一种慢病毒稳定包装细胞系及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫学和分子生物学领域，主要是细胞治疗领域，尤其涉及一种慢病毒稳定包装细胞系及其制备方法。

背景技术

慢病毒(Lentivirus)是一种基因治疗载体，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIA)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)等。慢病毒载体与其它逆转录病毒载体不同，可以感染分裂细胞和非分裂细胞。慢病毒可以感染心肌细胞、肿瘤细胞、神经元细胞、干细胞、肝细胞、内皮细胞等多种类型的细胞，容纳外源片段大，实现目的基因的稳定表达，免疫反应小，从而达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。

目前的慢病毒在大多数情况下是通过将包装质粒和表达质粒瞬时转染细胞产生的。但是目前的生产工艺生产的慢病毒滴度低，杂质残留多，且病毒批次间产毒量也不稳定。因此，需要构建稳定的慢病毒包装细胞系，使生产的慢病毒滴度高，杂质含量少。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提出一种慢病毒稳定包装细胞系及其制备方法，该慢病毒稳定包装细胞系在传代、产毒和遗传基因拷贝数方面都比较稳定，而且使用该慢病毒稳定包装细胞系生产的慢病毒滴度高，杂质含量少。

基于上述目的，本发明的一个方面提供了一种慢病毒稳定包装细胞系，其中，包含包装质粒组，所述包装质粒组由pPuro.coTetR质粒、pVSVG质粒和pGagPol-RRE-NES-cINT质粒组成；

所述pPuro.coTetR质粒包含CoTetR基因，所述pVSVG质粒包含VSVG基因，所述pGagPol-RRE-NES-cINT质粒包含GagPol和Rev基因。

在本发明的优选的实施方案中，其中，所述pPuro.coTetR质粒还包含CMV启动子、嵌合体内含子、SV40启动子、嘌呤霉素抗性基因和多腺苷酸化信号；

所述pVSVG质粒还包含由CMV启动子和两个四环素操纵子组成的杂合启动子、SV40启动子、博来霉素抗性基因和多腺苷酸化信号；

所述pGagPol-RRE-NES-cINT质粒还包含由CMV启动子和两个四环素操纵子组成的杂合启动子、嵌合体内含子、SV40启动子、潮霉素抗性基因、cPPT/CTS元件、RRE元件和多腺苷酸化信号。

在本发明的优选的实施方案中，其中，所述CoTetR基因的序列如SEQ ID NO：1所示，所述VSVG基因的序列如SEQ ID NO：2所示，所述GagPol和Rev基因的序列分别如SEQ IDNO：3和4所示。

在本发明的优选的实施方案中，其中，所述pPuro.coTetR质粒的序列如SEQ IDNO：5所示，所述pVSVG质粒的序列如SEQ ID NO：6所示，所述pGagPol-RRE-NES-cINT质粒的序列如SEQ ID NO：7所示。

在本发明的优选的实施方案中，其中，所述细胞系选自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080或HeLa细胞系中的一种；

优选地，所述细胞系为HEK293细胞系。

基于相同的发明构思，本发明的另一个方面提供了一种制备上述的慢病毒稳定包装细胞系的方法，其中，包括以下步骤：

1)将pPuro.coTetR质粒、pVSVG质粒和pGagPol-RRE-NES-cINT质粒分别线性化酶切；

2)将线性化的pPuro.coTetR质粒和pVSVG质粒共转染细胞，并加入第一抗生素进行筛选，得到第一阳性单克隆细胞；

3)用线性化的pGagPol-RRE-NES-cINT质粒转染第一阳性单克隆细胞，并加入第二抗生素进行筛选，得到第二阳性单克隆细胞，即为慢病毒稳定包装细胞系。

在本发明的优选的实施方案中，其中，在步骤2)中，将线性化的pPuro.coTetR质粒和pVSVG质粒共转染细胞的过程中还加入聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺与质粒的质量比为：聚乙烯亚胺：(pPuro.coTetR质粒+pVSVG质粒)＝(1～8):1；

优选地，所述聚乙烯亚胺与质粒的质量比为：聚乙烯亚胺：(pPuro.coTetR质粒+pVSVG质粒)＝(2～5):1；

更优选地，所述聚乙烯亚胺与质粒的质量比为：聚乙烯亚胺：(pPuro.coTetR质粒+pVSVG质粒)＝4:1；

和/或，在步骤3)中，将线性化的pGagPol-RRE-NES-cINT质粒转染第一阳性单克隆细胞的过程中还加入聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺与pGagPol-RRE-NES-cINT质粒的质量比为(1～8):1；

优选地，所述聚乙烯亚胺与pGagPol-RRE-NES-cINT质粒的质量比为(2～5):1；

更优选地，所述聚乙烯亚胺与pGagPol-RRE-NES-cINT质粒的质量比为4:1。

在本发明的优选的实施方案中，其中，在步骤2)中，所述pPuro.coTetR质粒和pVSVG质粒的用量均为(0.2～1.0)μg/10

优选地，所述pPuro.coTetR质粒和pVSVG质粒的用量均为(0.4～0.9)μg/10

更优选地，所述pPuro.coTetR质粒和pVSVG质粒的用量均为0.8μg/10

和/或，在步骤3)中，所述pGagPol-RRE-NES-cINT质粒的用量为(0.2～1.0)μg/10

优选地，所述pGagPol-RRE-NES-cINT质粒的用量为(0.4～0.9)μg/10

更优选地，所述pGagPol-RRE-NES-cINT质粒的用量为0.8μg/10

在本发明的优选的实施方案中，其中，在步骤2)中，所述第一抗生素为嘌呤霉素和博来霉素的组合物，其用量分别为1～5μg/mL和300～500μg/mL；更优选地，所述嘌呤霉素和博来霉素的用量分别为2μg/mL和400μg/mL；

和/或，在步骤3)中，所述第二抗生素为嘌呤霉素、博来霉素和潮霉素的组合物，其用量分别为1～5μg/mL、300～500μg/mL和300～500μg/mL；更优选地，所述嘌呤霉素、博来霉素和潮霉素的用量分别为2μg/mL、400μg/mL和400μg/mL。

基于相同的发明构思，本发明的另一个方面提供了一种慢病毒的生产方法，其中，将目的质粒转染上述的慢病毒稳定包装细胞系。

在本发明的优选的实施方案中，其中，包括：

将目的质粒转染慢病毒稳定包装细胞系，然后加入诱导剂诱导慢病毒稳定包装细胞系产生慢病毒。

在本发明的优选的实施方案中，其中，将目的质粒转染慢病毒稳定包装细胞系的过程中还加入聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺与目的质粒的质量比为：聚乙烯亚胺：目的质粒＝(1～8):1；

优选地，所述聚乙烯亚胺与目的质粒的质量比为：聚乙烯亚胺：目的质粒＝(2～5):1；

更优选地，所述聚乙烯亚胺与目的质粒的质量比为：聚乙烯亚胺：目的质粒＝4:1。

在本发明的优选的实施方案中，其中，所述目的质粒的用量为(0.2～0.8)μg/10

优选地，所述目的质粒的用量均为(0.3～0.5)μg/10

更优选地，所述目的质粒的用量为0.4μg/10

在本发明的优选的实施方案中，其中，所述诱导剂为强力霉素；

优选地，所述诱导剂的加入时间为转染后20～30h；更优选地，所述诱导剂的加入时间为转染后24h；

优选地，所述诱导剂的加入浓度为1～5μg/mL，更优选地，所述诱导剂的加入浓度为2μg/mL。

在本发明的优选的实施方案中，其中，在慢病毒产生过程中还加入增强剂提高慢病毒的表达量；

所述增强剂为丁酸钠；

优选地，所述增强剂的加入浓度为5～15mM；更优选地，所述增强剂的加入浓度为10mM；

优选地，所述增强剂的加入时间为转染后20～30h；更优选地，所述增强剂的加入时间为转染后24h；

优选地，所述增强剂的换液时间为加入增强剂后6～8h；

和/或，所述慢病毒收集的时间为45～50h；优选地，所述慢病毒收集的时间为48h。

附图说明

图1为包装细胞系的质粒图谱；其中图1a为pPuro.coTetR质粒的质粒图谱，图1b为pVSVG质粒的质粒图谱，图1c为pGagPol-RRE-NES-cINT质粒的质粒图谱；

图2为半定量PCR鉴定单克隆细胞Clone1、5、6、7、14、17、18、19、23、24、26、27、28、31、32和33的TetR、VSVG和GagPol基因的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为目的质粒转染慢病毒包装细胞系进行产毒验证的柱状图；

图4为Clone31进行转染和诱导产毒的优化实验结果的柱状图；

图5为Clone31传代稳定性实验结果的柱状图；

图6为Clone31产毒稳定性实验结果的柱状图；

图7为Clone31细胞的拷贝数稳定实验结果的柱状图；其中图7a为Clone31VSVG基因拷贝数稳定实验结果的柱状图；图7b为Clone31 GagPol基因拷贝数稳定实验结果的柱状图；图7c为Clone31 Rev基因拷贝数稳定实验结果的柱状图；

