季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于海洋贝类精深加工技术领域，具体涉及一种季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂及其制备方法和应用。

背景技术

鲍鱼具有丰富的营养价值如蛋白质、多糖、脂肪酸等，其是对人体有益的生物活性物质，其中蛋白质占干重的50％以上。鲍鱼多肽是一类具有广泛生物活性的大分子物质，因其具有抗肿瘤、抗氧化和免疫调节等功能已被众多学者挖掘并应用在保健食品领域，但对鲍鱼多肽的抗菌作用研究较少。即使相关研究表明鲍鱼多肽虽具有一定的抗菌功能，但其抗菌作用相对较弱并不足以实际应用制成抗菌剂。

目前，季铵盐是一种阳离子型抗菌剂，其抗菌机理主要是季铵盐与细菌接触并且渗透进入其细胞壁，然后和细菌细胞膜发生反应破坏细胞膜，进一步导致细胞间物质泄漏，最后细胞壁溶解，从而实现抗菌作用。季铵盐类抗菌剂通常不产生细菌耐药性，因此越来越受到科研工作者以及产品工程师的关注。

市售的抗菌凝胶中多添加抗生素来达到抑菌作用，长期使用含抗生素药物会造成细菌耐受，很可能导致细菌感染而无药可医。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是提供一种季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂。

本发明的第二个目的是提供上述季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂的用途。

为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：

一种季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂，其包括如下组分：

进一步优选地，季铵化鲍鱼抗菌肽粉的制备过程为：将鲍鱼肉打浆处理并配置成溶液，加入木瓜蛋白酶酶解4-5h，然后升温至100℃灭酶活，离心后获得酶解上清液；采用纳滤膜分离上清液，获得的截留液为鲍鱼多肽，经干燥得到鲍鱼多肽粉。

将十二烷基三甲基氯化铵溶于异丙醇中，在60-65℃的磁力搅拌作用下不断加入质量比为1:20鲍鱼多肽粉和十二烷基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，反应6-8h，将反应所得溶液倒入过量的无水乙醇中沉淀，抽滤，洗涤，烘干得到季铵化鲍鱼抗菌肽粉。

具体地，褐藻酸钠来源于褐藻，是一种天然多糖，其水溶液黏度很高，在本发明中是凝胶剂基质的主要原料，相比其他高分子的凝胶剂基质原料更加安全无毒；藻酸丙二醇酯同样来源于海藻，作为稳定剂使用，可增强褐藻酸钠凝胶剂基质的稳定性。

为达到上述第二个目的，本发明的解决方案是：

一种如上述的季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂的制备方法，其包括如下步骤：

(1)、季铵化鲍鱼抗菌肽粉的制备：

制备鲍鱼多肽：鲍鱼肉打浆处理加蒸馏水配置成溶液，加入木瓜蛋白酶酶解4-5h，然后升温至100℃灭酶活，离心后获得酶解上清液；采用500-1000Da纳滤膜对上清液进行分离，获得的截留液即为鲍鱼多肽，经喷雾干燥得到鲍鱼多肽粉；

多肽季铵化：将十二烷基三甲基氯化铵溶于异丙醇中，在60-65℃的磁力搅拌的作用下不断加入质量比为1:20鲍鱼多肽粉和十二烷基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，反应6-8h，将反应所得溶液倒入无水乙醇中沉淀，抽滤，洗涤，烘干得到季铵化鲍鱼抗菌肽粉；

(2)、凝胶剂基质的制备：

称取0.5-1份褐藻酸钠边搅拌边以每30s一滴的速度加入到55-105份水中，升温至65℃加速溶胀，以每30s一滴的速度滴加0.2-0.4份藻酸丙二醇酯至凝胶基质中备用；

(3)、多糖凝胶制备：

季铵化抗菌肽溶解：称取1-2份季铵化鲍鱼抗菌肽粉溶于5-10份纯水中，将季铵化鲍鱼抗菌肽溶液添加到0.3-0.6份百里香精油中备用；

复配：在无菌环境中将季铵化鲍鱼抗菌肽溶解液添加到凝胶剂基质中混匀，得到季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂。

为达到上述第三个目的，本发明的解决方案是：

一种如上述的季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂在制备治疗皮肤创伤中的应用。

一种如上述的季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂在医药和化妆品领域中的应用。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

