AtLOX3基因在调控拟南芥分枝发育中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种AtLOX3基因在调控拟南芥分枝发育中的应用。

背景技术

植物的分枝是决定其形态建成的重要因素，是指植物叶腋处的腋生分生组织(AM)起始并形成腋芽，这些腋芽再快速生长发育形成侧枝的过程。一些植物中腋生分生组织形成后能够迅速生长发育，从而形成分枝；而另一些植物由于受到多因素调控，腋生分生组织很快会进入生长发育停滞的休眠状态，不再形成分枝。植物的分枝发育可以分为2个阶段：第一阶段是AM的形成，第二阶段是AM的生长。植物的分枝受多种因素影响，例如基因、植物激素、自然环境和营养条件等，其中植物激素对植物分枝发育的影响尤为重要。在迄今为止报道的所有激素中，细胞分裂素，生长素，独脚金内酯，脱落酸，赤霉素都对植物分枝具有调控作用。近年来关于茉莉酸的研究主要集中于茉莉酸能够作为信号分子，在植物受到病、虫侵害时，激活植物相对应的抗性，而茉莉酸对于植物分枝能力的调控研究却未见报道。

目前对茉莉酸的合成途径研究的比较透彻了，首先从α-亚麻酸被脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)氧化生成13-氢过氧化亚麻酸(13(S)-hydroperoxy-octadecatrienoic acid，13-HOPT)开始，然后13-HOPT再被丙二烯氧化物合成酶(alleneoxide synthase，AOS)氧化生成12，13(S)-epoxy-octadecatrienoic acid(12,13-EOT)，接着12，13-EOT会在丙二烯氧化物环化酶(allene oxide cyclase，AOC)的作用下生成十二氧植物二烯酸(12-oxo-phytodienoic acid，12-OPDA)和二氧-12-氧代植物二烯酸(dn-OPDA)，以上几步反应的场所都是在叶绿体中。随后OPDA/dn-OPDA在过氧化物酶体中经OPR3和ACX等酶作用下合成不具有生物活性的JA，最后JA被转运到细胞质后被进一步修饰，形成MeJA、JA-IIe和12-羟基茉莉酸(12-OH-JA)(León et al.,1999；Sanders et al.,2000)。LOX、OPR、AOS和AOC都是茉莉酸生物合成途径中的关键酶，它们的表达水平都受茉莉酸的影响，反之茉莉酸的合成也受这些基因的调控，尤其是茉莉酸生物合成中第一个限速酶LOX，当植物受到伤害后，例如干旱、低温、高盐、病虫害和机械损伤等，这些都会诱导LOX基因的表达，从而合成大量茉莉酸类物质来响应这些损伤。苹果在碰伤后的短时间内，其内源茉莉酸含量会快速增加，LOX的表达水平也被激活，此时活性氧在高表达的LOX的作用下其代谢程度也显著加强了，这有助于阻止伤口恶化和伤口的愈合。

有鉴于此，本发明在国内外现有研究基础上，针对缺乏关于茉莉酸合成通路上的关键基因LOX参与调控分枝发育研究的问题，对调控分枝发育的LOX基因进行功能鉴定，在一定程度上加深对植物分枝调控机制的理解，可能为作物育种提供一定的借鉴。

发明内容

本发明的第一目的在于提供AtLOX3基因在调控拟南芥分枝发育中的应用，以解决上述问题中的至少一种。

本发明的第二目的在于提供一种载体。

本发明的第三目的在于提供一种基因工程菌。

本发明的第四目的在于提供一种拟南芥性状相关的标志物。

本发明的第五目的在于提供上述标志物在检测拟南芥分枝发育能力中的应用。

本发明的第六目的在于提供一种检测拟南芥分枝发育能力的试剂。

本发明的第七目的在于提供一种调控拟南芥分枝发育的方法。

第一方面，本发明提供了AtLOX3基因在调控拟南芥分枝发育中的应用，所述AtLOX3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供了一种载体，所述载体含有所述的AtLOX3基因。

作为进一步技术方案，所述载体包括pCambia1300S。

第三方面，本发明提供了一种基因工程菌，含有所述的载体。

第四方面，本发明提供了一种拟南芥性状相关的标志物，所述标志物选自a-c中的任一项：

a.所述的AtLOX3基因；

b.所述AtLOX3基因转录的RNA；

c.所述AtLOX3基因表达的蛋白；

所述性状包括拟南芥分枝发育能力。

第五方面，本发明提供了上述标志物在检测拟南芥分枝发育能力中的应用。

第六方面，本发明提供了一种检测拟南芥分枝发育能力的试剂，所述试剂用于检测所述的标志物；

所述标志物选自a或b。

作为进一步技术方案，所述试剂包括用于扩增AtLOX3基因的RNA的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