图8为Clone31和293细胞批次间病毒滴度对比图；

图9为Clone31和293细胞病毒滴度VP(P24)对比图；

图10为Clone31和293细胞放大对比图；其中图10a为E1000转染24h和48h活率对比图；图10b为E1000转染HCP残留对比图；图10c为E1000转染VP对比图。

具体实施方式

需要说明的是，除非另外定义，本说明书一个或多个实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的培养基、试剂材料和试剂盒等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

需要说明的一点，本发明中的抗生素(嘌呤霉素、博来霉素和潮霉素)、诱导剂(强力霉素)和增强剂(丁酸钠)的浓度均指的是在培养基中的终浓度。例如，丁酸钠的加入浓度为5～15mM指的是，丁酸钠的加入量为使丁酸钠在培养基中的终浓度为5～15mM。

慢病毒载体系统以慢病毒为骨架发展起来，有包装结构和载体结构。慢病毒包装系统一般由两个部分组成：慢病毒包装质粒和慢病毒表达质粒。慢病毒包装质粒由编码产生病毒蛋白的序列组成，慢病毒表达质粒含有长末端重复系列、包装信号等包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。利用包装质粒和表达质粒时共转染细胞，病毒在细胞中包装并分泌到细胞外培养基，产生病毒颗粒，可以用于宿主细胞的感染。

目前的慢病毒在大多数情况下是通过将包装质粒和表达质粒瞬时转染在细胞工厂中培养的293或293T细胞产生的；其中包装质粒含有长末端重复系列、包装信号等包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，表达质粒含有目的基因。

利用293细胞瞬时转染大规模生产慢病毒是可行的，并显示出良好的前景。然而，瞬时转染在工艺生产中还需要进一步的优化，其主要瓶颈是转染过程需要大量的质粒DNA，因此生产成本昂贵，不易放大，不可持续生产病毒。瞬时转染生产的病毒，杂质残留多，特别是宿主蛋白、DNA残留等，增加后续纯化工艺难度，且病毒批次间产毒量也不稳定，这给下游工艺安排带来不确定性。因此，需要构建稳定的慢病毒包装细胞系，将包装病毒所需的载体元件稳定的整合在宿主细胞的基因组中，使其可以稳定的遗传，方便放大，实现可持续生产。

本发明的目的是构建一种慢病毒稳定包装细胞系，实现悬浮细胞(特别是293细胞)放大工艺生产，使生产的慢病毒滴度高，杂质含量少。

基于上述目的，本发明的一个方面提供了一种慢病毒稳定包装细胞系，其中，包含包装质粒组，所述包装质粒组由pPuro.coTetR质粒、pVSVG质粒和pGagPol-RRE-NES-cINT质粒组成；

所述pPuro.coTetR质粒包含CoTetR基因，所述pVSVG质粒包含VSVG基因，所述pGagPol-RRE-NES-cINT质粒包含GagPol和Rev基因。

现有技术中慢病毒的生产方法中是将包装质粒和表达质粒同时转染细胞(例如293或293T细胞)，其存在的主要问题在于生产的慢病毒滴度低，杂质含量高，且病毒批次间产毒量也不稳定。本发明先将包装质粒转染细胞系得到慢病毒稳定包装细胞系，即将pPuro.coTetR质粒、pVSVG质粒和pGagPol-RRE-NES-cINT质粒转染细胞系得到慢病毒稳定包装细胞系，然后再将目的质粒转染慢病毒稳定包装细胞系，使生产的慢病毒滴度高，杂质含量少。

本发明对构建的慢病毒稳定包装细胞系进行了稳定性研究，包括传代稳定性、产毒稳定性和拷贝数稳定性，实验结果表明，构建的慢病毒稳定包装细胞系在无筛选压力(不加抗生素)时能稳定传代遗传，并且活率可达97％以上，说明其在无筛选压力时能稳定传代30代以上；在不加抗生素传代的细胞能正常遗传，具有产毒能力；GagPol基因、Rev基因和VSVG基因的拷贝数相对稳定。即本发明构建的慢病毒稳定包装细胞系在传代、产毒和遗传基因拷贝数方面都比较稳定。

本发明的pPuro.coTetR质粒、pVSVG质粒和pGagPol-RRE-NES-cINT质粒均是以商业化的质粒骨架为基础，然后插入目的基因而构建的。例如pPuro.coTetR质粒是以pIRESpuro3质粒为基础，插入CoTetR基因而构建的，CoTetR基因是密码子优化后的TetR(四环素阻遏物)基因，CoTetR基因的序列如SEQ ID NO：1所示，pVSVG质粒是以pcDNA4质粒为基础，插入VSVG基因而构建的，VSVG(水泡性口炎病毒糖蛋白)基因的序列如SEQ ID NO：2所示，pGagPol-RRE-NES-cINT质粒是以pcDNA5质粒为基础，插入GagPol(Gag基因编码病毒的壳蛋白，Pol基因编码病毒的反转录酶和基因整合酶)和Rev基因(其编码病毒颗粒蛋白表达调节因子)而构建的，GagPol和Rev基因的序列分别如SEQ ID NO：3和4所示。

如图1a所示，pPuro.coTetR质粒还包含人类巨细胞病毒(CMV)启动子、嵌合体内含子(可提高蛋白的表达水平)、猿猴病毒40(SV40)启动子、嘌呤霉素抗性基因(Puro

如图1b所示，pVSVG质粒还包含由人类巨细胞病毒(CMV)启动子和两个四环素操纵子(TetO

如图1c所示，pGagPol-RRE-NES-cINT质粒还包含由人类巨细胞病毒(CMV)启动子和两个四环素操纵子(TetO

pGagPol-RRE-NES-cINT质粒含有人类免疫缺陷病毒(HIV)rev应答元件(RRE)，该RRE元件为逆转录病毒输出元件，调节RNA转录物从细胞核到细胞质的转运。

pGagPol-RRE-NES-cINT质粒含有顺式作用元件——中央多聚嘌呤区(cPPT)和中心终止序列(CTS)，cPPT/CTS序列可以是HIV1的cPPT/CTS，能够提高载体整合和转导效率。

在本发明中，由人类巨细胞病毒(CMV)启动子和两个四环素操纵子(TetO

基于相同的发明构思，本发明的另一个方面提供了一种制备上述的慢病毒稳定包装细胞系的方法，其中，包括以下步骤：

1)将pPuro.coTetR质粒、pVSVG质粒和pGagPol-RRE-NES-cINT质粒分别线性化酶切；

2)将线性化的pPuro.coTetR质粒和pVSVG质粒共转染细胞，并加入第一抗生素进行筛选，得到第一阳性单克隆细胞；

3)用线性化的pGagPol-RRE-NES-cINT质粒转染第一阳性单克隆细胞，并加入第二抗生素进行筛选，得到第二阳性单克隆细胞，即为慢病毒稳定包装细胞系。

由于本发明的pPuro.coTetR质粒和pVSVG质粒分别含有嘌呤霉素抗性基因和博来霉素抗性基因，因此在筛选第一阳性克隆细胞的过程中通过加入嘌呤霉素和博来霉素来进行抗性筛选；同时pGagPol-RRE-NES-cINT质粒含有潮霉素抗性基因，因此在筛选第二阳性克隆细胞的过程中通过加入嘌呤霉素、博来霉素和潮霉素来进行抗性筛选。另外，在两次转染过程中需要加入聚乙烯亚胺(PEI)以提高转染效率，并且控制PEI与各个质粒的用量可获得本发明的慢病毒稳定包装细胞系。

基于相同的发明构思，本发明的另一个方面提供了一种慢病毒的生产方法，其中，将目的质粒(含有目的基因的表达质粒)转染上述的慢病毒稳定包装细胞系。

在本发明的优选的实施方案中，其中，包括：

将目的质粒转染慢病毒稳定包装细胞系，然后加入诱导剂诱导慢病毒稳定包装细胞系产生慢病毒。

本发明的慢病毒稳定包装细胞系是诱导系统，在产生慢病毒时，需要加入强力霉素(dox)进行诱导产毒，同时发现在产毒过程中加入丁酸钠可提高慢病毒的产量。本发明还对目的质粒转染慢病毒稳定包装细胞系和诱导产毒的条件进行了优化，最优的条件为：目的质粒量为0.4μg/10

在本发明中，对目的质粒并不作限制，可以根据需要转染多种目的质粒。优选的，目的质粒为CAR表达质粒。

CAR(Chimeric Antigen Receptor)-T全称即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是一种过继免疫细胞疗法；将能够识别肿瘤特异性抗原的scFv片段通过基因工程改造，融合在由CD28、4-1BB等一系列参与T细胞激活的分子组成的跨膜链段上，然后将该基因片段通过慢病毒或逆转录病毒基因转导方式转染患者外周血中提取的T细胞；经基因修饰的T细胞回输患者体内后，利用表达的CAR受体结合肿瘤细胞表面的分子，从而产生内部信号激活T细胞快速摧毁肿瘤细胞。CAR-T细胞整合了抗体的识别特异性和T细胞的杀伤效应及记忆性功能，识别肿瘤抗原无需MHC限制，较天然T细胞可识别更广泛的目标。基于实际需要，可将CAR表达质粒转染上述慢病毒稳定包装细胞系，用于治疗复发/难治CD19阳性的非霍奇金淋巴瘤。CAR的设计及载体构建可参考中国发明专利申请201510324558.X的公开文本，特别是其实施例1和2，设计包含顺序连接的信号肽、胞外结合区、任选的铰链区、跨膜区和胞内信号区的嵌合抗原受体(CAR)，并进行载体(例如IM19质粒)构建。

