第二抗体(LI-COR Biosciences，1∶10000)一起在室温下孵育1h。在TBST洗涤之后，对条带进行目视观察并且使用奥德赛红外成像系统(LI-COR Biosciences，2.1版)定量。

(xvii)基于甘氨酸的化合物的鉴定

选择在结构上类似于甘氨酸的化合物，目标为评估对甘氨酸骨架的结构、构象、电子以及等排修饰(图9A)。经由

是通过甘氨酰胺(图9F)、2-氨基-N-甲基乙酰胺(图9G)以及乙醇胺(图9H)进行探索，而2-氧代哌嗪(图9I)和吗啉-2-酮(图9J)探索了构象限制的类似物。(1H-四唑-5-基)甲胺(图9K)探索了酸的等排置换。

(xviii)口服葡萄糖耐受性测试(OGTT)

在12h空腹之后进行OGTT。在存在或不存在指示剂量(每克体重0.17-1mg)的亮氨酸、甘氨酸、DT-109或其他基于甘氨酸的化合物的情况下进行葡萄糖(每克体重2mg)口服灌胃之后0、15、30、60以及120min时从尾巴端部获取血液样品。使用血液血糖仪和测试条(Contour Next)测量血糖浓度。

(xix)身体组成和综合实验室动物监测系统(CLAMS)

由密歇根大学动物表型鉴定中心(University of Michigan AnimalPhenotyping Core)进行所有测量。使用基于核磁共振(NMR)的分析仪(Minispec LF90II；Bruker Optics)测量体脂、瘦体质以及自由流体。每天如制造商所建议使用参考样品对分析仪进行检验。在最小限制情况下将小鼠个别地放至测量管中。使用CLAMS(ColumbusInstruments)(一种配备有光束活动监测装置的整合开路量热计)测量氧消耗(VO2)、二氧化碳产生(VCO2)以及运动活动。在测量之前对小鼠进行称重，并且个别地放入具有自由食物和水存取口的密封室(7.9″x4″x5″)。在具有12-12h暗-亮循环(6：00PM至6：00AM)的设定在20-23℃的实验房间中进行研究。测量连续进行48h。在此期间，通过定位于腔室内部的饲喂和饮水装置为动物提供食物和水。以10min间隔依序对各腔室中的VO2和VCO2进行5s取样并且以X和Z维度每秒记录一次运动活动。将通过腔室的空气流速调节至在静止条件下保持氧差异约0.3％。以VCO2/VO2计算呼吸交换率(RER)。基于VO2、VCO2以及蛋白质分解的值计算总能量消耗、葡萄糖氧化以及脂肪氧化。

(xx)粪便微生物组分析

使用QIAamp DNA粪便微型试剂盒(51540，Qiagen)根据制造商的说明书从粪便样品提取肠道微生物群的总基因组DNA。如先前所描述制备DNA用于群落分析。17简单来说，使用对16S rRNA基因的V4区具特异性的条形码双索引引物来扩增DNA。18PCR反应由5μL的4μM等摩尔引物组、0.15μL的AccuPrime Taq DNA高保真度聚合酶、2μL的10 x AccuPrime PCR缓冲液II(Thermo Fisher Scientific 12346094)、11.85μL的PCR级水以及1μL的DNA模板组成。PCR条件为在95℃下2min，随后30个95℃持续20s、55℃持续15s以及72℃持续5min的循环，随后72℃持续10min。使用SequalPrep规范化板试剂盒(Thermo Fisher ScientificA1051001)对各PCR反应进行规范化。将规范化反应汇集并且使用用于Illumina平台的Kapa生物系统文库qPCR预混液(ROX Low)定量试剂盒(KK4873)进行定量。使用Agilent生物分析仪使用高灵敏性DNA分析试剂盒(5067-4626)确认扩增子文库的大小(约399bp)。然后在Illumina MiSeq NANO平台(Microbial Systems Molecular Biology Laboratory,University of Michigan)上根据标准方案对汇集的扩增子文库进行测序。