第七方面，本发明提供了一种调控拟南芥分枝发育的方法，包括过表达所述的AtLOX3基因，抑制拟南芥的分枝发育。

作为进一步技术方案，过表达AtLOX3基因的方法包括：采用农杆菌转化法，将AtLOX3基因导入拟南芥中。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了AtLOX3基因在调控拟南芥分枝发育中的应用。经发明人研究，首次发现了拟南芥分枝发育相关的LOX基因AtLOX3，该基因能够直接抑制拟南芥分枝发育，且将拟南芥AtLOX3基因过表达到拟南芥lox3突变体中能显著抑制分枝发育，能够在调控植物株型及创制新种质中进行应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为拟南芥野生型、拟南芥lox3突变体及过表达AtLOX3的拟南芥突变体lox3的分枝发育情况。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

第一方面，本发明提供了AtLOX3基因在调控拟南芥分枝发育中的应用，所述AtLOX3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

ATGGCCTTAGCTAAAGAGTTAATGGGTTATCCTCTCATCACAGAAAGGTCATCACTTGTCTCGTCGGCGTCGCATTTCAAGAAGAGGACACAGTCAACACAGTTCTCGATCAACCCTTTTGACCGGAGACCAAGAAAAACCAAATCCGGCGTCGTTGCAGCCATCAGCGAGGATTTGGTCAAAACGCTGCGTTTTTCCACAACGACCGGAGACAGAAAGAGCGAAGAGGAGGAGAAAGCGGCGGTGAAGTTCAAGGTGAGAGCTGTGGTTACTGTGAGGAACAAGAACAAGGAGGATTTGAAAGAGACTCTTGTTAAGCATTTGGATGCTTTTGCTGATAAAATTGGTCGAAACATTGTCTTGGAGCTTATCAGCACCCAACTTGATCCAAAAACGAAGTTGCCGAAGAAAAGCAATGCAGCAGTTTTAAAGGATTGGTCAAAGAAATCGAAAACTAAGGCGGAGAGAGTTCACTATACGGCGGAGTTCACGGTGGATGCAGCGTTTGGCTCGCCGGGAGCAATCACCGTCATGAATAAACACCAAAAAGAGTTTTTCTTGGAGAGCATAACCATTGAAGGCTTCGCACTTGGTCCTGTTCACTTTCCATGCAATTCTTGGGTTCAGTCTCAAAAAGATCACCCTGATAAACGAATTTTCTTCACTAATCAGCCGTATTTGCCGAATGAGACACCAAGCGGATTAAGAGTATTGAGGGAGAAAGAGTTGAAGAATCTACGAGGAGATGGAAGTGGAGTGAGAAAATTATCGGACAGAATTTACGACTTTGATGTTTACAACGACCTTGGAAATCCCGACAAATCATCCGAGCTCTCTCGCCCCAAACTCGGTGGCAAAGAGGTTCCTTACCCTAGACGTTGTCGTACTGGTCGCCAATCAACAGTTTCTGATAAAGACGCGGAGAGCCGAGTAGAGAAGCCATTACCTATGTATGTGCCACGAGACGAGCAATTTGAAGAGTCGAAGCAGGACACTTTTGCTGCAGGGAGGCTAAAAGCAGTCTTACACCACCTAATTCCGTCGCTCAAAGCCAGTATTGTAGCTGAGGACTTTGCAGACTTCGGCGAGATCGATCGTCTTTATAAAGAAGGCTTGTTACCCAAGTTAGGGTTTCAAGATGACATCTTTAAGAAGTTTCCTCTCCCTAAGGTCGTAGTTGATACCCTCCAAGAATCTACTAAAGGACTCCTCAAATACGACACTCCCAAAATATTATCGAAGGATAAAAACGCATGGTTAAGAGATGACGAATTCGCAC

