一种细胞穿透性强溶液分散性强的上转换荧光探针的制备方法

技术领域

本发明属于纳米材料领域，具体涉及一种细胞穿透性强溶液分散性强的上转换荧光探针的制备方法及其应用。

背景技术

稀土掺杂上转换纳米颗粒(UCNPs)可吸收几个低能量的长波长光子，然后发射一个高能量的短波长光子，实现多光子发光。UCNPs具有近红外激发、反斯托克斯位移大、发光稳定、发射峰窄等优势，广泛应用于生物医学前沿研究领域。但制备的UCNPs表面含有疏水的油酸配体，而通过传统改性和功能化方法制备的多肽修饰的稀土纳米颗粒往往分散性不佳，难以满足应用需求。为了提高纳米材料的使用性能，需要开发新的表面改性和功能化方法以提高其分散性和功能性。

细胞膜可有效阻止外源物质进入细胞，保证了细胞内稳态和生命活动的有序进行，但这也导致外源分子很难通过细胞膜，限制了对细胞内生命活动的观测和调控。为了更多地将外源物质递送进细胞，一系列载体或配体如细胞穿透肽(CPPs)、脂质体、脂肪酸、聚合物或表面活性剂等被开发用于外源物质的细胞摄取。其中细胞穿透肽能够促进药物、核酸等分子进入细胞，具有很高的应用价值。利用UCNPs的光学特性，然后结合细胞穿透肽修饰，可以显著提高UCNPs探针进入细胞的效率，进而对细胞内微环境进行观察和表征。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的上转换纳米颗粒功能化处理方法易导致样品分散性差、易团聚、细胞穿透性差等问题，旨在于提供一种细胞穿透肽修饰的上转换纳米荧光探针的制备方法及其应用，通过本发明的方法所获得细胞穿透肽修饰的纳米颗粒具有很强的单分散性，同时提高UCNPs探针进入细胞的效率，具有很高的应用价值，为细胞穿透肽促进UCNPs进入细胞提供了一种高效途径。

为实现上述目的，本发明提供了一种细胞穿透肽修饰的上转换纳米荧光探针的制备方法，所述方法包括以下步骤：

S1利用共沉淀法制备分散均匀、尺寸可调的NaYF

S2将稀土纳米颗粒与NOBF

S3通过EDC和Sulfo-NHS介导将脱盐细胞穿透肽分子共价偶联到PAA分子上，制备获得细胞穿透肽修饰的上转换纳米颗粒。

需要说明的是，所述步骤S1中，包括取总量1mmol的稀土醋酸盐水溶液、7.5mL油酸和17.5mL十八烯混合，在150℃搅拌反应40min后降至室温，随后将0.148g氟化铵固体和0.761g油酸钠固体混合后加入反应体系中，在40℃搅拌2h后升温至270℃，在氩气保护下搅拌反应1.5h获得油酸包覆的UCNPs。反应结束后将溶液降至室温，用无水乙醇和环己烷洗样品，最后将上转换纳米颗粒分散至环己烷中。

需要说明的是，所述步骤S2中用NOBF

需要说明的是，所述步骤S3中，通过EDC和Sulfo-NHS介导将细胞穿透肽分子于颗粒表面的羧基偶联；包括，首先取1mg PAA-UCNPs的MES溶液，依次加入10mg EDC的MES溶液和15mg的Sulfo-NHS的MES溶液，剧烈搅拌2h，获得Sulfo-NHS偶联的PAA-UCNPs；然后离心，将沉淀分散在1mL的HEPES缓冲液中；将上述溶液中加入50μg的细胞穿透肽，在4℃条件下振荡反应3h，通过置换反应使细胞穿透肽偶联到PAA的羧基上，最后离心，将沉淀重新分散在1mL HEPES缓冲液或细胞培养基中。

需要说明的是，上转换纳米探针的尺寸可以通过反应温度进行精准调控，在250℃、260℃、270℃下反应可分别获得粒径7nm、9nm、11nm的分散良好的纳米颗粒。

进一步的，本发明还提供一种利用细胞穿透肽修饰的上转换纳米探针制备方法获得的上转换纳米探针，具体的说，细胞穿透肽分子通过共价偶联在上转换纳米颗粒表面的羧基上，可以显著提高上转换纳米荧光探针进入活细胞的效率，而且具有更强的分散性和稳定性，可通过偶联不同的细胞穿透肽分子进入细胞内的不同亚细胞区域。

需要说明的是，纳米探针表面偶联的细胞穿透肽为无盐的产品，细胞穿透肽类型根据不同的使用需求决定。

更进一步的，本发明再提供一种细胞穿透肽修饰的上转换纳米探针制备方法获得的上转换纳米探针的应用，即，所述上转换纳米荧光探针用于活细胞微环境的荧光检测。

采用本发明的修饰方法可选择不同功能的细胞穿透肽进行修饰以获得不同的功能性，或同时使用多种细胞穿透肽以制备多功能稀土纳米颗粒。

附图说明

图1为本发明的原理示意图；

图2为制备的油酸上转换纳米颗粒的电镜图；

图3为偶联TAT穿透肽之后的纳米颗粒在多光子显微镜的荧光成像图，稀疏单个的发光中心证明了细胞穿透肽修饰的上转换纳米颗粒分散性良好；

图4为偶联未脱磷酸盐离子的TAT穿透肽表现为聚集的状态，很难进入细胞内部。偶联脱去磷酸盐离子的TAT穿透肽在细胞内表现出很好的分散性，且与PAA-UCNPs相比更容易进入细胞内，进入细胞内的纳米探针明显增多。