使用Mothur根据SOP对DNA测序数据进行处理并且主要聚焦于基于α-多样性和β-多样性的分析。如先前所描述对序列进行修整以移除引物和条形码，进行质量过滤，并且进行嵌合体检验。将各样品中的总共3565个序列用于进一步的统计分析。使用平均近邻法(average neighbor approach)将修整过的DNA序列聚类以形成在97％序列相似性截止值(3％序列分歧度)下的操作分类单位(OTU)。使用Clearcut程序构建系统进化树。使用基于OTU的方法进行β多样性测量。使用头107个OTU(＞1％)的相对丰度值的log2换算产生所有样品的各OTU的相对丰度的热图。进行分子AMOVA统计分析以确定各取样组中的群落间结构相似性的显著性。使用UniFrac分析估计加权(WUnF)和未加权的(UWUnF)UniFrac度量。计算约束排序RDA(冗余分析)，并且通过前向选择分析检验环境变量的显著性。使用用于发现生物标记物的线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe)方法(http://huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/)进行区分肠道微生物群的微生物特征的表征，所述方法强调了统计显著性与生物关联性两者。相应地使用R中的Phyloseq包对主成分分析(PCA)作图。使用非参数斯皮尔曼检验(nonparametric Spearman's test)计算改变的细菌属的变化与肝脏或血浆中的NAFLD相关参数之间的相关性。

(xxi)体外研究

从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)获得HepG2人肝癌细胞系并且在37℃和5％CO2下在补充有10％胎牛血清(FBS，Sigma-Aldrich)和1％青霉素-链霉素(Pen-Strep，Gibco)的杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′sModified Eagle Medium，DMEM，Gibco)中培养。在一些实验中，在不含FBS但补充有0.1％BSA的DMEM中为细胞加载棕榈酸(PA，200μM，Sigma-Aldrich P0500)。从Ambion获得靶向AGXT1的siRNA(siAGXT1：GCAAGGAUAUGUACCAGAUtt，siRNA编号s1190)和非靶向性siRNA对照(siCTL，siRNA编号AM4611)。在Opti-MEM减血清培养基(Gibco)中根据制造商的方案使用脂质体RNAiMAX(Invitrogen)将HepG2细胞用20nM的siAGXT1或siCTL转染。在转染后48h时，进行RNA分离、蛋白质或脂质提取。使用QIAGEN的RNeasy试剂盒(QIAGEN)从HepG2细胞纯化总RNA。使用表S3中所列的人引物对如上文所描述进行qPCR分析。使用补充有蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物(Roche Applied Science)的RIPA缓冲液(Thermo Scientific)将细胞溶解。如上文所描述使用蛋白质印迹法评估AGXT1蛋白丰度。使用3∶2比率的己烷：异丙醇从细胞提取细胞脂质并且使己烷相蒸发48h。将板中的剩余细胞在0.1M NaOH中破碎持续24h并且取等分试样以便使用布拉德福蛋白质分析(Bio-Rad)进行细胞蛋白质测量。使用可商购获得的试剂盒(Wako Chemicals)以分光光度法测定细胞TG或TC的含量。针对蛋白质水平对细胞TG和TC数据进行规范化并且呈现为每毫克蛋白质的TG或TC微克数。

H.结果

(i)鼠和人NAFLD中受损的甘氨酸生物合成

为测试改变的甘氨酸代谢是否促进NAFLD发展，我们首先研究了患有WD诱发的HS的C57BL/6J。在12周的WD饲喂之后，高胆固醇血症(图10A)以及通过H&E和油红O(ORO)染色以及肝TG和总胆固醇(TC)定量验证的HS为明显的(图10B至图10D)。靶向的代谢组学表明在所有AA中，血浆甘氨酸最显著地降低，而其前体丝氨酸、苏氨酸以及丙氨酸明显增加(图10E)，指示受损的甘氨酸生物合成。因此，我们接下来研究了驱动甘氨酸形成的基因的表达。我们发现在患有HS的小鼠中主要甘氨酸生物合成基因下调，其中，AGXT1最显著地受抑制(图10F)。另外，在具有棕榈酸(PA)诱导的TG累积的HepG2细胞中AGXT1明显下调(图10G、图10H)。