本发明对CAR表达质粒转染上述慢病毒稳定包装细胞系和现有技术四质粒瞬时转染(pPuro.coTetR质粒、pVSVG质粒、pGagPol-RRE-NES-cINT质粒和CAR表达质粒同时转染293细胞)进行比较，包括细胞活率、病毒滴度VP(P24)、宿主蛋白残留和批次间病毒滴度稳定性等，实验结果表明，本发明构建的慢病毒稳定包装细胞系的病毒滴度VP含量高和批次间产毒稳定，有利于下游纯化工艺。

另外，在放大工艺下比较了CAR表达质粒转染上述慢病毒稳定包装细胞系和现有技术四质粒瞬时转染，包括细胞活率、病毒滴度VP和HCP(宿主蛋白)残留。实验结果表明慢病毒稳定包装细胞系在转染后细胞活率高，生产的病毒HCP(宿主蛋白)残留低，病毒滴度VP高，可进行放大生产病毒。

病毒滴度VP(P24)中的VP是指测定病毒滴度的一种方法——病毒颗粒数(VP)法——是利用OD260检测病毒颗粒数，P24是指病毒外壳蛋白-P24蛋白，通过对P24蛋白进行测定，从而检测病毒滴度。

从上面所述可以看出，本发明提供的慢病毒稳定包装细胞系及其制备方法，该慢病毒稳定包装细胞系在传代、产毒和遗传基因拷贝数方面都比较稳定，而且可进行放大生产病毒。该慢病毒稳定包装细胞系和293细胞四质粒瞬时转染对比，其细胞活率高、病毒滴度VP含量高、宿主蛋白少和批次间产毒稳定，有利于下游纯化工艺。

下面结合具体的实施例对本发明提供的技术方案做进一步的描述。下述实施例仅用于对本发明进行说明，并不会对本发明的保护范围进行限制。

实施例1pPuro.coTetR质粒、pVSVG质粒和pGagPol-RRE-NES-cINT质粒的构建

本实施例构建的慢病毒稳定包装细胞系，由三个质粒构成，pPuro.coTetR(包含CoTetR基因)，pVSVG(包含VSVG基因)，pGagPol-RRE-NES-cINT(包含GagPol和Rev基因)，它们的质粒图谱分别参见图1a，图1b和图1c。

pPuro-coTetR载体构建：

通过引物TetR-WF-1F/TetR-1R-linker和模板pIRESpuro3(TaKaRa，货号：631619)获得INT片段(230bp)，通过引物TetR-2F-linker/TetR-2R-linker和模板coTetR(其序列如SEQ ID NO：1所示)获得coTetR片段(624bp)，通过引物TetR-3F-linker/TetR-WF-3R和模板pcDNA4(Thermo，货号：V102020)获得PA+F1 ori+SV40 promoter片段(1042bp)。再通过搭桥PCR，引物TetR-WF-1F/TetR-2R-linker获得片段TNT+coTetR，引物TetR-WF-1F/TetR-WF-3R获得全长片段TNT+coTetR+PA+F1 ori+SV40promoter。

将上述制备的全长片段通过无缝克隆的方法插入pIRESpuro3载体的HindⅢ位点，转化感受态stbl3(全式金，货号：CD521)，经测序正确后，使用康为无内毒素中提试剂盒提取质粒(康为世纪，货号：cw2105s)，将构建的目的质粒用于后续的包装细胞系构建实验。

pVSVG载体构建：

通过引物VSVG-WF-F/VSVG-WF-R和模板VS-SC(其序列SEQ ID NO：8所示)获得VSVG片段(1536bp)，将上述制备的片段通过无缝克隆的方法插入pcDNA4载体的XhoⅠ位点，转化感受态stbl3，经测序正确后，使用康为无内毒素中提试剂盒提取质粒，将构建的目的质粒用于后续的包装细胞系构建实验。

pGagPol-RRE-NES-cINT载体构建：

通过引物pGagPol-XhoⅠ-WF/pGagPol-XhoⅠ-WR和模板MDK-SC(其序列如SEQ IDNO：9所示)获得GagPol片段(4307bp)，将上述制备的片段通过无缝克隆的方法插入pcDNA5载体(Thermo，货号：V103320)的XhoⅠ位点，转化感受态stbl3，经测序正确后，使用康为无内毒素中提试剂盒提取质粒，将构建的目的质粒pGagPol用于后续的载体构建。

通过引物pGagPol-REV-XbaⅠ-WF/pGagPol-REV-XbaⅠ-WR和模板AX(也称为psPAX2载体，其序列如SEQ ID NO：10所示)获得RRE-NES片段(1705bp)，将上述制备的片段通过无缝克隆的方法插入pGagPol载体的XbaⅠ位点，转化感受态stbl3，经测序正确后，使用康为无内毒素中提试剂盒提取质粒，将构建的目的质粒pGagPol-RRE-NES用于后续的载体构建。

通过引物pGagPol-RN-cINT--NotⅠ-QF/pGagPol-INT-NotⅠ-WR和模板AX获得cINT片段(1122bp)，将上述制备的片段通过无缝克隆的方法插入pGagPol-RRE-NES载体的NotⅠ位点，转化感受态stbl3，经测序正确后，使用康为无内毒素中提试剂盒提取质粒，将构建的目的质粒pGagPol-RRE-NES-cINT用于后续的载体构建。

实施例2慢病毒稳定包装细胞系的制备

将实施例1构建的三个质粒都经过Fsp I(Thermo，货号：FD1224)线性化酶切，然后去磷酸化后，用于转染293细胞。

线性化的pPuro.coTetR和pVSVG质粒，用PEI(聚乙烯亚胺)(Polysciences，货号：23966)共转染293悬浮细胞，转染时pPuro.coTetR和pVSVG质粒用量均为0.8μg/10

将96孔板中存活下来的单克隆细胞进行扩大培养，分别用48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、摇瓶E125。取PV单克隆细胞进行提取RNA，经过反转录成cDNA后，进行半定量PCR鉴定是否含有目的基因CoTetR和VSVG，用β-actin作为内参基因。

将鉴定正确的PV单克隆细胞，用PEI(聚乙烯亚胺)转染线性化的质粒pGagPol-RRE-NES-cINT，转染时pGagPol-RRE-NES-cINT质粒的用量为0.8μg/10

实施例3稳定包装细胞系半定量PCR鉴定

将96孔板中存活下来的单克隆细胞进行扩大培养，分别用48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、摇瓶E125。取PVGR单克隆细胞进行提取RNA，经过反转录成cDNA后，进行半定量PCR鉴定是否含有目的基因CoTetR、VSVG和GagPol。用β-actin作为内参基因。具体步骤如下：

前一天将PVGR单克隆细胞铺于12孔板中，用1mL SMM293 TI(Sino Biological，货号：M293TI)+0.1％F68(Gibco，货号：24040-032)培养基，每孔铺3×10

将提取的RNA各用2μg进行反转录成cDNA，用第一链cDNA合成试剂盒(ThermoScientific

将反转录的cDNA进行PCR扩增目的基因CoTetR、VSVG和GagPol，各用2μg。用β-actin作为内参基因，然后进行琼脂糖凝胶电泳。PCR扩增目的基因体系：2×phanta Maxmaster mix(南京诺唯赞，货号：P515-02)加10μL，正向和反向引物各加1μL，ddH

CoTetR正向引物：

5'-atccactttgcctttctctccacagatgtctaggctggacaagtccaa-3'

CoTetR反向引物：

5'-atggctggcaactagaaggcacagtcagctgccgctttcgcacttga-3'

VSVG正向引物：5'-ccgctcgagatgaagtgccttttgtactt-3'

VSVG反向引物：5'-tgcattttccgttgatgaac-3'

GagPol正向引物：5'-ccggccataaagcaagagtt-3'

GagPol反向引物：5'-ccgcagatttctatgagtat-3'

β-actin正向引物：5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′

β-actin反向引物：5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’

实验结果见图2所示。根据图2可知，其中Clone1、18、19、23、28、31、32和33都有目的片段CoTetR、VSVG和GagPol。

实施例4目的质粒(CAR表达质粒)的构建

4.1CAR分子的核苷酸序列的制备

本实施例的CAR分子包含信号肽、胞外结合区、任选的铰链区、跨膜区和胞内信号区。所述胞外结合区的核苷酸序列是在抗CD19的嵌合抗原受体的抗原结合区(在此命名为anti-CD19scFv-S0，简称为scFv-S0，其来源于小鼠，参见J Immunother.2009September；32(7):689–702.)的核苷酸序列的基础上进行人源化改造而获得的。具体说明CAR分子的核苷酸序列的制备步骤。

首先进行引物设计，本实施例中使用的引物序列如下：

1-1：5’-ATGCTTCTCCTGGTGACAAG-3’

1-2：5’-TGGGATCAGGAGGAATGCTG-3’

2-1：5’-TACATCTGGGCGCCCTTGGCCGG-3’

2-2：5’-GGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGCG-3’

3-1：5’-AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCG-3’

