GsHA24蛋白及其相关生物材料在调控植物耐逆性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及GsHA24蛋白及其相关生物材料在调控植物耐逆性中的应用。

背景技术

土地盐碱化严重威胁我国乃至世界农业的发展，全球有9.54亿公顷盐碱土壤，其中，中国占10％左右。全世界约20％的可耕种地和50％的灌溉地受盐碱化影响。我国地域辽阔，盐碱地几乎遍布全国，甚至在东北地区拥有世界三大盐碱地之一的松嫩平原，这严重影响了我国东北地区农业系统的正常发展，限制粮食产量的增长。随着社会经济不断发展和人口数量不断增长，土壤面积和质量均有降低，在改善土壤质量和提高粮食单产之外，合理开发利用盐碱地成为增加我国粮食产量的重要举措之一，也是实现农业可持续发展的关键因素之一。随着生物技术的飞速发展，通过分子育种改良作物的耐盐碱性已成为盐碱地开发利用的手段之一。其关键在于了解耐盐碱的分子机制，挖掘功能显著的耐盐碱关键调控基因。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物耐逆性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了与植物耐逆性相关蛋白GsHA24的新用途。

本发明提供了GsHA24蛋白在如下1)或2)中的应用：

1)调控植物耐逆性；

2)培育耐逆性提高的转基因植物；

所述GsHA24蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

a2)在序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐逆性相关的蛋白质；

a4)与序列3所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于大豆且与植物耐逆性相关的蛋白质。

其中，序列3由956个氨基酸残基组成。

上述a2)所述的蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述a3)所述的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a4)所述的蛋白质中，“同一性”包括与本发明的序列3所示的氨基酸序列具有90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同源性的氨基酸序列。

上述a1)或a2)或a3)或a4)所述的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了与GsHA24蛋白相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与GsHA24蛋白相关的生物材料在如下1)或2)中的应用：

1)调控植物耐逆性；

2)培育耐逆性提高的转基因植物；

所述生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：

A1)编码GsHA24蛋白的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下B1)或B2)或B3)或B4)所示的基因：

B1)序列1所示的基因组DNA分子；

B2)序列2所示的cDNA分子；

B3)与B1)或B2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GsHA24蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

B4)在严格条件下与B1)或B2)或B3)限定的核苷酸序列杂交，且编码GsHA24蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码蛋白质GsHA24的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码蛋白质GsHA24的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码蛋白质GsHA24且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述应用中，A2)所述的含有编码蛋白质GsHA24的核酸分子的表达盒(GsHA24基因表达盒)是指能够在宿主细胞中表达蛋白质GsHA24的DNA，该DNA不但可包括启动GsHA24转录的启动子，还可包括终止GsHA24转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。

可用现有的表达载体构建含有所述GsHA24基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述应用中，所述耐逆性为耐盐碱性；所述耐盐碱性具体为耐碳酸盐胁迫；所述耐碳酸盐胁迫具体为耐NaHCO

所述调控植物耐逆性为提高植物耐逆性；所述提高植物耐逆性体现为：在NaHCO

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述拟南芥可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育耐逆性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中蛋白质GsHA24的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。

上述方法中，所述耐逆性为耐盐碱性；所述耐盐碱性具体为耐碳酸盐胁迫。

进一步的，所述耐碳酸盐胁迫为耐NaHCO

更进一步的，所述耐NaHCO

上述方法中，所述提高受体植物中蛋白质GsHA24的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达蛋白质GsHA24。

进一步的，所述过表达的方法为将蛋白质GsHA24的编码基因导入受体植物。

更进一步的，所述蛋白质GsHA24的编码基因如序列表中序列2所示。

上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述拟南芥可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述GsHA24基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明将GsHA24基因超表达于拟南芥中，得到转GsHA24拟南芥。通过实验证明：在碳酸盐胁迫下，转GsHA24拟南芥的种子萌发速率和展叶率均高于受体植物。说明GsHA24基因可增强拟南芥对碳酸盐胁迫的耐性，GsHA24蛋白可以为培育具有碳酸盐胁迫耐性的转基因植物的研究奠定基础。

附图说明

图1为GsHA24基因在苏打盐碱胁迫下的表达模式分析。

图2为转GsHA24基因抗性植株的PCR检测结果。

图3为转GsHA24基因抗性植株的RT-PCR检测结果。

图4为转GsHA24拟南芥萌发期耐苏打盐碱胁迫分析。

图5为转GsHA24拟南芥成苗期耐苏打盐碱胁迫分析。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的大豆材料G07256记载于文献“Ge Y,Li Y,Zhu YM,Bai X,Lv DK,Guo DJ,Ji W,Cai H:Global transcriptome profiling of wild soybean(Glycinesoja)rootsunder NaHCO