为测试在更严重的NAFLD中类似模式是否为明显的，我们对患有晚期NASH和由24周的NASH-膳食饲喂诱导的纤维化的小鼠的肝脏进行了RNA-测序(图10I)。路径分析揭示了NASH中所涉及的已知路径的改变，包括趋化因子、NF-κB、钟样受体(TLR)以及转化生长因子-β(TGFβ)信号传导的上调，以及FA降解和过氧物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号传导的下调(图10J)。有趣的是，在NASH中调控AA生物合成，包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及乙醛酸的代谢的路径显著下调，包括AGXT1抑制(P＝0.0009，图10K)。使用患有膳食诱发的NASH的小鼠的独立队列，通过qPCR确认了AGXT1抑制(图10L)。

为测试在人NAFLD中甘氨酸生物合成基因是否类似地受抑制，我们进行了基于NASH患者的肝脏的转录组学的荟萃分析。我们发现在NASH中AGXT1(β＝-0.141，P＝0.0041)和AGXT2(β＝-0.134，P＝0.0135)显著下调，不过催化甘氨酸降解至乙醛酸的D-氨基酸氧化酶(DAO)明显上调(β＝0.216，P＝0.0025，图10M)。在从肝脏移植供体获得的206个样品中，我们发现AGXT1表达与肝脂肪含量反相关(r＝-0.199，P＝0.0044，图10N)。有趣的是，在PPARα(肝FAO的主调控因子)的表达与肝脂肪含量之间发现类似反相关(r＝-0.154，P＝0.0275)，而C-C基序趋化因子配体5(CCL5)和TGFβ(脂肪性肝炎和纤维化中的关键作用者)的表达与肝脂肪正相关(分别为r＝0.185，P＝0.0078以及r＝0.284，P＜0.0001，未示出)。关于甘氨酸生物合成基因的抑制，这些结果与当前NAFLD中循环甘氨酸较低的报道一致，并且表明AGXT1在NAFLD中的作用。

(ii)AGXT1损失加重膳食诱发的高脂血症和NASH

为研究局部化至肝细胞的过氧物酶体或线粒体的肝特异性基因AGXT1在细胞脂质累积中的潜在作用，我们将HepG2细胞中的AGXT1敲除，这使PA诱导的TG累积增强(图8C至图8E)。为研究体内AGXT1损失的影响，我们使用CRISPR/Cas9产生了AGXT1

为理解AGXT1

(iii)甘氨酸缺乏加重膳食诱发的高脂血症和HS

较低的血浆甘氨酸水平与NAFLD和心血管代谢疾病相关，而较高的水平与有利脂质型态相关。为研究膳食甘氨酸在血脂异常中的作用，我们研发了含有或不含甘氨酸的AA修饰的WD(WD

(iv)DT-109：具有双重降葡萄糖/脂质特性的基于甘氨酸的三肽

考虑以上发现，我们推断，基于甘氨酸的化合物可通过双重降葡萄糖/脂质效应具有治疗潜能。因此，我们在胺或羧基处应用各种化学修饰调查了与甘氨酸结构类似的化合物。鉴定了十种潜在化合物(图9A至图9K)，其中四种适合于经口施用。显示慢性甘氨酸补充(1mg/g/天)使apoE