具体实施方式

以下将结合附图，对本发明的技术方案作具体描述，需要说明的是，所描述的实施例以本技术方案为依据，给出了详细的具体实施方式，但本发明的保护范围并不限于所列实施例。基于本发明中的实施例，技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明为一种细胞穿透肽修饰的上转换纳米荧光探针的制备方法，所述方法包括以下步骤：

S1利用共沉淀法制备分散均匀、尺寸可调的NaYF

S2将稀土纳米颗粒与NOBF

S3通过EDC和Sulfo-NHS介导将细胞穿透肽分子共价偶联到PAA分子上，制备获得细胞穿透肽修饰的上转换纳米颗粒。

进一步的，本发明的所述步骤S1中，包括取总量1mmol的稀土醋酸盐水溶液、7.5mL油酸和17.5mL十八烯混合，在150℃搅拌反应40min后降至室温，随后将0.148g氟化铵固体和0.761g油酸钠固体混合后加入反应体系中，在40℃搅拌2h后升温至270℃，在氩气保护下搅拌反应1.5h获得油酸包覆的UCNPs。反应结束后将溶液降至室温，用无水乙醇和环己烷洗样品，最后将上转换纳米颗粒分散至环己烷中。

进一步的，本发明的所述步骤S2中用NOBF

进一步的，本发明的所述步骤S3中，通过EDC和Sulfo-NHS介导将细胞穿透肽分子于颗粒表面的羧基偶联；包括，首先取1mg PAA-UCNPs的MES溶液，依次加入10mg EDC的MES溶液和15mg的Sulfo-NHS的MES溶液，剧烈搅拌2h，获得Sulfo-NHS偶联的PAA-UCNPs；然后离心，将沉淀分散在1mL的HEPES缓冲液中；将上述溶液中加入50μg的细胞穿透肽，在4℃条件下振荡反应3h，通过置换反应使细胞穿透肽偶联到PAA的羧基上，最后离心，将沉淀重新分散在1mL HEPES缓冲液或细胞培养基中。

进一步的，本发明的上转换纳米探针的尺寸可以通过反应温度进行精准调控，在250℃、260℃、270℃下反应可分别获得粒径7nm、9nm、11nm的分散良好的纳米颗粒。

进一步的，本发明还提供一种利用细胞穿透肽修饰的上转换纳米探针制备方法获得的上转换纳米探针，具体的说，细胞穿透肽分子通过共价偶联在上转换纳米颗粒表面的羧基上，可以显著提高上转换纳米荧光探针进入活细胞的效率，而且具有更强的分散性和稳定性，可通过偶联不同的细胞穿透肽分子进入细胞内的不同亚细胞区域。

进一步的，本发明的纳米探针表面偶联的细胞穿透肽优选为无盐的产品，细胞穿透肽类型根据不同的使用需求决定。

更进一步的，本发明再提供一种细胞穿透肽修饰的上转换纳米探针制备方法获得的上转换纳米探针的应用，即，所述上转换纳米荧光探针用于活细胞微环境的荧光检测。

实施例1

本实施例提供一种细胞穿透性强溶液分散性强的上转换荧光探针制备方法，包括稀土纳米颗粒的制备、表面改性和偶联细胞穿透肽的具体步骤：

步骤1：首先制备NaYF

步骤2：将20mg稀土纳米颗粒样品分散到5mL环己烷中，然后将20mg NOBF

步骤3：取1mg PAA-UCNPs的MES溶液，依次加入10mg EDC的MES溶液和15mg的Sulfo-NHS的MES溶液，剧烈搅拌2h，获得Sulfo-NHS偶联的PAA-UCNPs；然后离心，将沉淀分散在1mL的HEPES缓冲液中。随后取50ug的TAT穿透肽加入上述Sulfo-NHS偶联的PAA-UCNPs溶液中，在4℃条件下振荡反应3h，通过置换反应使细胞穿透肽偶联到PAA的羧基上。最后离心，将沉淀重新分散在1mL HEPES缓冲液或细胞培养基中。

实施例2

步骤1：制备NaYF4：20Yb2Ho作为上转颗粒：利用共沉淀法，取3.9mL Y(CH

步骤2与实施例1中的步骤相同。

步骤3：取1mg PAA-UCNPs的MES溶液，依次加入10mg EDC的MES溶液和15mg的Sulfo-NHS的MES溶液，剧烈搅拌2h，获得Sulfo-NHS偶联的PAA-UCNPs；然后离心，将沉淀分散在1mL的HEPES缓冲液中。随后取50μg的Pep-1加入上述Sulfo-NHS偶联的PAA-UCNPs溶液中，在4℃条件下振荡反应3h，通过置换反应使细胞穿透肽偶联到PAA的羧基上。最后离心，将沉淀重新分散在1mL HEPES缓冲液或细胞培养基中。

对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变，而所有的这些改变，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。