下述实施例中的pCAMBIA330035Su记载于文献“Xiaoli Sun,Wei Ji,XiaodongDing,Xi Bai,Hua Cai,Shanshan Yang,Xue Qian,Mingzhe Sun,YanmingZhu.GsVAMP72,a novel Glycine soja R-SNARE protein,is involved in regulatingplant salttolerance and ABA sensitivity.Plant Cell Tiss Organ Cult 2013,113:199–215”中，公众可从黑龙江八一农垦大学处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的根癌农杆菌GV3101记载于文献“Lee CW,etal.Agrobacteriumtumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogendefense in Arabidopsisthaliana,Plant Cell,2009,21(9),2948-62”中，公众可从黑龙江八一农垦大学处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、野生大豆中耐苏打盐碱相关基因GsHA24的获得

一、野生大豆苏打盐碱胁迫应答GsHA24基因的筛选

在前期研究中，从吉林西部重度盐碱地(pH＝10.6)采集了345份野生大豆材料，经过碳酸盐胁迫处理(50mM NaHCO

二、GsHA24全长基因的克隆

1、挑选饱满的野生大豆G07256种子，在浓H

2、以OligodT为引物进行cDNA第一条链的合成，方法参见Invitrogen公司SuperScript

3、用PrimeSTAR

F：5’-ATGGCTGAGAAGGAAGAAG-3’；

R：5’-CTAGATAGTGTATGCTTGCTGTATTG-3’。

4、将GsHA24基因全长CDS区与pEASY-T载体连接，构建得到pEASY-GsHA24克隆载体。

实施例2、GsHA24基因在苏打盐碱胁迫条件下的表达模式分析

1、对3周龄的野生大豆G07256幼苗进行50mM NaHCO

2、采用Trizol reagent(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取总RNA，利用反转录试剂盒SuperScript

3、采用SYBR定量试剂盒SYBR Premix ExTaqTM II Mix(TaKaRa,Shiga,Japan)于荧光定量PCR仪ABI 7500(Applied Biosystems,USA)上进行Real-time PCR检测基因表达量。定量分析采用比较CT法(△△CT)，以GsGAPDH基因(Genbank登录号：DQ355800)为内参，未经处理的样品作为参照因子，每个样品包括生物学重复和技术重复各3次。经GsGAPDH基因均一化处理后，通过2

定量Real-time PCR如图1所示。结果表明：苏打盐碱胁迫处理后，GsHA24基因表达量呈上升趋势，在苏打盐碱胁迫处理12h后，GsHA24基因的表达量达到最大值，表明GsHA24基因的表达受苏打盐碱胁迫诱导。

实施例3、GsHA24转基因拟南芥植株的获得及耐盐碱性分析

一、GsHA24转基因拟南芥的获得及鉴定

1、引物的设计

根据GsHA24基因序列及pCAMBIA330035Su载体，设计基因特异引物。引物序列如下(下划线代表载体构建时所需的接头序列，其中U为USER酶切位点)：

GsHA24-U-F：5’-GGCTTAAUATGGCTGAGAAGGAAGAA-3’；

GsHA24-U-R：5’-GGTTTAAUTCTAGATAGTGTATGCTTGCTG-3’。

2、GsHA24基因全长CDS区的扩增

以构建好的pEASY-GsHA24为模板，采用步骤1中的引物进行PCR扩增，得到GsHA24基因片段。

3、GsHA24基因植物超量表达载体pCAMBIA330035Su-GsHA24的构建

用限制性内切酶PacI和Nt.BbvCI对pCAMBIA330035Su载体进行双酶切，得到载体酶切产物。将获得的载体酶切产物、USER酶(NEB，M5505S)和步骤2获得的GsHA24基因片段在37℃下孵育20min，利用USER酶对GsHA24基因片段的尿嘧啶处进行切割，形成可与pCAMBIA330035Su载体互补的粘性末端，接着25℃下孵育20min，并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(全式金，CD201-01)，得到的重组表达载体记作pCAMBIA330035Su-GsHA24，并送交测序。

测序结果表明：pCAMBIA330035Su-GsHA24为在pCAMBIA330035Su载体的两个PacI酶切位点间插入序列2所示的DNA分子，且保持pCAMBIA330035Su载体的其他序列不变后得到的载体。

4、重组农杆菌的构建

采用冻融法，将GsHA24基因植物超量表达载体转化根癌农杆菌GV3101，经PCR鉴定获得重组农杆菌pCAMBIA330035Su-GsHA24/GV3101。

5、转GsHA24拟南芥的获得及鉴定

将重组农杆菌pCAMBIA330035Su-GsHA24/GV3101通过Floral-dip法侵染野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)。将T

(1)PCR鉴定

采用EasyPure Plant Genomic DNA Kit基因组提取试剂盒(全式金，EE111-01)，提取野生型拟南芥植株和固杀草抗性植株的基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，并采用实施例1中的全长克隆引物进行PCR鉴定(扩增产物大小为2871bp)。

部分抗性植株的鉴定结果如图2所示。从图中可以看出：抗性植株GsHA24-1、GsHA24-2、GsHA24-3、GsHA24-7、GsHA24-8、GsHA24-9、GsHA24-10和GsHA24-11均扩增得到目的条带，而野生型拟南芥植株没有扩增得到的目的条带。