为测试降脂质效应，我们在经口施用DT-109(1mg/g/天)、等效水平的亮氨酸、甘氨酸或H

(v)DT-109改善身体组成并且防止膳食诱发的NASH

为进一步探索DT-109对NASH的治疗潜能，我们设计了一种实验方法来将晚期NAFLD模型化(图17A)。与饲喂CD相比，饲喂NASH-膳食持续12周的C57BL/6J小鼠具有增加的血浆葡萄糖、TC、AST以及ALT(图17B)。将小鼠的子集处死，证实在饲喂NASH-膳食之后肝脏重量增加(图17C)。H&E和ORO组织学揭示HS、肝细胞气球样变以及炎性细胞浸润，而天狼星红染色证实早期纤维化(图17D)。在确认NASH之后(图17D至图17F)，将其余部分的小鼠随机化以在NASH-膳食情况下经由再口服灌胃12周接受每天每克0.125或0.5mg的DT-109、等效水平的亮氨酸、甘氨酸或H

在第18周，OGTT和非空腹血糖测量证实每天每克0.5mg DT-109的降葡萄糖效应最有效(图17G、图17H)。身体组成分析揭示在饲喂NASH-膳食的所有小鼠中体重增加(图17I)，不过与H

在终点处，在饲喂NASH-膳食小鼠中观测到的血浆AST、ALT以及碱性磷酸酶(ALP)增加因甘氨酸或DT-109治疗而有所减少(图18A至图18C)。在用甘氨酸或DT-109治疗的小鼠中血浆TG降低(图18D)，并且TC因每天每克0.5mg DT-109而降低(图18E)。因此，通过用甘氨酸或DT-109治疗，NASH-膳食诱发的肝肿大和浅黄色着色明显减轻，但在亮氨酸情况下未明显减轻(图18F、图18G、图18H)，并且NAS因每天每克0.5mg DT-109而显著降低(图18I、图18J)。线性回归分析指示个别AST、ALT或ALP水平与NAS之间高度显著正相关(图18K至图18M)。

(vi)DT-109逆转NASH-膳食诱发的转录组改变：对于FAO的关键作用

为探索基于甘氨酸的治疗防止膳食诱发的NASH的机制，我们进行了在终点时所收集的肝脏的RNA-测序。主成分分析(PCA)表明，在甘氨酸的中间模式以及0.125mg/g/天的情况下，基于用亮氨酸处理的NASH-膳食的小鼠的基因表达型态与H

(vii)DT-109使NASH-膳食诱发的肝炎和纤维化减轻

RNA-测序分析揭示基于甘氨酸的治疗对主要炎性路径/基因的抑制作用(图19F、图19G)，表明消炎作用。实际上，在NASH-膳食情况下用H

RNA-测序还证实，与TGFβ信号传导(TGFB1/2和TGFBR1/2)和ECM重塑(COL1A1/1A2/3A1/4A1/4A2、TIMP1/2以及SERPINE1)有关的路径/基因因NASH-膳食而上调并且因甘氨酸或DT-109而减轻(图19F、图19G)。实际上，基于天狼星红的组织学分析和纤维化评分揭示了甘氨酸或DT-109(而不是亮氨酸)针对NASH-膳食诱发的肝纤维化的保护作用(图20A、图20F、图20G)。线性回归分析证实个别AST、ALT或ALP水平与纤维化得分之间高度显著正相关，表明甘氨酸或DT-109使NASH-膳食诱发的肝脏损害减轻(图20H、图20I、图20J)。为测试基于甘氨酸的治疗是否使TGFβ介导的肝纤维化减轻，我们接下来分析了SMAD信号传导并且发现SMAD2 Ser465/467磷酸化主要因DT-109而降低(图20K)。qPCR分析证实在施用H

I.讨论

尽管脂质和葡萄糖代谢异常为NAFLD的已知特征，但提出在NASH中涉及AA代谢的扰动。特别地，已在NAFLD患者中一致地报道较低的循环甘氨酸，但甘氨酸降低的原因和其治疗潜能仍然不清楚。在本文中，使用基因和膳食方法来限制甘氨酸可获得性，我们提供了甘氨酸在NAFLD发展中的诱发性作用的证据。在用于NAFLD的潜在基于甘氨酸的疗法的调查中，我们确定DT-109具有双重降葡萄糖/脂质效应并且有效地防止小鼠发生膳食诱发的NASH。