3-2：5’-TTAGCGAGGGGGCAGGGCCT-3’

4-1：5’-ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCC-3’

4-2：5’-TGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGG-3’

5-1：5’-GCGGCCGCAATTGAAGTTATGTA-3’

5-2：5’-TTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGC-3’

6-1：5’-CTAGACTAGTATGCTTCTCCTGGTGACAAGCC-3’

6-2：5’-CGACGCGTTTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGC-3’

以人的cDNA文库为模板，分别以1-1和1-2、2-1和2-2、3-1和3-2为引物，通过PCR克隆出相应的CAR分子部分，分别为GMCSF、CD28-TM+CD28-signal(这两部分是相连的)和CD3ζ-signal。再通过搭桥引物4-1和4-2获得GMCSF+scFv片段，通过搭桥引物5-1和5-2获得CD28-TM+CD28-signal+CD3ζ-signal片段，随后通过搭桥引物6-1和6-2获得完整的CAR分子的核苷酸序列，酶切位点为SpeI和MluI。

4.2包含CAR分子的核酸序列的病毒载体的构建

将上述制备的CAR分子的核苷酸序列经SpeI(Fermentas)和MluI(Fermentas)双酶切、经T4连接酶(Fermentas)连接插入慢病毒IM19载体的SpeI-MluI位点，转化到感受态E.coli(DH5α)，经测序正确后，使用Qrigene公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，将构建的目的质粒(CAR表达质粒)用于后续的产毒实验。

实施例5稳定包装细胞系产毒验证

在本实施例中，将鉴定正确的PVGR单克隆进行产毒验证，即用实施例4构建的目的质粒瞬时转染实施例3的PVGR单克隆细胞进行产毒验证。具体步骤如下：

前一天将PVGR单克隆细胞铺于12孔板中，用1mL SMM293 TI+0.1％F68培养基，每孔铺8×10

实施例6目的质粒转染稳定包装细胞系和诱导产毒的条件优化实验

挑取产毒滴度比较高的单克隆Clone31进行进一步的研究。将Clone31分别接种于E125摇瓶中(Corning，Cat:431145)，各接种8×10

最终得出，最优的实验方案为：质粒量(目的质粒)为0.4μg/10

实施例7稳定包装细胞系传代、产毒、拷贝数稳定性验证

慢病毒稳定包装细胞系Clone31进行进一步的稳定性研究，包括传代稳定性、产毒稳定性和拷贝数稳定性。

7.1传代稳定性

将Clone31单克隆细胞分别在加抗生素和不加抗生素时，进行E125摇瓶传代，每次各培养10mL，分别计细胞数和活率。具体为：将Clone31分别接种于E125摇瓶中(Corning，Cat:431145)，各接种8×10

实验证明，在不加抗生素(无筛选压力)时，Clone31单克隆细胞与加抗生素时，细胞数差别不大，且Clone31单克隆细胞在不加抗生素(无筛选压力)时，其能稳定传代遗传，并且活率可达97％以上，说明其在无筛选压力时能稳定传代30代以上(见图5)。

7.2产毒稳定性

探索Clone31单克隆细胞在加和不加抗生素时的产毒稳定。在抗生素和不加抗生素下，每隔几代，将目的质粒(实施例4构建)分别转染Clone31，检测病毒滴度。具体为：前一天，将Clone31分别接种于E125摇瓶中(Corning，Cat:431145)，各接种1.4×10

实验结果表明，在不加抗生素时，其具有产毒能力，说明不加抗生素传代的细胞能正常遗传(见图6)。

7.3拷贝数稳定性

Clone31单克隆细胞，每隔几代，在加和不加抗生素时进行拷贝数稳定验证。用细胞基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，货号：DP304-03)，分别提取在加和不加抗生素下，Clone31单克隆细胞的基因组DNA，然后用Taqman-qPCR方法，扩增Clone31单克隆细胞基因组中的GagPol、Rev和VSVG的拷贝数。具体为：将Clone31分别接种于E125摇瓶中(Corning，Cat:431145)，各接种8×10

(1)VSVG基因qPCR引物：

VSVG-q-F：5’-AAGAAACCTGGAGCAAAATCAGA-3’

VSVG-q-R：5’-CCTGGGTTTTTAGGAGCAAGATAG-3’

VSVG-Taqman-Probe：5’-FAM-CGGGTCTTCCAATCTCTCCAGTGGATCT-TAMRA-3’

(2)GagPol基因qPCR引物：

GagPol-q-F:5’-GCAGTTCATGTAGCCAGTGGATAT-3’

GagPol-q-R:5’-TGGTGAAATTGCTGCCATTG-3’

GagPol-Taqman-Probe:5’-FAM-CAGAGACAGGGCAAGAAACAGCATACTTCC-TAMRA-3’

(3)Rev基因qPCR引物：

Rev-q-F:5’-CCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAA-3’

Rev-q-R:5’-TGTTAATTTCTCTGTCCCACTCCAT-3’

Rev-Taqman-Probe:5’-FAM-TCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACC-TAMRA-3’

qPCR反应程序为：95℃30s，95℃5s，55℃15s，72℃35s，40个循环。将得出的CT值代入标曲，计算出拷贝数，然后根据质量，计算出每个细胞拷贝数。

Clone31 VSVG基因拷贝数见图7a，Clone31 GagPol基因拷贝数见图7b；Clone31Rev基因拷贝数见图7c。实验结果表明，Clone31单克隆细胞中的GagPol、Rev和VSVG基因的拷贝数相对稳定。

实施例8稳定包装细胞系和293细胞转染对比

将Clone31单克隆细胞和293细胞进行转染比较，做3批，每批各3个平行。Clone31单克隆细胞用转染和诱导优化后的条件，293细胞用瞬时转染条件(PEI量：质粒量＝4:1)，进行转染比较。具体为：将293细胞和Clone31分别接种于E125摇瓶中(Corning，Cat:431145)，各接种8×10

293细胞用瞬时转染条件：将实施例1构建的pPuro.coTetR质粒、pVSVG质粒和pGagPol-RRE-NES-cINT质粒以及实施例4构建的目的质粒同时转染293细胞，瞬时转染的质粒量在一定范围内对病毒的滴度影响不大，例如总质粒量为0.8μg～1.0μg/10

由图8的实验结果可以看出，Clone31单克隆细胞的批次间病毒滴度稳定性好于293细胞；由图9的实验结果可以看出，Clone31单克隆细胞的病毒滴度VP(P24)远远高于293细胞，Clone31单克隆细胞的病毒滴度VP(P24)含量高。

实施例9稳定包装细胞系放大工艺

将Clone31单克隆细胞由E125摇瓶扩大到E1000(Corning，货号：431147)，然后将目的质粒(实施例4构建)转染Clone31单克隆细胞进行产毒验证，同时转染293细胞进行对照，Clone31单克隆细胞和293细胞的转染条件和实施例8相同。进行各项比较细胞活率、病毒滴度VP(Takara，货号：632200)和HCP(宿主蛋白)(Cygnus，货号：F650)残留(参见图10)。

图10a的实验结果表明Clone31单克隆细胞在转染24h和48h细胞活率均高于293细胞；图10b的实验结果表明Clone31单克隆细胞的HCP(宿主蛋白)残留是293细胞1/3，Clone31单克隆细胞的HCP(宿主蛋白)残留少；图10c的实验结果表明Clone31单克隆细胞的病毒滴度VP(P24)是293细胞的10-20倍，Clone31单克隆细胞的病毒滴度VP(P24)含量高。