(2)RT-PCR鉴定

对PCR鉴定阳性的植株，提取总RNA，利用实施例2中的real-time PCR扩增引物进行半定量RT-PCR，以拟南芥ACTIN2基因为内参，检测GsHA24基因在转基因植株中的表达量。ACTIN2基因特异引物序列如下：ACTIN2-RT-F：5’-TTACCCGATGGGCAAGTC-3’；ACTIN2-RT-R：5’-GCTCATACGGTCAGCGATAC-3’。

结果如图3所示。从图中可以看出：野生型拟南芥植株的RT-PCR无扩增产物，而转GsHA24拟南芥均可以扩增出目的条带，表明外源基因GsHA24不但已顺利整合到拟南芥的基因组上，而且能够在转基因拟南芥中正常转录表达。

将RT-PCR阳性的T

二、转GsHA24拟南芥的耐苏打盐碱分析

1、转GsHA24拟南芥萌发期的耐苏打盐碱分析

选取饱满的野生型拟南芥、T

结果如图4所示。结果表明：碱胁迫严重抑制了野生型与转GsHA24拟南芥种子的萌发，但转GsHA24拟南芥的种子萌发速率高于野生型(图4A、4B、4C、4D)，展叶率高于野生型(图4E)。

2、转GsHA24拟南芥幼苗期的耐苏打盐碱分析

选取饱满的野生型拟南芥、T

结果如图5所示。结果表明：苏打盐碱胁迫处理后野生型和转GsHA24拟南芥都逐渐失绿发黄，变紫甚至死亡，但是转GsHA24拟南芥的长势明显优于野生型。

上述结果表明：GsHA24基因超量表达显著提高了植物对苏打盐碱胁迫的耐受性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 黑龙江八一农垦大学

<120> GsHA24蛋白及其相关生物材料在调控植物耐逆性中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8374