GTCAAGCCATAGCTGGAATCAATCCAGTGAACATTGAGAGAGTCAAG

ACTTTTCCACCGGTCAGCAATCTTGACCCCAAGATCTACGGTCCACAA

CACTCCGCTCTTACTGACGACCATATCATTGGTCACCTCGACGGATTCT

CCGTACAACAAGCGTTGGAAGAGAATAGATTGTATATGTTGGATTACC

ATGACATATTCTTACCGTTCCTAGACCGGATTAATGCGCTAGACGGACG

CAAAGCCTATGCTACTCGAACTATCTTCTTCTTGACTCGTCTAGGCACA

CTTAAGCCGGTAGCCATTGAGCTAAGCCTCCCTCCCCATGGTCCAAAA

CATCGGTCCAAGCGTGTGCTTACACCTCCAGTCGATGCAACCTCTAAT

TGGATGTGGCAGCTCGCTAAAGCCCACGTTAGTTCTAACGATGCTGGT

GTCCATCAGCTTGTCAATCACTGGTTACGGACACATGCATGCTTGGAG

CCATTTATATTAGCTGCACACAGGCAATTGAGCGCTATGCATCCCATAT

TCAAGCTACTGGATCCACACATGAGATACACGTTGGAAATCAATGCTT

TGGCTAGACAATCGTTGATCAGTGCAGATGGTGTGATCGAAGGAGGC

TTCACTGCTGGTGCATACGGCATGGAAATGAGTGCCGCCGCATACAAA

AGCAGCTGGCGGTTCGACATGGAAGGCCTCCCTGCCGATCTAATTCGC

AGAGGAATGGCAATTCCTGATGCAACACAACCACATGGTCTTAAACTC

CTAATCGAAGACTATCCGTACGCCAACGACGGTCTTTTACTCTGGTCA

GCAATCCAAACCTGGGTCCGAACCTATGTTGAACGCTACTATCCAAAC

CCGAACCTTATCAAAACAGACTCTGAGCTCCAATCTTGGTACTCAGAA

TCAATCAACGTCGGCCACGCTGACCTCCGCGACGCTGATTGGTGGCC

GGAGTTATCAACCGTCGACGACCTCGTGTCGATTCTAACCACTCTAAT

CTGGCTCGCCTCTGCTCAACACGCCGCTCTAAACTTTGGACAATACCC

TTACGGTGGCTACGTCCCAAACCGACCACCGTTGATGCGGCGGTTAAT

CCCCGACGAGTCGGATCCAGAGTACGCGAGTTTCATCTCCCATCCGGA

GAAGTATTACTTCTCGTCGATGCCAAGTTTGGCGCAGACTTCGAAGTT

TATGGCCGTGGTTGATACTTTGTCGACGCATTCGCCGGATGAGGAGTAT

ATTGGAGAGAGACAACAGCCGTCGATTTGGACAGGAGATGCGGAGAT

TGTTGAAGCGTTTTATGGATTTGCGGCAGAGATCGGACGGATAGAGAA

AGAGATTGAGAAAAGGAACGCTGATCCTGACCGTAGAAATAGGTGTG

GGGCTGGTGTTTTGCCTTATGAGTTGTTGGTTCCGAGTTCTGAGCCTGGTGTTACGTGTAGAGGTGTACCTAATAGTGTATCTATATAATTAAG(SEQ ID NO.1)。

AtLOX3基因表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

MALAKELMGYPLITERSSLVSSASHFKKRTQSTQFSINPFDRRPRKTKSGVVAAISEDLVKTLRFSTTTGDRKSEEEEKAAVKFKVRAVVTVRNKNKEDLKETLVKHLDAFADKIGRNIVLELISTQLDPKTKLPKKSNAAVLKDWSKKSKTKAERVHYTAEFTVDAAFGSPGAITVMNKHQKEFFLESITIEGFALGPVHFPCNSWVQSQKDHPDKRIFFTNQPYLPNETPSGLRVLREKELKNLRGDGSGVRKLSDRIYDFDVYNDLGNPDKSSELSRPKLGGKEVPYPRRCRTGRQSTVSDKDAESRVEKPLPMYVPRDEQFEESKQDTFAAGRLKAVLHHLIPSLKASIVAEDFADFGEIDRLYKEGLLPKLGFQDDIFKKFPLPKVVVDTLQESTKGLLKYDTPKILSKDKNAWLRDDEFARQAIAGINPVNIERVKTFPPVSNLDPKIYGPQHSALTDDHIIGHLDGFSVQQALEENRLYMLDYHDIFLPFLDRINALDGRKAYATRTIFFLTRLGTLKPVAIELSLPPHGPKHRSKRVLTPPVDATSNWMWQLAKAHVSSNDAGVHQLVNHWLRTHACLEPFILAAHRQLSAMHPIFKLLDPHMRYTLEINALARQSLISADGVIEGGFTAGAYGMEMSAAAYKSSWRFDMEGLPADLIRRGMAIPDATQPHGLKLLIEDYPYANDGLLLWSAIQTWVRTYVERYYPNPNLIKTDSELQSWYSESINVGHADLRDADWWPELSTVDDLVSILTTLIWLASAQHAALNFGQYPYGGYVPNRPPLMRRLIPDESDPEYASFISHPEKYYFSSMPSLAQTSKFMAVVDTLSTHSPDEEYIGERQQPSIWTGDAEIVEAFYGFAAEIGRIEKEIEKRNADPDRRNRCGAGVLPYELLVPSSEPGVTCRGVPNSVSI(SEQ ID NO.2)。