序列表

<110> 北京艺妙神州医药科技有限公司；北京艺妙医疗科技有限公司

<120> 一种慢病毒稳定包装细胞系及其制备方法

<130> CP1200854/CB

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CoTetR基因

<400> 1

atgtctaggc tggacaagtc caaggtgatc aactccgccc tggagctcct taacgaggtg 60

gggattgaag ggttgactac ccggaaactg gctcagaaac tgggcgtcga acagccaacc 120

ctgtactggc acgtgaagaa caagcgcgct ttgctggatg cacttgccat cgagatgctg 180

gacaggcacc acacacactt ttgccccttg gagggcgaat cctggcagga cttcctgagg 240

aacaacgcca agagtttccg ctgtgccctg ttgagtcaca gggacggagc aaaggttcac 300

cttggaacca gacccaccga gaagcagtac gagactctgg agaaccagct ggccttcctg 360

tgtcagcagg gctttagcct ggagaacgct ctgtacgcac tgtctgccgt tggccacttt 420

acactcggat gcgtgctgga agaccaggag catcaggttg ccaaggaaga gagggagacc 480

cctaccactg acagcatgcc tccacttctg agacaggcca tcgagctctt tgaccaccag 540

ggagcagaac ccgctttcct cttcgggctg gaactgatca tctgcggcct cgaaaagcag 600

ctcaagtgcg aaagcggcag ctga 624

<210> 2

<211> 1536

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> VSVG基因

<400> 2

atgaagtgcc ttttgtactt agccttttta ttcattgggg tgaattgcaa gttcaccata 60

gtttttccac acaaccaaaa aggaaactgg aaaaatgttc cttctaatta ccattattgc 120

ccgtcaagct cagatttaaa ttggcataat gacttaatag gcacagcctt acaagtcaaa 180

atgcccaaga gtcacaaggc tattcaagca gacggttgga tgtgtcatgc ttccaaatgg 240

gtcactactt gtgatttccg ctggtatgga ccgaagtata taacacattc catccgatcc 300

ttcactccat ctgtagaaca atgcaaggaa agcattgaac aaacgaaaca aggaacttgg 360

ctgaatccag gcttccctcc tcaaagttgt ggatatgcaa ctgtgacgga tgccgaagca 420

gtgattgtcc aggtgactcc tcaccatgtg ctggttgatg aatacacagg agaatgggtt 480

gattcacagt tcatcaacgg aaaatgcagc aattacatat gccccactgt ccataactct 540

acaacctggc attctgacta taaggtcaaa gggctatgtg attctaacct catttccatg 600

gacatcacct tcttctcaga ggacggagag ctatcatccc tgggaaagga gggcacaggg 660

ttcagaagta actactttgc ttatgaaact ggaggcaagg cctgcaaaat gcaatactgc 720

aagcattggg gagtcagact cccatcaggt gtctggttcg agatggctga taaggatctc 780

tttgctgcag ccagattccc tgaatgccca gaagggtcaa gtatctctgc tccatctcag 840

acctcagtgg atgtaagtct aattcaggac gttgagagga tcttggatta ttccctctgc 900

caagaaacct ggagcaaaat cagagcgggt cttccaatct ctccagtgga tctcagctat 960

cttgctccta aaaacccagg aaccggtcct gctttcacca taatcaatgg taccctaaaa 1020

tactttgaga ccagatacat cagagtcgat attgctgctc caatcctctc aagaatggtc 1080

ggaatgatca gtggaactac cacagaaagg gaactgtggg atgactgggc accatatgaa 1140

gacgtggaaa ttggacccaa tggagttctg aggaccagtt caggatataa gtttccttta 1200

tacatgattg gacatggtat gttggactcc gatcttcatc ttagctcaaa ggctcaggtg 1260

ttcgaacatc ctcacattca agacgctgct tcgcaacttc ctgatgatga gagtttattt 1320

tttggtgata ctgggctatc caaaaatcca atcgagcttg tagaaggttg gttcagtagt 1380

tggaaaagct ctattgcctc ttttttcttt atcatagggt taatcattgg actattcttg 1440

gttctccgag ttggtatcca tctttgcatt aaattaaagc acaccaagaa aagacagatt 1500

tatacagaca tagagatgaa ccgacttgga aagtaa 1536

<210> 3

<211> 4307

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> GagPol基因

<400> 3

atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgatggga aaaaattcgg 60

ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120

ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata 180

ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat 240

acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagct 300

ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aagcacagca agcagcagct 360

gacacaggac acagcaatca ggtcagccaa aattacccta tagtgcagaa catccagggg 420

caaatggtac atcaggccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa 480

gagaaggctt tcagcccaga agtgataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc 540

ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600

ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtgcatcc agtgcatgca 660

gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact 720

agtacccttc aggaacaaat aggatggatg acacataatc cacctatccc agtaggagaa 780

atctataaaa gatggataat cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc 840

agcattctgg acataagaca aggaccaaag gaacccttta gagactatgt agaccgattc 900

tataaaactc taagagccga gcaagcttca caagaggtaa aaaattggat gacagaaacc 960

ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt taaaagcatt gggaccagga 1020

gcgacactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtgg ggggacccgg ccataaagca 1080

agagttttgg ctgaagcaat gagccaagta acaaatccag ctaccataat gatacagaaa 1140

ggcaatttta ggaaccaaag aaagactgtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200

atagccaaaa attgcagggc ccctaggaaa aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga 1260

caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaattttt tagggaagat ctggccttcc 1320

cacaagggaa ggccagggaa ttttcttcag agcagaccag agccaacagc cccaccagaa 1380

gagagcttca ggtttgggga agagacaaca actccctctc agaagcagga gccgatagac 1440

aaggaactgt atcctttagc ttccctcaga tcactctttg gcagcgaccc ctcgtcacaa 1500

taaagatagg ggggcaatta aaggaagctc tattagatac aggagcagat gatacagtat 1560

tagaagaaat gaatttgcca ggaagatgga aaccaaaaat gataggggga attggaggtt 1620

ttatcaaagt aagacagtat gatcagatac tcatagaaat ctgcggacat aaagctatag 1680

gtacagtatt agtaggacct acacctgtca acataattgg aagaaatctg ttgactcaga 1740

ttggctgcac tttaaatttt cccattagtc ctattgagac tgtaccagta aaattaaagc 1800

caggaatgga tggcccaaaa gttaaacaat ggccattgac agaagaaaaa ataaaagcat 1860

tagtagaaat ttgtacagaa atggaaaagg aaggaaaaat ttcaaaaatt gggcctgaaa 1920

atccatacaa tactccagta tttgccataa agaaaaaaga cagtactaaa tggagaaaat 1980

tagtagattt cagagaactt aataagagaa ctcaagattt ctgggaagtt caattaggaa 2040

taccacatcc tgcagggtta aaacagaaaa aatcagtaac agtactggat gtgggcgatg 2100

catatttttc agttccctta gataaagact tcaggaagta tactgcattt accataccta 2160

gtataaacaa tgagacacca gggattagat atcagtacaa tgtgcttcca cagggatgga 2220

aaggatcacc agcaatattc cagtgtagca tgacaaaaat cttagagcct tttagaaaac 2280

aaaatccaga catagtcatc tatcaataca tggatgattt gtatgtagga tctgacttag 2340

aaatagggca gcatagaaca aaaatagagg aactgagaca acatctgttg aggtggggat 2400

ttaccacacc agacaaaaaa catcagaaag aacctccatt cctttggatg ggttatgaac 2460

tccatcctga taaatggaca gtacagccta tagtgctgcc agaaaaggac agctggactg 2520

tcaatgacat acagaaatta gtgggaaaat tgaattgggc aagtcagatt tatgcaggga 2580

ttaaagtaag gcaattatgt aaacttctta ggggaaccaa agcactaaca gaagtagtac 2640

cactaacaga agaagcagag ctagaactgg cagaaaacag ggagattcta aaagaaccgg 2700

tacatggagt gtattatgac ccatcaaaag acttaatagc agaaatacag aagcaggggc 2760

aaggccaatg gacatatcaa atttatcaag agccatttaa aaatctgaaa acaggaaagt 2820

atgcaagaat gaagggtgcc cacactaatg atgtgaaaca attaacagag gcagtacaaa 2880

aaatagccac agaaagcata gtaatatggg gaaagactcc taaatttaaa ttacccatac 2940

aaaaggaaac atgggaagca tggtggacag agtattggca agccacctgg attcctgagt 3000

gggagtttgt caatacccct cccttagtga agttatggta ccagttagag aaagaaccca 3060

taataggagc agaaactttc tatgtagatg gggcagccaa tagggaaact aaattaggaa 3120

aagcaggata tgtaactgac agaggaagac aaaaagttgt ccccctaacg gacacaacaa 3180

atcagaagac tgagttacaa gcaattcatc tagctttgca ggattcggga ttagaagtaa 3240

acatagtgac agactcacaa tatgcattgg gaatcattca agcacaacca gataagagtg 3300

aatcagagtt agtcagtcaa ataatagagc agttaataaa aaaggaaaaa gtctacctgg 3360

catgggtacc agcacacaaa ggaattggag gaaatgaaca agtagataaa ttggtcagtg 3420

ctggaatcag gaaagtacta tttttagatg gaatagataa ggcccaagaa gaacatgaga 3480

aatatcacag taattggaga gcaatggcta gtgattttaa cctaccacct gtagtagcaa 3540

aagaaatagt agccagctgt gataaatgtc agctaaaagg ggaagccatg catggacaag 3600

tagactgtag cccaggaata tggcagctag attgtacaca tttagaagga aaagttatct 3660

tggtagcagt tcatgtagcc agtggatata tagaagcaga agtaattcca gcagagacag 3720

ggcaagaaac agcatacttc ctcttaaaat tagcaggaag atggccagta aaaacagtac 3780

atacagacaa tggcagcaat ttcaccagta ctacagttaa ggccgcctgt tggtgggcgg 3840

ggatcaagca ggaatttggc attccctaca atccccaaag tcaaggagta atagaatcta 3900

tgaataaaga attaaagaaa attataggac aggtaagaga tcaggctgaa catcttaaga 3960

cagcagtaca aatggcagta ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt 4020

acagtgcagg ggaaagaata gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac 4080

aaaaacaaat tacaaaaatt caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag 4140

tttggaaagg accagcaaag ctcctctgga aaggtgaagg ggcagtagta atacaagata 4200

atagtgacat aaaagtagtg ccaagaagaa aagcaaagat catcagggat tatggaaaac 4260

agatggcagg tgatgattgt gtggcaagta gacaggatga ggattaa 4307

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Rev基因

<400> 4

ctaccaccgc ttgagagact tactcttgat 30

<210> 5

<211> 6031

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> pPuro.coTetR质粒

<400> 5

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccag tgagtactcc 900

ctctcaaaag cgggcatgac ttctgcgcta agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat 960