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

agacacaata agtacaattg aggaatatta tagaagcaga gtgtacctgc aagtacatga 60

aatcctcata gaggtgttta ccatgctgtc cttaaaaagc tgccactttg agagttaagt 120

taggacacac acacaaagaa gaaaccaaaa gcacaagaaa cgtcacaaca cacattctat 180

attgggttga agatagaaaa aaaaaacagt gttttctttg tgtgatttct cttctggttc 240

tgggtattgt gttattcacc tgaagcttac acctttctgt tgtggatcac ctaaaacttg 300

ggttttgatt gagatggctg agaaggaaga agccatgcgc gttgttttga aggaagctgt 360

ggatttggta cgaaacagag caacttatta ctctattttt ctttgttgat ggaattgttt 420

gaactgtttg tttttagttc ttatgttgtg gttttacttt tctttttatt ttttgttcat 480

ttttagtatt tttttcataa aaaaaatcat ggggttgatg agtgtttctg gtgttgggag 540

ttttaaatta tgttctgttt ttggcaaatt tcctctgttt ctgtttgtat tttttttttt 600

ttaattttgt ttattttttg gttacatttt tttcttttaa tttccttgca ggaaaacgtg 660

ccacttgagg aggtgtttca gactctgagg tgtgattcaa atggactcac aacagaatct 720

gctgaggaga ggttggccat ctttggccac aacaaacttg aagagaagaa ggtctttcgc 780

ttaaattttt tttccctctt cagtgtggaa agatggtttg tatttgcaga tgtgaaaaga 840

cccttttctc tattatttga tgggaaaatg taaagtacgg cctttttgag gtagaaaggg 900

aaaataagta gagaaagaag gtgagatatg tgatgaagag agagagagag agagagagag 960

agagagaaaa tgaagtagaa agagatgaaa cagaaaggaa tatatattta ccaaaatctg 1020

acactgatat gatatgatat tatgaactgt tggttaataa gaatgaattt atttttttcc 1080

tttgttggag aactttgaaa gagagttact cctgccttaa tccaaagctg gtttctattt 1140

acaactttag tttctctgct gagcttttgt tgtttgtgag gttctatgtc tttccttatg 1200

aattttgcag gagagcaagg ttttgaagtt tttaggattt atgtggaatc ctctttcatg 1260

ggtcatggaa gctgcagcaa tcatggccat tgctttggcc aatggaggag taagctgctg 1320

catactttta cgttttaatt gtatattgtg ttgaaaatat ttattttgat ttctgtgtgt 1380

gtgaatgcac ataatagaag aaagactttc aaaaatggtt gtaaaaagtt attttgacat 1440

tattttattg gtttttgcct atttcctaaa tatttatctt catattcttc agggcaaacc 1500

tcctgattgg caagactttg ttgggattat cacactcctt attatcaatt caacaataag 1560

tttcattgag gagaacaatg ctggtaatgc tgccgcagct ctgatggctc gtctagcacc 1620

taaagctaag gtattagtta tcagaagatt ataggtctgt ttgtattgat tggtaactca 1680

ctttcatgaa aatgaaaaaa atttgcttcc attttatttg ccttgtaatt catgcacgag 1740

ttaatatcag ccattgatct tccttcataa cttgtgccac gttgggccaa catgaattca 1800

aagagatgct atgtcttttt tgctagcata tagttttgga ttttggtgtg aggtttaagt 1860

gaaaacatta gattcatata tatgtcttgt cttaatttga cttttgctga taatattcct 1920

aaaatacttt ttcagttcct tcgagatggg aaatgggttg aggaggatgc tagcattctt 1980

gttccgggtg atataattag tgttaagcta ggggatatta tccctgcgga tgctcgtcta 2040

cttgaaggcg atccactgaa gattgatcag gtgcatcttg ctgcctttac tgttttgttt 2100

cctgctgtca tgttatcata tttgttttgt tgattgctta tgtttctggt ttgtgttaca 2160

gtctgcactt acaggcgagt ctcttcctgt cacgaaaggc cacggtgata gtgtttattc 2220

gggctccaca tgcaagcagg gagagatcaa tgcagttgtt atcgccacag gagttcatac 2280

cttctttggc aaggctgccc atcttgtgga ctccacaaat caagttggcc attttcagaa 2340

ggtaaaatga atcctttttt tttatacatt taatgttttt ttcggtacat aaaggtaaaa 2400

tgaaaccgaa actctttgaa actgcattta tccaaaaata agaaggaaat aaacaattca 2460

ctggagcaaa tgcaattaag tgtcaccaaa tgcaagacta aggacctcaa gcattagtga 2520

caccttacta agttagctat tggaaaacat gttagaatgg aatggaacag aacatataag 2580

ttttatttaa tgtttggtcc attttaaaag tagaacatag ttaaaagtca tatgtttttg 2640

gtttcactaa aaaaaggggt gaaaccaaat agaaaagaat ataacaaaat gttttgtatt 2700

atcttgtcca tgtgcttacc actacctata tcataatata gacaaataat ttatgaaaac 2760

acagtgatat atgcttaaaa tttgttggct ctctacaagc ccccctttga tttcgttttc 2820