本文中呈现的结果表明在NAFLD患者中发现的较低的甘氨酸水平与肝甘氨酸生物合成基因受抑制相关。具体地说，在鼠与人NASH两者中，我们发现了催化乙醛酸转化为甘氨酸的AGXT1的显著抑制，并且证实AGXT1表达与人中的肝脂肪含量反相关。虽然其他人报导了在NASH患者或鼠模型中AGXT1受到抑制，但我们首次报导了AGXT1在NAFLD中的诱发性作用。AGXT1中的突变引起原发性高草酸尿1型，原发性高草酸尿1型由乙醛酸转化为甘氨酸受损并且产生过量的肝草酸盐从而导致肾衰竭引起。有趣的是，虽然AGXT1

我们还应用了膳食方法来限制甘氨酸可获得性，并且比较了饲喂含有或不含甘氨酸的WD的高脂血症小鼠中的脂质型态和HS。在饲喂甘氨酸缺乏型WD的小鼠中观测到的增强的肥胖、高脂血症以及HS与先前报道一致，其中在各种啮齿动物模型中膳食甘氨酸加快脂肪损失，改善葡萄糖耐受性，减少血浆脂质或减轻HS。有趣的是，虽然样品尺寸小并且治疗期短，但在补充甘氨酸前体丝氨酸之后在NAFLD患者中发现HS减轻并且血浆肝酶减少。在使用以脂肪性肝炎和纤维化共存为特征的晚期NAFLD模型的一项彻底调查中，我们首次报导了甘氨酸治疗在0.33mg/g/天的相对低剂量情况下在小鼠中的保护作用。

在我们调查基于甘氨酸的化合物期间，所鉴定的化合物中无一者比甘氨酸更高效地降低血浆葡萄糖。因此，我们测试了甘氨酸与亮氨酸的组合，亮氨酸是被报道使人中的葡萄糖降低并且使小鼠中的HS减轻的另一AA。特别地，应用各种T2D模型，我们的实验室揭示了三肽gly-gly-L-leu超过游离甘氨酸、亮氨酸或其二肽组合的有效降葡萄糖效应。使用基因和膳食模型，我们首次证实了DT-109还改善脂质型态、HS以及NASH。虽然在用等效亮氨酸水平治疗的小鼠中没有观测到显著效应，但在甘氨酸治疗之后代谢益处为明显的。然而，一些结果仅在较高剂量的DT-109情况下为明显的，包括稳健的降葡萄糖作用、高脂血症小鼠中HDL水平的维持、NASH-膳食诱发的身体组成变化的预防、肝脏DAG的降低以及NAS的显著降低。应注意，还在每天每克0.125mg DT-109的较低剂量情况下注意到重大益处。

脂质过载对NASH发病机理来说极为重要。当游离脂肪酸过量供应至肝脏和/或其经由FAO处置受损时，它们被用作诱导氧化压力和促炎性/纤维发生路径，从而促进脂肪性肝炎和纤维化的脂毒性物质的底物。应用无偏转录组学，我们确定了在NASH小鼠的肝脏中受抑制的主要FAO路径因DT-109而逆转，并且随后HS减轻并且脂毒性DAG减少。这表明基于甘氨酸的治疗使受损的肝FAO正常化并且使HS和脂毒性程度降低，这又可减缓NASH进展。实际上，使用我们的以脂肪性肝炎和纤维化为特征的模型，我们发现如通过组织、转录组学以及血浆分析显而易见的，甘氨酸或DT-109使NASH-膳食诱发的肝/全身炎症和纤维化减轻。一致地，先前的研究报道了甘氨酸在患有内毒素血症的小鼠中的消炎和肝保护作用。在T2D患者中，甘氨酸治疗(5g/天)3个月使血红蛋白-A1c和血浆TNFR1降低。

总之，对NAFLD中受损的甘氨酸代谢的确定使得本发明人确定了基于甘氨酸的治疗，所述基于甘氨酸的治疗被证实通过调节肝FAO在实验性NAFLD中为有效的。