第一、本发明的季铵化鲍鱼抗菌多肽与带负电的细菌表面相结合，使得细菌细胞膜外正电荷增多，两侧膜电位升高，当抗菌多肽的浓度达到临界值时，其以“毯式”、“桶板”或“环形孔”的方式破坏细菌细胞膜，细菌因内外渗透压失衡而死亡。这种物理作用方式使得季铵化鲍鱼抗菌多肽不易产生耐药性，从而为研发新的抗菌剂提供了方法和路线，具有广阔的市场前景；故本发明的季铵化鲍鱼抗菌多肽具有独特的抗菌机制，又季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂具有较强的抑菌性，因此其在医药和化妆品领域有良好的应用前景。

第二、本发明的鲍鱼多肽自身具有一定的抗菌性，将鲍鱼多肽季铵化反应后得到季铵化鲍鱼抗菌肽的抗菌作用更强；另外，由于鲍鱼多肽难以溶于有机溶剂，而本发明的凝胶基质中添加了有机溶剂，因此季铵化鲍鱼抗菌肽更加容易溶于凝胶基质，易于做成凝胶剂。

第三、本发明的季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂成分简单安全，相容性高，其形成的高分子网络能有效地将季铵化鲍鱼抗菌肽包裹住，对皮肤温和无刺激，具有一定的保湿作用，可作为皮肤创伤的辅助治疗。另外，凝胶剂中添加的百里香精油有清热解毒的作用，加上其自身的药香味可以很好地将季铵化鲍鱼抗菌肽的腥味掩盖，二者相辅相成。

第四、本发明将季铵化鲍鱼抗菌多肽以凝胶剂的形式做成产品，拓宽了鲍鱼多肽的应用领域，有助于提升鲍鱼相关产业的附加值，从而推动海洋贝类精深加工产业的发展。

附图说明

图1为本发明的实施例中季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂的抑菌性能图((a)为大肠杆菌抑菌效果，(b)为金黄色葡萄球菌抑菌效果；-为接种无菌水的阴性对照；+为接种1mg/mL的链霉素和卡那霉素的阳性对照)。

具体实施方式

本发明提供了一种季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂及其制备方法和应用。

以下结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例：

本实施例的的季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂的制备方法包括如下步骤：

(1)、季铵化鲍鱼抗菌肽粉的制备：

制备鲍鱼多肽：鲍鱼肉打浆处理加蒸馏水配置成溶液，加入木瓜蛋白酶酶解4.5h，然后升温至100℃灭酶活，离心后获得酶解上清液；采用800Da纳滤膜对上清液进行分离，获得的截留液即为鲍鱼多肽，经喷雾干燥得到鲍鱼多肽粉；

多肽季铵化：将十二烷基三甲基氯化铵溶于异丙醇中，在60-65℃的磁力搅拌的作用下不断加入质量比为1:20鲍鱼多肽粉和十二烷基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，反应7h，将反应所得溶液倒入无水乙醇中沉淀，抽滤，洗涤，烘干得到季铵化鲍鱼抗菌肽粉；

(2)、凝胶剂基质的制备：

称取0.5份褐藻酸钠边搅拌边以每30s一滴的速度加入到100份水中，升温至65℃加速溶胀，以每30s一滴的速度滴加0.2份藻酸丙二醇酯至凝胶基质中备用；

(3)、多糖凝胶制备：

季铵化抗菌肽溶解：称取2份季铵化鲍鱼抗菌肽粉溶于5份纯水中，将季铵化鲍鱼抗菌肽溶液添加到0.4份百里香精油中备用；

复配：在无菌环境中将季铵化鲍鱼抗菌肽溶解液添加到凝胶剂基质中混匀，得到季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂。

将上述制备的季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂作下列抑菌性能实验：

通过琼脂扩散法测定抑菌圈的大小来判断季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶的抑菌性能。分别将冷冻保存于-80℃下的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在LB固体培养基上划线，置于30℃下培养24h。从活化后的平板上挑取单菌落，接种于25mL的LB液体培养基中，在30℃、200r/min下摇菌24h。以含1％琼脂的LB培养基为下层培养基，向含0.7％琼脂的LB培养基中接种实验菌株，摇匀后制成上层培养基，用打孔器在平板上打孔，孔的直径为0.8cm，每个平板上打三个孔，1个接种季铵化鲍鱼抗菌肽抑菌凝胶，1个接种无菌水阴性对照和1个接种阳性对照(1mg/mL链霉素和卡那霉素的混合液)在30℃恒温下培养24h，观察测量抑菌圈的大小，如图1和表1所示，本发明的季铵化鲍鱼抗菌肽抑菌凝胶剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长均有明显的抑制作用。

表1季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂对不同菌株抑菌圈的测定

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。