tcctttatat ttagaataat atgcttcaca ttgacactta gcattgttct gggttcctga 2880

aataggtcct gactgctatt ggaaacttct gcatatgttc cattgctgtg ggaatgatag 2940

tagagatcat tgtcatgtac ccaattcaac accgggaata tcgtcctggg attgacaatc 3000

tgctcgtgct tcttatcgga ggaattccta ttgccatgcc tactgttttg tcagtgacaa 3060

tggcaattgg atcccatcgc ttagctcagc aggtagacat tagtgcttct tgaaaagcag 3120

ttgtctcaag ttttaatcaa ttagatgtta gtctttatag tttatgcttt atataatcat 3180

tgcagggtgc tattactaaa agaatgacag caatagaaga gatggcagga atggatgtat 3240

tatgtagcga caaaactgga actttgactt tgaataaact gacagttgac aagaatctta 3300

ttgaggttag aagtagtcag ttttgtactg tgttgttttc ttatttgcct tgtcgtatgc 3360

tcacacaagt gttttcaatg ttttctgtag atttttgcta aaggagttga cgtagatact 3420

gttgttctga tggccgctcg ggctgcgcga ttggaaaacc aagatgctat agatgcctct 3480

attgtaggca tgttgggtga tccaaaagag gtaggttcat atatgataat atatataact 3540

ttttcatgct tgcaaaacat gctgttcaat ttaattgttg ttgttgtagt gttgtgtttc 3600

tactaaaaaa aaaagaacct acattactat tcccttttct gtttgctaca tgctgttgta 3660

tctgagtttg tttaaaaatt aggcaagggc tggtattcaa gaggttcact tcctaccctt 3720

caatccaact gacaagcgga ctgcgatcac ttatacagac agtgaaagta aaatgcatcg 3780

tgtcagcaaa ggagcaccgg agcaggtatt tttgcgagcc aactcagctt tttttataat 3840

ggttccacat gactatagaa ctgattcata cttttcatta ctactagatt ttaaatcttg 3900

cacgcaataa atcagagata gaacgtagag ttcattctgt cattgataag tttgcagaca 3960

ggggcttacg gtctcttgca gtagcctacc aggtacatat gcatttatgc tctttctttt 4020

gtggtggaga tagcaaattc aagttacaat gcatgtcatt actgactgca tttatcatta 4080

tatcccagga agttcctgat ggaaagaaag aaagccaagg agggccttgg caatttattg 4140

gactgttgcc tttatttgac ccacctagac atgatagtgc tcagacaata cgaagggcat 4200

taaatcttgg agtaaatgtt aaaatgataa caggtatttg tcctctgcat gatattatat 4260

attaaacaga agaaattaat acatccatgt tttttttttt tgctttacat aatacgtcct 4320

tgtttatttc tcttgatggc tcatggctct atatttcaat attaaattat aacatggaag 4380

aatttaatgg cattggattc agacttgctg ttggttaagt aattgcacag aaagaaacaa 4440

gttttctcca aacttgaata gcacctctta ttacgactgt ggctagtatc aacataaatt 4500

tgcttcttgg ctaagtgctt gatttgctat ttttgcatgg tttgtacatc aatctttgta 4560

cagcaagtct agtctctttt agatgcgtca cttgtgcttt gggcataata ataggagtga 4620

tttatggatt cttctattga ggtataatat atttaagagt tccaatttct ttaggtgatc 4680

aactagcaat aggaaaagaa acaggacgcc gtctggggat gggaaccaac atgtaccctt 4740

catcagcttt attgggccaa aacaaggatg aatcaattgc taccttgcca gttgatgagt 4800

tgattgaaaa agcagatgga tttgctggtg tttttcctgg tataacatct ttcttttctc 4860

tttaatttct tagtatttag aaacatatgc agacattcaa taaccttgct tcagttgatg 4920

gtggcaacaa gcttacaatc tatgaaatac attggacaag aaacttcatg gaactgtggc 4980

gtttttccat tctgccatga tatttgcatg aaatgataat gattgtttac tttcatatgt 5040

tgtttttctc ttttatttgt ctgacttaat gagtttattt aatacagaac acaaatatga 5100

gatcgtgaaa cgtttacaag ctaggaaaca catatgtgga atgactggtg atggggttaa 5160

tgatgctcct gctcttaaaa aggcggatat tggaatagct gttgctgatg ctactgacgc 5220

agctcgtagt gcttctgaca ttgttctgac tgaacctggt ctcagtgtta tcatcagtgc 5280

tgtattgacc agtcgagcaa tattccaaag gatgaagaat tacacagtga gcctacattc 5340

agttgtaaca tcttttgagt ttggttttga ctttaggaag tttgatattc tgctgcatca 5400

tcttccccgt aaatggcaca tgcctaccta agaaccatta ccccaccatc ttagttataa 5460

aaatgataat tatgattttc tacttttcat tcattgattt tcttttgaac agatctatgc 5520

agtttccatc acaatccgta ttgtggtaag ttttatagtc taagcttgag tataagctat 5580

tcttctttta gacatgtgac tttgattact aactttgaat ttattttgac agcttggttt 5640