ttgatattca cctggcccgc ggtgatgcct ttgagggtgg ccgcgtccat ctggtcagaa 1020

aagacaatct ttttgttgtc aagcttgagg tgtggcaggc ttgagatctg gccatacact 1080

tgagtgacaa tgacatccac tttgcctttc tctccacaga tgtctaggct ggacaagtcc 1140

aaggtgatca actccgccct ggagctcctt aacgaggtgg ggattgaagg gttgactacc 1200

cggaaactgg ctcagaaact gggcgtcgaa cagccaaccc tgtactggca cgtgaagaac 1260

aagcgcgctt tgctggatgc acttgccatc gagatgctgg acaggcacca cacacacttt 1320

tgccccttgg agggcgaatc ctggcaggac ttcctgagga acaacgccaa gagtttccgc 1380

tgtgccctgt tgagtcacag ggacggagca aaggttcacc ttggaaccag acccaccgag 1440

aagcagtacg agactctgga gaaccagctg gccttcctgt gtcagcaggg ctttagcctg 1500

gagaacgctc tgtacgcact gtctgccgtt ggccacttta cactcggatg cgtgctggaa 1560

gaccaggagc atcaggttgc caaggaagag agggagaccc ctaccactga cagcatgcct 1620

ccacttctga gacaggccat cgagctcttt gaccaccagg gagcagaacc cgctttcctc 1680

ttcgggctgg aactgatcat ctgcggcctc gaaaagcagc tcaagtgcga aagcggcagc 1740

tgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga 1800

ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt 1860

gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg 1920

attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg 1980

aaagaaccag ctggggctct agggggtatc cccacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 2040

cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg 2100

ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 2160

taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 2220

aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 2280

ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 2340

tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt 2400

ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttaattctgt ggaatgtgtg 2460

tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca 2520

tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat 2580

gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc 2640

gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat 2700

ttatgcagag gccgaggccg cctctgcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt 2760

ttttggaggc ctaggctttt gcaaaagctt gccacaaccc acaaggagac gaccttccat 2820

gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtccccc gggccgtacg 2880

caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg acccggaccg 2940

ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat 3000

cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag 3060

cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc 3120

ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc 3180

cgcgtggttc ctggccaccg tcggcgtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag 3240

cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga 3300

gacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga 3360

cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgacg 3420

cccgccccac gacccgcagc gcccgaccga aaggagcgca cgaccccatg gctccgaccg 3480

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ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 5340

ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtt 5400

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<210> 8

<211> 5821

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 模板VS-SC

<400> 8

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<223> 模板MDK-SC

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tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 120

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 180

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 240

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 300

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 360

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 420

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 480

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 540

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 600

acggtgggag gtctatataa gcagagctct ccctatcagt gatagagatc tccctatcag 660

tgatagagat cgtcgacgag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc 720

acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgga ctctagccgg 780

atcctgagaa cttcagggtg agtctatggg acccttgatg ttttctttcc ccttcttttc 840

tatggttaag ttcatgtcat aggaagggga gaagtaacag ggtacacata ttgaccaaat 900

cagggtaatt ttgcatttgt aattttaaaa aatgctttct tcttttaata tacttttttg 960

tttatcttat ttctaatact ttccctaatc tctttctttc agggcaataa tgatacaatg 1020

tatcatgcct ctttgcacca ttctaaagaa taacagtgat aatttctggg ttaaggcaat 1080

agcaatattt ctgcatataa atatttctgc atataaattg taactgatgt aagaggtttc 1140

atattgctaa tagcagctac aatccagcta ccattctgct tttattttat ggttgggata 1200

aggctggatt attctgagtc caagctaggc ccttttgcta atcatgttca tacctcttat 1260

cttcctccca cagctcctgg gcaacgtgct ggtctgtgtg ctggcccatc actttggcaa 1320

agcacgtgag atctgaattc gagatctgcc gccgccatgg gtgcgagagc gtcagtatta 1380

agcgggggag aattagatcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa 1440

tataaattaa aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatcct 1500

ggcctgttag aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt 1560

cagacaggat cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg 1620

catcaaagga tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa 1680

aacaaaagta agaaaaaagc acagcaagca gcagctgaca caggacacag caatcaggtc 1740

agccaaaatt accctatagt gcagaacatc caggggcaaa tggtacatca ggccatatca 1800

cctagaactt taaatgcatg ggtaaaagta gtagaagaga aggctttcag cccagaagtg 1860

atacccatgt tttcagcatt atcagaagga gccaccccac aagatttaaa caccatgcta 1920

aacacagtgg ggggacatca agcagccatg caaatgttaa aagagaccat caatgaggaa 1980

gctgcagaat gggatagagt gcatccagtg catgcagggc ctattgcacc aggccagatg 2040

agagaaccaa ggggaagtga catagcagga actactagta cccttcagga acaaatagga 2100

tggatgacac ataatccacc tatcccagta ggagaaatct ataaaagatg gataatcctg 2160

ggattaaata aaatagtaag aatgtatagc cctaccagca ttctggacat aagacaagga 2220

ccaaaggaac cctttagaga ctatgtagac cgattctata aaactctaag agccgagcaa 2280

gcttcacaag aggtaaaaaa ttggatgaca gaaaccttgt tggtccaaaa tgcgaaccca 2340

gattgtaaga ctattttaaa agcattggga ccaggagcga cactagaaga aatgatgaca 2400

gcatgtcagg gagtgggggg acccggccat aaagcaagag ttttggctga agcaatgagc 2460

caagtaacaa atccagctac cataatgata cagaaaggca attttaggaa ccaaagaaag 2520

actgttaagt gtttcaattg tggcaaagaa gggcacatag ccaaaaattg cagggcccct 2580

aggaaaaagg gctgttggaa atgtggaaag gaaggacacc aaatgaaaga ttgtactgag 2640

agacaggcta attttttagg gaagatctgg ccttcccaca agggaaggcc agggaatttt 2700

cttcagagca gaccagagcc aacagcccca ccagaagaga gcttcaggtt tggggaagag 2760

acaacaactc cctctcagaa gcaggagccg atagacaagg aactgtatcc tttagcttcc 2820

ctcagatcac tctttggcag cgacccctcg tcacaataaa gatagggggg caattaaagg 2880

aagctctatt agatacagga gcagatgata cagtattaga agaaatgaat ttgccaggaa 2940

gatggaaacc aaaaatgata gggggaattg gaggttttat caaagtaaga cagtatgatc 3000

agatactcat agaaatctgc ggacataaag ctataggtac agtattagta ggacctacac 3060

ctgtcaacat aattggaaga aatctgttga ctcagattgg ctgcacttta aattttccca 3120

ttagtcctat tgagactgta ccagtaaaat taaagccagg aatggatggc ccaaaagtta 3180

aacaatggcc attgacagaa gaaaaaataa aagcattagt agaaatttgt acagaaatgg 3240

aaaaggaagg aaaaatttca aaaattgggc ctgaaaatcc atacaatact ccagtatttg 3300

ccataaagaa aaaagacagt actaaatgga gaaaattagt agatttcaga gaacttaata 3360

agagaactca agatttctgg gaagttcaat taggaatacc acatcctgca gggttaaaac 3420

agaaaaaatc agtaacagta ctggatgtgg gcgatgcata tttttcagtt cccttagata 3480

aagacttcag gaagtatact gcatttacca tacctagtat aaacaatgag acaccaggga 3540

ttagatatca gtacaatgtg cttccacagg gatggaaagg atcaccagca atattccagt 3600

gtagcatgac aaaaatctta gagcctttta gaaaacaaaa tccagacata gtcatctatc 3660

aatacatgga tgatttgtat gtaggatctg acttagaaat agggcagcat agaacaaaaa 3720

tagaggaact gagacaacat ctgttgaggt ggggatttac cacaccagac aaaaaacatc 3780

agaaagaacc tccattcctt tggatgggtt atgaactcca tcctgataaa tggacagtac 3840

agcctatagt gctgccagaa aaggacagct ggactgtcaa tgacatacag aaattagtgg 3900

gaaaattgaa ttgggcaagt cagatttatg cagggattaa agtaaggcaa ttatgtaaac 3960

ttcttagggg aaccaaagca ctaacagaag tagtaccact aacagaagaa gcagagctag 4020

aactggcaga aaacagggag attctaaaag aaccggtaca tggagtgtat tatgacccat 4080

caaaagactt aatagcagaa atacagaagc aggggcaagg ccaatggaca tatcaaattt 4140

atcaagagcc atttaaaaat ctgaaaacag gaaagtatgc aagaatgaag ggtgcccaca 4200

ctaatgatgt gaaacaatta acagaggcag tacaaaaaat agccacagaa agcatagtaa 4260

tatggggaaa gactcctaaa tttaaattac ccatacaaaa ggaaacatgg gaagcatggt 4320

ggacagagta ttggcaagcc acctggattc ctgagtggga gtttgtcaat acccctccct 4380

tagtgaagtt atggtaccag ttagagaaag aacccataat aggagcagaa actttctatg 4440

tagatggggc agccaatagg gaaactaaat taggaaaagc aggatatgta actgacagag 4500

gaagacaaaa agttgtcccc ctaacggaca caacaaatca gaagactgag ttacaagcaa 4560

ttcatctagc tttgcaggat tcgggattag aagtaaacat agtgacagac tcacaatatg 4620

cattgggaat cattcaagca caaccagata agagtgaatc agagttagtc agtcaaataa 4680

tagagcagtt aataaaaaag gaaaaagtct acctggcatg ggtaccagca cacaaaggaa 4740

ttggaggaaa tgaacaagta gataaattgg tcagtgctgg aatcaggaaa gtactatttt 4800

tagatggaat agataaggcc caagaagaac atgagaaata tcacagtaat tggagagcaa 4860

tggctagtga ttttaaccta ccacctgtag tagcaaaaga aatagtagcc agctgtgata 4920

aatgtcagct aaaaggggaa gccatgcatg gacaagtaga ctgtagccca ggaatatggc 4980

agctagattg tacacattta gaaggaaaag ttatcttggt agcagttcat gtagccagtg 5040

gatatataga agcagaagta attccagcag agacagggca agaaacagca tacttcctct 5100

taaaattagc aggaagatgg ccagtaaaaa cagtacatac agacaatggc agcaatttca 5160

ccagtactac agttaaggcc gcctgttggt gggcggggat caagcaggaa tttggcattc 5220

cctacaatcc ccaaagtcaa ggagtaatag aatctatgaa taaagaatta aagaaaatta 5280

taggacaggt aagagatcag gctgaacatc ttaagacagc agtacaaatg gcagtattca 5340

tccacaattt taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa agaatagtag 5400