经发明人研究，首次发现了拟南芥分枝发育相关的LOX基因AtLOX3，该基因能够直接抑制拟南芥分枝发育，且将拟南芥AtLOX3基因过表达到拟南芥lox3突变体中能显著抑制分枝发育，能够在调控植物株型及创制新种质中进行应用。

第二方面，本发明提供了一种载体，所述载体含有所述的AtLOX3基因。

该载体导入受体细胞中能够表达AtLOX3。

在一些可选的实施方式中，所述载体包括但不限于pCambia1300S，或者采用本领域技术人员所熟知的其他载体。

第三方面，本发明提供了一种基因工程菌，含有所述的载体。

例如可以将上述载体导入到农杆菌中，进而以农杆菌为介质将目的基因插入至植物基因组中。

第四方面，本发明提供了一种拟南芥性状相关的标志物，所述标志物选自a-c中的任一项：

a.所述的AtLOX3基因；

b.所述AtLOX3基因转录的RNA；

c.所述AtLOX3基因表达的蛋白；

所述性状包括拟南芥分枝发育能力。

由于AtLOX3基因能够抑制拟南芥的分枝发育，据此，可以根据AtLOX3基因、AtLOX3基因转录的RNA或者AtLOX3基因表达的蛋白判断拟南芥分枝发育潜力。

第五方面，本发明提供了上述标志物在检测拟南芥分枝发育能力中的应用。

第六方面，本发明提供了一种检测拟南芥分枝发育能力的试剂，所述试剂用于检测所述的标志物；

所述标志物选自a或b。

通过对上述标志物的检测，可以推断拟南芥分枝发育潜力。

在一些可选的实施方式中，所述试剂包括用于扩增AtLOX3基因的RNA的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

引物F：ATGGCCTTAGCTAAAGAGTTA(SEQ ID NO.3)；

引物R：CTTAATTATATAGATACACTA(SEQ ID NO.4)。

第七方面，本发明提供了一种调控拟南芥分枝发育的方法，包括过表达所述的AtLOX3基因，抑制拟南芥的分枝发育。

在一些可选的实施方式中，过表达AtLOX3基因的方法包括：采用农杆菌转化法，将AtLOX3基因导入拟南芥中。

该方法简单方便，能够有效实现对拟南芥分枝发育的调控。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1AtLOX3的基因克隆

(1)RNA提取

取拟南芥茎段组织，液氮研磨成粉末后利用RN38 EASY spin plus植物RNA快速提取试剂盒提取RNA。按照Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒说明进行cDNA第一链的合成。根据拟南芥基因组测序获得的AtLOX3的CDS序列，设计引物如SEQ ID NO.3-4，利用MCLAB高保真酶对AtLOX3的cDNA序列进行扩增。

PCR反应体系：

反应程序：98℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶后用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。

利用pClone007 Blunt Vector Kit构建克隆载体。

反应体系：

室温加样，轻柔混合后短暂离心，25℃静置10min。

取5μL连接产物加至50μL处于冰水混合物状态的大肠杆菌DH5α感受态，轻弹混匀后冰浴30min；42℃热激60s；冰上静置2～3min；加700μL无抗生素的LB液体培养基；200rpm，37℃振荡培养1h；3,000rpm离心1min；弃600μL上清，悬浮菌体后取适量菌液涂布于含有50mg·L

实施例2拟南芥AtLOX3基因在拟南芥突变体lox3中过表达

拟南芥lox3突变体(该突变体AtLOX3基因功能丧失)和哥伦比亚野生型种子均从Tair(http://www.arashare.cn)上购买。拟南芥lox3突变体的SALK号为：SALK_147830C。

构建AtLOX3-pCambia1300S过表达载体，将含有AtLOX3-pCambia1300S的农杆菌菌液加入50mL LB培养基中，培养至OD600为1.0时，收集菌体，用悬浮液(乙酰丁香酮150μmol·L

挑选生长健壮处于盛花期的拟南芥lox3突变体，浸染前去掉果荚，将花序完全浸没再含农杆菌得重悬液中，侵染1min后，继续放回人工气候室培养，一般需要侵染2-3次，每次间隔2-3天，等拟南芥种子成熟时收集种子置于37℃培养箱干燥3～7天。播种前在4℃冰箱放置2天左右，最后在35mg·L

结果如图1所示，拟南芥突变体lox3(lox3组)的分枝数量显著多于野生型(WT)组，将拟南芥AtLOX3基因过表达到拟南芥突变体lox3中(AtLOX3OE组)，发现突变体的分枝数量显著降低，这一结果表明AtLOX3负调控植物的分枝发育。

本发明表明AtLOX3负调控植物的分枝发育，可应用于拟南芥及其他植物的分枝发育的调控和分子育种。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。