catgttactg gccctcatat ggcaatttga ttttccacca ttcatggtgc tgattattgc 5700

tattcttaat gatggtatgt accttatttt tcttcactaa catggatccc cctcttttta 5760

ctagtgaagt catggatatt tttgtcacta ttacctcata attaatgcca aataccatgt 5820

ttctcatttt ttttcactgg tgttgtcaaa gagatcctgt ttctgatatc aaatcccctt 5880

attacttttt tttccaccct taaacttata caatctttga ttttgtcagg taccattatg 5940

acaatatcaa aggacagggt aaaaccatct ccatatccag atagctggaa gttggcagag 6000

atctttacca ctggaataat tcttggtggt tatttggcta tgatgacagt tattttcttt 6060

tgggcagcat acaaaacaga ttttttccct gtaagaaaca cttttttatc aacttaattt 6120

atcatgattg ttaagccaat aatccttatg atttgtataa aatctaatgc ttactttgaa 6180

tcactaattt agctcaattt cttgtattga tgctcattat gaaattttca gcaaacattt 6240

ggagtctcaa gtcttcagaa aaaagatagg gatgacttta gaaagcttgc ctcagcaata 6300

tacctacaag ttagcacagt tagtcaggcc ctcatatttg ttacacgggc acggagttgg 6360

tcatttgttg agcgtccagg cttgttactt gtagcagctt ttgttattgc ccagttggtg 6420

agtgaattca acactcaaca ctactaaccc aaaggattgg tgcagtggtg taaggttccg 6480

ctgcattcac ataagtgaga acgatttatt taacaggaga acccatgttc attcccatcg 6540

ggtgcaaaat ttccttgaac cagcggtagc catgcaccac aagcgggatt agtctctgat 6600

ctaatgagtt gggggacacc cgtggtctct aacctagaca aaaaaaaaac actcaacact 6660

acttttggca tatgcacatc gtgaacataa tataataacc tgtccatttg ctttgttgag 6720

cagatagcta ccttaattgc agtttacgca aattggagtt ttgctgcgat tgaagggatt 6780

ggatggggct gggctggtgt tgtttggctt tacaacctcg tcttttatat cccacttgat 6840

tttatcaagt tcataattcg atatgccttg agtggaaggg cttgggatct tgttattgaa 6900

caaagggtat gtgttcccta tctgttaaaa ggactagttc aacatttaaa ccttttgctc 6960

actttctagt atggaatctt tgtcagattg cttttacaag gaaaaaagat tttggaaagg 7020

aagaacgtga acttaaatgg gcacatgcac ataggacgct tcacggcctt cacccaccag 7080

agactaagat gttcaatgaa cgtacaagtt acacagaact taatcagatg gccgaagagg 7140

ctagaagacg tgcaaacatt gcaaggtatg catgcatgca tgtgtttcta tgatgatctg 7200

gtcttgaggt agtttgctgt atatgcatac cctcttacat gttgcatgtt acccccaagt 7260

gagtttgctg ataatatgca ctggtagagt ttaagtacca gcttatttgg acttatcaaa 7320

taattaacat aagcatcttg tgtaagtgtt tgggagacct tatgaaaata gcttatgata 7380

tgtctgtaag ctgatttcag cttatctgaa aaagctctcc aaaataacgc ttataaaaac 7440

atcttacggt ctatatgaaa atagtattat cccatttcct tttaaattat agatatcact 7500

tgtacgtaag tgcttatcat attcaataag tacttaaata agttgtttac tcagatgggt 7560

cctaagattt tatttttttg gtgtacaaaa gtcacattga ggttcaaacc tagaatatta 7620

tgcatgctac tccaaccccc caccactagg ccgaccctag tgggttgagt cctaagacta 7680

ttagtacttg attaatcatt gattcataca aaaatggtag ttgacacatt ttattttaaa 7740

agagattgga gtttacacca tgcatcatcc acttgatatc aagttatttc taacctattt 7800

ttggaatcat gatttgctaa cacgtttaat cgatttcccc cctcaagttg taaaccatgt 7860

aaatggtatg gatttaaggt ccacatgaaa tgaaggttat ggttgaaact cttgacataa 7920

ataattccat atctaaagtg gtttatctgt aatatagcaa ctattattat tattattatt 7980

attattatta ttattattat tattattatt atgatttatg tgtgaatgta aataaccttt 8040

agctttgtgc ccttatattt atatcatttc gttttttttt ctttgcaggc tgagagaact 8100

gcatacactg acgggccatg ttgagtctgt gtttagactg aagggccttg acattgacac 8160

aatacagcaa gcatacacta tctagaataa tgttgagttt catgcatgaa tcgtttatgt 8220

ttaatgtatg tataatgccg ttagaagagt gtgatcatag agcagcaaaa aatatatact 8280

ttataaatgt ttgttcaaag cagttttggt ggacttttgt agacatgaaa ctattggtgc 8340

atttaaatgt taaagagttc catttatgct tcca 8374

<210> 2

<211> 2871

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atggctgaga aggaagaagc catgcgcgtt gttttgaagg aagctgtgga tttggaaaac 60