acataatagc aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca aaaattcaaa 5460

attttcgggt ttattacagg gacagcagag atccagtttg gaaaggacca gcaaagctcc 5520

tctggaaagg tgaaggggca gtagtaatac aagataatag tgacataaaa gtagtgccaa 5580

gaagaaaagc aaagatcatc agggattatg gaaaacagat ggcaggtgat gattgtgtgg 5640

caagtagaca ggatgaggat taacacatgg aattccggag cggccgcagg agctttgttc 5700

cttgggttct tgggagcagc aggaagcact atgggcgcag cgtcaatgac gctgacggta 5760

caggccagac aattattgtc tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct gagggctatt 5820

gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct ccaggcaaga 5880

atcctggctg tggaaagata cctaaaggat caacagctcc tggggatttg gggttgctct 5940

ggaaaactca tttgcaccac tgctgtgcct tggaatgcta gttggagtaa taaatctctg 6000

gaacagattt ggaatcacac gacctggatg gagtgggaca gagaaattaa caattacaca 6060

agcttccgcg gaattcaccc caccagtgca ggctgcctat cagaaagtgg tggctggtgt 6120

ggctaatgcc ctggcccaca agtatcacta agctcgcttt cttgctgtcc aatttctatt 6180

aaaggttcct ttgttcccta agtccaacta ctaaactggg ggatattatg aagggccttg 6240

agcatctgga ttctgcctaa taaaaaacat ttattttcat tgcaatgatg tatttaaatt 6300

atttctgaat attttactaa aaagggaatg tgggaggtca gtgcatttaa aacataaaga 6360

aatgaagagc tagttcaaac cttgggaaaa tacactatat cttaaactcc atgaaagaag 6420

gtgaggctgc aaacagctaa tgcacattgg caacagcccc tgatgcctat gccttattca 6480

tccctcagaa aaggattcaa gtagaggctt gatttggagg ttaaagtttt gctatgctgt 6540

attttacatt acttattgtt ttagctgtcc tcatgaatgt cttttcacta cccatttgct 6600

tatcctgcat ctctcagcct tgactccact cagttctctt gcttagagat accacctttc 6660

ccctgaagtg ttccttccat gttttacggc gagatggttt ctcctcgcct ggccactcag 6720

ccttagttgt ctctgttgtc ttatagaggt ctacttgaag aaggaaaaac agggggcatg 6780

gtttgactgt cctgtgagcc cttcttccct gcctccccca ctcacagtga cccggaatcc 6840

ctcgacatgg cagtctagca ctagtgccga ccagtggtcg accctgtgga atgtgtgtca 6900

gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct 6960

caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca 7020

aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc 7080

cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta 7140

tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt 7200

tggaggccta ggcttttgca aaaagctatc gctagctcga gcacgtgttg acaattaatc 7260

atcggcatag tatatcggca tagtataata cgacaaggtg aggaactaaa ccatggccaa 7320

gcctttgtct caagaagaat ccaccctcat tgaaagagca acggctacaa tcaacagcat 7380

ccccatctct gaagactaca gcgtcgccag cgcagctctc tctagcgacg gccgcatctt 7440

cactggtgtc aatgtatatc attttactgg gggaccttgt gcagaactcg tggtgctggg 7500

cactgctgct gctgcggcag ctggcaacct gacttgtatc gtcgcgatcg gaaatgagaa 7560

caggggcatc ttgagcccct gcggacggtg ccgacaggtg cttctcgatc tgcatcctgg 7620

gatcaaagcc atagtgaagg acagtgatgg acagccgacg gcagttggga ttcgtgaatt 7680

gctgccctct ggttatgtgt gggagggcta acacgtgcta cgagatttcg attccaccgc 7740

cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct 7800

ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aacttgttta ttgcagctta 7860

taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact 7920

gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct taggccgcag atctgcttcc 7980

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 8040

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 8100

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 8160

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 8220

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 8280

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 8340

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 8400

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 8460

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 8520

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 8580

tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 8640

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 8700

tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 8760

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 8820

tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 8880

agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt cagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag 8940

gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata ccgtaaagca cgaggaagcg gtcagcccat 9000

tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg gtagccaacg ctatgtcctg atagcggtcc 9060

gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat ccagaaaagc ggccattttc caccatgata 9120

ttcggcaagc aggcatcgcc atgggtcacg acgagatcct cgccgtcggg catgctcgcc 9180

ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg agcccctgat gctcttcgtc cagatcatcc 9240

tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta cgtgctcgct cgatgcgatg tttcgcttgg 9300

tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc gtatgcagcc gccgcattgc atcagccatg 9360

atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg 9420

cccaatagca gccagtccct tcccgcttca gtgacaacgt cgagcacagc tgcgcaagga 9480

acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc gctgcctcgt cttgcagttc attcagggca 9540

ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc gggcgcccct gcgctgacag ccggaacacg 9600

gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt gcccagtcat agccgaatag cctctccacc 9660

caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca tcttgttcaa tcatactctt cctttttcaa 9720

tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 9780

tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtg 9840

gatcccctga gggggccccc atgggctaga ggatccggcc tcggcctctg cataaataaa 9900

aaaaattagt cagccatgag cttggcccat tgcatacgtt gtatccatat cataattmdk 9960

bsdntaacac atggaattcc ggagcggccg caggagcttt gttccttmdk bsdracaggg 10020

tcgaccactg gtcggcacta gtgctagact gccattmdkb sdtggcagtc tagcactagt 10080

gccgaccagt ggtcgaccct gtttmdkbsd rtcgaaatct cgtagcacgt gttagccctc 10140

ccacacataa cttmdkbsdg ttatgtgtgg gagggctaac acgtgctacg agatttcgat 10200

tmdkbsdntr gaggaagcag atctgcggcc taagatacat tgatgagttt 10250

<210> 10

<211> 10668

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 模板AX（psPAX2载体）

<400> 10

agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg gacttccttt gtcccaaatc 60

tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct ctagcgggcg cggggcgaag 120

cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc ttcgtgcgtc gccgcgccgc 180

cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg gggacggctg ccttcggggg 240

ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag agcctctgct 300

aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct ggttattgtg 360

ctgtctcatc attttggcaa agaattcggg ccgcgttgac gcgcacggca agaggcgagg 420

ggcggcgact ggtgagagat gggtgcgaga gcgtcagtat taagcggggg agaattagat 480

cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt aaaacatata 540

gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt agaaacatca 600

gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg atcagaagaa 660

cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag gatagagata 720

aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag taagaaaaaa 780

gcacagcaag cagcagctga cacaggacac agcaatcagg tcagccaaaa ttaccctata 840

gtgcagaaca tccaggggca aatggtacat caggccatat cacctagaac tttaaatgca 900

tgggtaaaag tagtagaaga gaaggctttc agcccagaag tgatacccat gttttcagca 960

ttatcagaag gagccacccc acaagattta aacaccatgc taaacacagt ggggggacat 1020

caagcagcca tgcaaatgtt aaaagagacc atcaatgagg aagctgcaga atgggataga 1080

gtgcatccag tgcatgcagg gcctattgca ccaggccaga tgagagaacc aaggggaagt 1140

gacatagcag gaactactag tacccttcag gaacaaatag gatggatgac acataatcca 1200

cctatcccag taggagaaat ctataaaaga tggataatcc tgggattaaa taaaatagta 1260

agaatgtata gccctaccag cattctggac ataagacaag gaccaaagga accctttaga 1320

gactatgtag accgattcta taaaactcta agagccgagc aagcttcaca agaggtaaaa 1380

aattggatga cagaaacctt gttggtccaa aatgcgaacc cagattgtaa gactatttta 1440

aaagcattgg gaccaggagc gacactagaa gaaatgatga cagcatgtca gggagtgggg 1500

ggacccggcc ataaagcaag agttttggct gaagcaatga gccaagtaac aaatccagct 1560

accataatga tacagaaagg caattttagg aaccaaagaa agactgttaa gtgtttcaat 1620

tgtggcaaag aagggcacat agccaaaaat tgcagggccc ctaggaaaaa gggctgttgg 1680

aaatgtggaa aggaaggaca ccaaatgaaa gattgtactg agagacaggc taatttttta 1740

gggaagatct ggccttccca caagggaagg ccagggaatt ttcttcagag cagaccagag 1800

ccaacagccc caccagaaga gagcttcagg tttggggaag agacaacaac tccctctcag 1860

aagcaggagc cgatagacaa ggaactgtat cctttagctt ccctcagatc actctttggc 1920

agcgacccct cgtcacaata aagatagggg ggcaattaaa ggaagctcta ttagatacag 1980

gagcagatga tacagtatta gaagaaatga atttgccagg aagatggaaa ccaaaaatga 2040

tagggggaat tggaggtttt atcaaagtaa gacagtatga tcagatactc atagaaatct 2100

gcggacataa agctataggt acagtattag taggacctac acctgtcaac ataattggaa 2160

gaaatctgtt gactcagatt ggctgcactt taaattttcc cattagtcct attgagactg 2220

taccagtaaa attaaagcca ggaatggatg gcccaaaagt taaacaatgg ccattgacag 2280

aagaaaaaat aaaagcatta gtagaaattt gtacagaaat ggaaaaggaa ggaaaaattt 2340

caaaaattgg gcctgaaaat ccatacaata ctccagtatt tgccataaag aaaaaagaca 2400

gtactaaatg gagaaaatta gtagatttca gagaacttaa taagagaact caagatttct 2460

gggaagttca attaggaata ccacatcctg cagggttaaa acagaaaaaa tcagtaacag 2520

tactggatgt gggcgatgca tatttttcag ttcccttaga taaagacttc aggaagtata 2580

ctgcatttac catacctagt ataaacaatg agacaccagg gattagatat cagtacaatg 2640

tgcttccaca gggatggaaa ggatcaccag caatattcca gtgtagcatg acaaaaatct 2700

tagagccttt tagaaaacaa aatccagaca tagtcatcta tcaatacatg gatgatttgt 2760

atgtaggatc tgacttagaa atagggcagc atagaacaaa aatagaggaa ctgagacaac 2820

atctgttgag gtggggattt accacaccag acaaaaaaca tcagaaagaa cctccattcc 2880

tttggatggg ttatgaactc catcctgata aatggacagt acagcctata gtgctgccag 2940

aaaaggacag ctggactgtc aatgacatac agaaattagt gggaaaattg aattgggcaa 3000

gtcagattta tgcagggatt aaagtaaggc aattatgtaa acttcttagg ggaaccaaag 3060

cactaacaga agtagtacca ctaacagaag aagcagagct agaactggca gaaaacaggg 3120

agattctaaa agaaccggta catggagtgt attatgaccc atcaaaagac ttaatagcag 3180

aaatacagaa gcaggggcaa ggccaatgga catatcaaat ttatcaagag ccatttaaaa 3240

atctgaaaac aggaaagtat gcaagaatga agggtgccca cactaatgat gtgaaacaat 3300

taacagaggc agtacaaaaa atagccacag aaagcatagt aatatgggga aagactccta 3360

aatttaaatt acccatacaa aaggaaacat gggaagcatg gtggacagag tattggcaag 3420

ccacctggat tcctgagtgg gagtttgtca atacccctcc cttagtgaag ttatggtacc 3480

agttagagaa agaacccata ataggagcag aaactttcta tgtagatggg gcagccaata 3540

gggaaactaa attaggaaaa gcaggatatg taactgacag aggaagacaa aaagttgtcc 3600

ccctaacgga cacaacaaat cagaagactg agttacaagc aattcatcta gctttgcagg 3660

attcgggatt agaagtaaac atagtgacag actcacaata tgcattggga atcattcaag 3720

cacaaccaga taagagtgaa tcagagttag tcagtcaaat aatagagcag ttaataaaaa 3780

aggaaaaagt ctacctggca tgggtaccag cacacaaagg aattggagga aatgaacaag 3840

tagataaatt ggtcagtgct ggaatcagga aagtactatt tttagatgga atagataagg 3900

cccaagaaga acatgagaaa tatcacagta attggagagc aatggctagt gattttaacc 3960

taccacctgt agtagcaaaa gaaatagtag ccagctgtga taaatgtcag ctaaaagggg 4020

aagccatgca tggacaagta gactgtagcc caggaatatg gcagctagat tgtacacatt 4080

tagaaggaaa agttatcttg gtagcagttc atgtagccag tggatatata gaagcagaag 4140

taattccagc agagacaggg caagaaacag catacttcct cttaaaatta gcaggaagat 4200

ggccagtaaa aacagtacat acagacaatg gcagcaattt caccagtact acagttaagg 4260

ccgcctgttg gtgggcgggg atcaagcagg aatttggcat tccctacaat ccccaaagtc 4320

aaggagtaat agaatctatg aataaagaat taaagaaaat tataggacag gtaagagatc 4380

aggctgaaca tcttaagaca gcagtacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa 4440

aaggggggat tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca 4500

tacaaactaa agaattacaa aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg gtttattaca 4560

gggacagcag agatccagtt tggaaaggac cagcaaagct cctctggaaa ggtgaagggg 4620

cagtagtaat acaagataat agtgacataa aagtagtgcc aagaagaaaa gcaaagatca 4680

tcagggatta tggaaaacag atggcaggtg atgattgtgt ggcaagtaga caggatgagg 4740

attaacacat ggaattctgc aacaactgct gtttatccat ttcagaattg ggtgtcgaca 4800

tagcagaata ggcgttactc gacagaggag agcaagaaat ggagccagta gatcctagac 4860

tagagccctg gaagcatcca ggaagtcagc ctaaaactgc ttgtaccaat tgctattgta 4920

aaaagtgttg ctttcattgc caagtttgtt tcatgacaaa agccttaggc atctcctatg 4980

gcaggaagaa gcggagacag cgacgaagag ctcatcagaa cagtcagact catcaagctt 5040

ctctatcaaa gcagtaagta gtacatgtaa tgcaacctat aatagtagca atagtagcat 5100

tagtagtagc aataataata gcaatagttg tgtggtccat agtaatcata gaatatagga 5160

aaatggccgc tgatcttcag acctggagga ggagatatga gggacaattg gagaagtgaa 5220

ttatataaat ataaagtagt aaaaattgaa ccattaggag tagcacccac caaggcaaag 5280

agaagagtgg tgcagagaga aaaaagagca gtgggaatag gagctttgtt ccttgggttc 5340

ttgggagcag caggaagcac tatgggcgca gcgtcaatga cgctgacggt acaggccaga 5400

caattattgt ctggtatagt gcagcagcag aacaatttgc tgagggctat tgaggcgcaa 5460

cagcatctgt tgcaactcac agtctggggc atcaagcagc tccaggcaag aatcctggct 5520

gtggaaagat acctaaagga tcaacagctc ctggggattt ggggttgctc tggaaaactc 5580

atttgcacca ctgctgtgcc ttggaatgct agttggagta ataaatctct ggaacagatt 5640

tggaatcaca cgacctggat ggagtgggac agagaaatta acaattacac aagcttaata 5700

cactccttaa ttgaagaatc gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga attattggaa 5760

ttagataaat gggcaagttt gtggaattgg tttaacataa caaattggct gtggtatata 5820

aaattattca taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt 5880

tctatagtga atagagttag gcagggatat tcaccattat cgtttcagac ccacctccca 5940

accccgaggg gacccgacag gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga gagagacaga 6000

gacagatcca ttcgattagt gaacggatcc ttggcactta tctgggacga tctgcggagc 6060

ctgtgcctct tcagctacca ccgcttgaga gacttactct tgattgtaac gaggattgtg 6120

gaacttctgg gacgcagggg gtgggaagcc ctcaaatatt ggtggaatct cctacaatat 6180

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atacctagaa gaataagaca gggcttggaa aggattttgc tataagctcg aaacaaccgg 6360

tacctctaga actatagcta gcagatcttt ttccctctgc caaaaattat ggggacatca 6420

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tgtgttggaa ttttttgtgt ctctcactcg gaaggacata tgggagggca aatcatttaa 6540

aacatcagaa tgagtatttg gtttagagtt tggcaacata tgcccatatg ctggctgcca 6600

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ccttattcca tagaaaagcc ttgacttgag gttagatttt ttttatattt tgttttgtgt 6720

tatttttttc tttaacatcc ctaaaatttt ccttacatgt tttactagcc agatttttcc 6780

tcctctcctg actactccca gtcatagctg tccctcttct cttatggaga tccctcgacc 6840

tgcagcccaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg 6900

ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa 6960

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ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt 7200

gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct aacttgttta ttgcagctta 7260

taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact 7320

gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct ggatccgctg 7380

cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct 7440

tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 7500

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ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 7740

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ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 7920

cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 7980

attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 8040

ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 8100

aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 8160

gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 8220

tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 8280

ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 8340

taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 8400

atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 8460

actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 8520

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caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 9240

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 9300

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 9360

cctgggtcga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt 9420

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