gtgccacttg aggaggtgtt tcagactctg aggtgtgatt caaatggact cacaacagaa 120

tctgctgagg agaggttggc catctttggc cacaacaaac ttgaagagaa gaaggagagc 180

aaggttttga agtttttagg atttatgtgg aatcctcttt catgggtcat ggaagctgca 240

gcaatcatgg ccattgcttt ggccaatgga ggaggcaaac ctcctgattg gcaagacttt 300

gttgggatta tcacactcct tattatcaat tcaacaataa gtttcattga ggagaacaat 360

gctggtaatg ctgccgcagc tctgatggct cgtctagcac ctaaagctaa gttccttcga 420

gatgggaaat gggttgagga ggatgctagc attcttgttc cgggtgatat aattagtgtt 480

aagctagggg atattatccc tgcggatgct cgtctacttg aaggcgatcc actgaagatt 540

gatcagtctg cacttacagg cgagtctctt cctgtcacga aaggccacgg tgatagtgtt 600

tattcgggct ccacatgcaa gcagggagag atcaatgcag ttgttatcgc cacaggagtt 660

cataccttct ttggcaaggc tgcccatctt gtggactcca caaatcaagt tggccatttt 720

cagaaggtcc tgactgctat tggaaacttc tgcatatgtt ccattgctgt gggaatgata 780

gtagagatca ttgtcatgta cccaattcaa caccgggaat atcgtcctgg gattgacaat 840

ctgctcgtgc ttcttatcgg aggaattcct attgccatgc ctactgtttt gtcagtgaca 900

atggcaattg gatcccatcg cttagctcag cagggtgcta ttactaaaag aatgacagca 960

atagaagaga tggcaggaat ggatgtatta tgtagcgaca aaactggaac tttgactttg 1020

aataaactga cagttgacaa gaatcttatt gagatttttg ctaaaggagt tgacgtagat 1080

actgttgttc tgatggccgc tcgggctgcg cgattggaaa accaagatgc tatagatgcc 1140

tctattgtag gcatgttggg tgatccaaaa gaggcaaggg ctggtattca agaggttcac 1200

ttcctaccct tcaatccaac tgacaagcgg actgcgatca cttatacaga cagtgaaagt 1260

aaaatgcatc gtgtcagcaa aggagcaccg gagcagattt taaatcttgc acgcaataaa 1320

tcagagatag aacgtagagt tcattctgtc attgataagt ttgcagacag gggcttacgg 1380

tctcttgcag tagcctacca ggaagttcct gatggaaaga aagaaagcca aggagggcct 1440

tggcaattta ttggactgtt gcctttattt gacccaccta gacatgatag tgctcagaca 1500

atacgaaggg cattaaatct tggagtaaat gttaaaatga taacaggtga tcaactagca 1560

ataggaaaag aaacaggacg ccgtctgggg atgggaacca acatgtaccc ttcatcagct 1620

ttattgggcc aaaacaagga tgaatcaatt gctaccttgc cagttgatga gttgattgaa 1680

aaagcagatg gatttgctgg tgtttttcct gaacacaaat atgagatcgt gaaacgttta 1740

caagctagga aacacatatg tggaatgact ggtgatgggg ttaatgatgc tcctgctctt 1800

aaaaaggcgg atattggaat agctgttgct gatgctactg acgcagctcg tagtgcttct 1860

gacattgttc tgactgaacc tggtctcagt gttatcatca gtgctgtatt gaccagtcga 1920

gcaatattcc aaaggatgaa gaattacaca atctatgcag tttccatcac aatccgtatt 1980

gtgcttggtt tcatgttact ggccctcata tggcaatttg attttccacc attcatggtg 2040

ctgattattg ctattcttaa tgatggtacc attatgacaa tatcaaagga cagggtaaaa 2100

ccatctccat atccagatag ctggaagttg gcagagatct ttaccactgg aataattctt 2160

ggtggttatt tggctatgat gacagttatt ttcttttggg cagcatacaa aacagatttt 2220

ttccctcaaa catttggagt ctcaagtctt cagaaaaaag atagggatga ctttagaaag 2280

cttgcctcag caatatacct acaagttagc acagttagtc aggccctcat atttgttaca 2340

cgggcacgga gttggtcatt tgttgagcgt ccaggcttgt tacttgtagc agcttttgtt 2400

attgcccagt tgatagctac cttaattgca gtttacgcaa attggagttt tgctgcgatt 2460

gaagggattg gatggggctg ggctggtgtt gtttggcttt acaacctcgt cttttatatc 2520

ccacttgatt ttatcaagtt cataattcga tatgccttga gtggaagggc ttgggatctt 2580

gttattgaac aaaggattgc ttttacaagg aaaaaagatt ttggaaagga agaacgtgaa 2640

cttaaatggg cacatgcaca taggacgctt cacggccttc acccaccaga gactaagatg 2700

ttcaatgaac gtacaagtta cacagaactt aatcagatgg ccgaagaggc tagaagacgt 2760

gcaaacattg caaggctgag agaactgcat acactgacgg gccatgttga gtctgtgttt 2820

agactgaagg gccttgacat tgacacaata cagcaagcat acactatcta g 2871

<210> 3

<211> 956

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Ala Glu Lys Glu Glu Ala Met Arg Val Val Leu Lys Glu Ala Val

1 5 10 15

Asp Leu Glu Asn Val Pro Leu Glu Glu Val Phe Gln Thr Leu Arg Cys

20 25 30

Asp Ser Asn Gly Leu Thr Thr Glu Ser Ala Glu Glu Arg Leu Ala Ile

35 40 45

Phe Gly His Asn Lys Leu Glu Glu Lys Lys Glu Ser Lys Val Leu Lys

50 55 60

Phe Leu Gly Phe Met Trp Asn Pro Leu Ser Trp Val Met Glu Ala Ala

65 70 75 80

Ala Ile Met Ala Ile Ala Leu Ala Asn Gly Gly Gly Lys Pro Pro Asp

85 90 95

Trp Gln Asp Phe Val Gly Ile Ile Thr Leu Leu Ile Ile Asn Ser Thr

100 105 110

Ile Ser Phe Ile Glu Glu Asn Asn Ala Gly Asn Ala Ala Ala Ala Leu

115 120 125

Met Ala Arg Leu Ala Pro Lys Ala Lys Phe Leu Arg Asp Gly Lys Trp

130 135 140

Val Glu Glu Asp Ala Ser Ile Leu Val Pro Gly Asp Ile Ile Ser Val

145 150 155 160

Lys Leu Gly Asp Ile Ile Pro Ala Asp Ala Arg Leu Leu Glu Gly Asp

165 170 175

Pro Leu Lys Ile Asp Gln Ser Ala Leu Thr Gly Glu Ser Leu Pro Val

180 185 190

Thr Lys Gly His Gly Asp Ser Val Tyr Ser Gly Ser Thr Cys Lys Gln

195 200 205

Gly Glu Ile Asn Ala Val Val Ile Ala Thr Gly Val His Thr Phe Phe

210 215 220

Gly Lys Ala Ala His Leu Val Asp Ser Thr Asn Gln Val Gly His Phe

225 230 235 240

Gln Lys Val Leu Thr Ala Ile Gly Asn Phe Cys Ile Cys Ser Ile Ala

245 250 255

Val Gly Met Ile Val Glu Ile Ile Val Met Tyr Pro Ile Gln His Arg

260 265 270

Glu Tyr Arg Pro Gly Ile Asp Asn Leu Leu Val Leu Leu Ile Gly Gly

275 280 285

Ile Pro Ile Ala Met Pro Thr Val Leu Ser Val Thr Met Ala Ile Gly

290 295 300

Ser His Arg Leu Ala Gln Gln Gly Ala Ile Thr Lys Arg Met Thr Ala

305 310 315 320

Ile Glu Glu Met Ala Gly Met Asp Val Leu Cys Ser Asp Lys Thr Gly

325 330 335

Thr Leu Thr Leu Asn Lys Leu Thr Val Asp Lys Asn Leu Ile Glu Ile

340 345 350

Phe Ala Lys Gly Val Asp Val Asp Thr Val Val Leu Met Ala Ala Arg

355 360 365

Ala Ala Arg Leu Glu Asn Gln Asp Ala Ile Asp Ala Ser Ile Val Gly

370 375 380

Met Leu Gly Asp Pro Lys Glu Ala Arg Ala Gly Ile Gln Glu Val His

385 390 395 400

Phe Leu Pro Phe Asn Pro Thr Asp Lys Arg Thr Ala Ile Thr Tyr Thr

405 410 415

Asp Ser Glu Ser Lys Met His Arg Val Ser Lys Gly Ala Pro Glu Gln

420 425 430

Ile Leu Asn Leu Ala Arg Asn Lys Ser Glu Ile Glu Arg Arg Val His

435 440 445

Ser Val Ile Asp Lys Phe Ala Asp Arg Gly Leu Arg Ser Leu Ala Val

450 455 460

Ala Tyr Gln Glu Val Pro Asp Gly Lys Lys Glu Ser Gln Gly Gly Pro

465 470 475 480

Trp Gln Phe Ile Gly Leu Leu Pro Leu Phe Asp Pro Pro Arg His Asp

485 490 495

Ser Ala Gln Thr Ile Arg Arg Ala Leu Asn Leu Gly Val Asn Val Lys

500 505 510

Met Ile Thr Gly Asp Gln Leu Ala Ile Gly Lys Glu Thr Gly Arg Arg

515 520 525

Leu Gly Met Gly Thr Asn Met Tyr Pro Ser Ser Ala Leu Leu Gly Gln

530 535 540

Asn Lys Asp Glu Ser Ile Ala Thr Leu Pro Val Asp Glu Leu Ile Glu

545 550 555 560

Lys Ala Asp Gly Phe Ala Gly Val Phe Pro Glu His Lys Tyr Glu Ile

565 570 575

Val Lys Arg Leu Gln Ala Arg Lys His Ile Cys Gly Met Thr Gly Asp

580 585 590

Gly Val Asn Asp Ala Pro Ala Leu Lys Lys Ala Asp Ile Gly Ile Ala

595 600 605

Val Ala Asp Ala Thr Asp Ala Ala Arg Ser Ala Ser Asp Ile Val Leu

610 615 620

Thr Glu Pro Gly Leu Ser Val Ile Ile Ser Ala Val Leu Thr Ser Arg

625 630 635 640

Ala Ile Phe Gln Arg Met Lys Asn Tyr Thr Ile Tyr Ala Val Ser Ile

645 650 655

Thr Ile Arg Ile Val Leu Gly Phe Met Leu Leu Ala Leu Ile Trp Gln

660 665 670

Phe Asp Phe Pro Pro Phe Met Val Leu Ile Ile Ala Ile Leu Asn Asp

675 680 685

Gly Thr Ile Met Thr Ile Ser Lys Asp Arg Val Lys Pro Ser Pro Tyr

690 695 700

Pro Asp Ser Trp Lys Leu Ala Glu Ile Phe Thr Thr Gly Ile Ile Leu

705 710 715 720

Gly Gly Tyr Leu Ala Met Met Thr Val Ile Phe Phe Trp Ala Ala Tyr

725 730 735

Lys Thr Asp Phe Phe Pro Gln Thr Phe Gly Val Ser Ser Leu Gln Lys

740 745 750

Lys Asp Arg Asp Asp Phe Arg Lys Leu Ala Ser Ala Ile Tyr Leu Gln

755 760 765

Val Ser Thr Val Ser Gln Ala Leu Ile Phe Val Thr Arg Ala Arg Ser

770 775 780

Trp Ser Phe Val Glu Arg Pro Gly Leu Leu Leu Val Ala Ala Phe Val

785 790 795 800

Ile Ala Gln Leu Ile Ala Thr Leu Ile Ala Val Tyr Ala Asn Trp Ser

805 810 815

Phe Ala Ala Ile Glu Gly Ile Gly Trp Gly Trp Ala Gly Val Val Trp

820 825 830

Leu Tyr Asn Leu Val Phe Tyr Ile Pro Leu Asp Phe Ile Lys Phe Ile

835 840 845

Ile Arg Tyr Ala Leu Ser Gly Arg Ala Trp Asp Leu Val Ile Glu Gln

850 855 860

Arg Ile Ala Phe Thr Arg Lys Lys Asp Phe Gly Lys Glu Glu Arg Glu

865 870 875 880

Leu Lys Trp Ala His Ala His Arg Thr Leu His Gly Leu His Pro Pro

885 890 895

Glu Thr Lys Met Phe Asn Glu Arg Thr Ser Tyr Thr Glu Leu Asn Gln

900 905 910

Met Ala Glu Glu Ala Arg Arg Arg Ala Asn Ile Ala Arg Leu Arg Glu

915 920 925

Leu His Thr Leu Thr Gly His Val Glu Ser Val Phe Arg Leu Lys Gly

930 935 940

Leu Asp Ile Asp Thr Ile Gln Gln Ala Tyr Thr Ile

945 950 955