一种培养野生弯柄灵芝的方法

技术领域

本发明涉及可食用菌培养技术领域，特别是一种培养野生弯柄灵芝的方法。

背景技术

弯柄灵芝Ganoderma flexipes是Patouillard于1907年首次基于采集于越南Tonkin的标本而报道的新种，Steyeart、Ryvarden、赵继鼎和张小青、Wang&Wu等学者对该种做过研究。《中国大型菌物资源图鉴》、《海南莺歌岭大型真菌图鉴》等专著对其均有描述。其主要形态特征是子实体一年生，软木栓质至木栓质；菌盖近匙形至近圆形，小型、表面黄红褐色至红褐色，具漆状光泽，边缘钝或呈截形；具背生或中生柄，弯曲，表面与菌盖同色；菌肉浅黄褐色至褐色，皮壳细胞形态较规则，担孢子椭圆形，纹饰相对较细。夏秋季单生于阔叶林中、竹林中地下腐木上，造成木材白色腐朽。通常，在野外弯柄灵芝与年幼的紫芝G.sinense相似度较高，但是弯柄灵芝菌盖颜色相对较浅，没有达到紫红甚至近紫黑色的状态，且通常情况下，其菌盖在成熟时也较小，与年幼时差异不大。

目前，国内针对灵芝属真菌的研究与开发主要集中在赤芝G.lingzhi和紫芝G.sinense等种类，而弯柄灵芝作为热带、亚热带区域的优势品种之一，其相关研究却较少见报道。因此，开展弯柄灵芝的相关研究与开发具有重要的科学意义和产业价值。

发明内容

本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种培养野生弯柄灵芝的方法。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

一种培养野生弯柄灵芝的方法，包括以下步骤：

S1、制备培养基，所述培养基为：碳源20g，氮源2g，KH

S2、用打孔器从长满野生弯柄灵芝菌株菌丝体的平板同一半径处打孔获得7mm菌丝块，接种在培养基平板上，于15-30℃恒温培养箱中避光培养。

优选地，所述碳源为淀粉。

优选地，所述氮源为酵母粉。

优选地，所述培养基的pH为9。

优选地，所述培养温度为30℃。

优选地，所述步骤S1中，用1mol/L盐酸或1mol/L的氢氧化钠调节培养基的pH。

与现有技术相比，本发明的野生弯柄灵芝的最适培养条件为：碳源淀粉、氮源酵母粉、pH 9.0、温度30℃，在该培养情况下野生弯柄灵芝生长最快，长势最优，且更喜欢在偏碱性环境下生长；为进一步开发和利用弯柄灵芝资源提供基础研究数据，也为研究该属的近缘种类生物学特性与驯化栽培研究提供了基础数据参考。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。

弯柄灵芝野生子实体采自海南尖峰岭国家级自然保护区，经组织分离、纯化后获得纯培养菌株，由中国热带农业科学院热带生物技术研究所菌物标本馆(FCATAS)鉴定、保藏，菌株编号为FCATAS3；该菌株经宏观形态、显微结构特征综合鉴定为弯柄灵芝。经ITS序列分析，并在Gen Bank运用Blast进行同源性比对得出，与灵芝属的弯柄灵芝最大同源性高达99.84％，结合宏观形态、显微结构鉴定为弯柄灵芝(Ganoderma flexipes)，其ITS碱基序列为：

本实施例的一种培养野生弯柄灵芝的方法，具体步骤如下：

S1、制备培养基，所述培养基为：淀粉20g，酵母粉2g，KH

S2、用打孔器从长满野生弯柄灵芝菌株菌丝体的平板同一半径处打孔获得7mm菌丝块，接种在培养基平板上，于30℃恒温培养箱中避光培养。

在利用上述方法及培养基培养情况下野生弯柄灵芝生长最快，长势最优，且更喜欢在偏碱性环境下生长。

进一步为了验证上述培养基培养情况的可行性，进行以下菌丝体生物学特性研究。

首先确定碳源基础培养基：蛋白胨2g，MgSO

氮源基础培养基：葡萄糖20g，MgSO

不同碳源对菌丝生长的影响

以碳源基础培养基为空白对照，分别设置7种碳源(淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露醇、麦芽糖)作为处理组，浓度均为20g/L。用打孔器从长满菌丝体的平板同一半径处打孔获得7mm菌丝块，接种在7种碳源培养基平板

不同氮源对菌丝生长的影响

以氮源基础培养基为空白对照，分别设置7种氮源(蛋白胨、酵母粉、硝酸铵、硝酸钠、氯化铵、尿素、硝酸钾)作为处理组，浓度均为2g/L。

不同p H对菌丝生长的影响

用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节PDA培养基pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在PDA平板培养基

不同温度对菌丝生长的影响

打孔取7mm菌丝块，接种于PDA平板培养基

以菌丝生长速度和菌丝长势为评价指标，选用上述碳源、氮源、pH和温度4个单因素试验结果确定的最优3组水平处理为正交试验因素，按照无交互作用的L9(34)正交试验获得最佳组合，结果如下：

碳源对菌丝生长的影响

由表1可知，供试菌株在7种碳源培养基上均可生长，可以看出弯柄灵芝对碳源的需求较为广泛。菌丝平均生长速度由快到慢依次为：淀粉>葡萄糖>蔗糖>果糖>麦芽糖>乳糖>甘露醇>空白对照；其中，空白对照培养基上菌丝生长速度最慢，长势最差；在淀粉为碳源的培养基上菌丝生长速度最快，菌丝最浓密、粗壮，生长情况良好；综合菌丝生长速度及长势，淀粉为弯柄灵芝菌丝生长最适碳源。

表1

注:采用Duncan's multiple range test方法分析，同一列不同字母表示显著性差异(p<0.05，n＝3)。

小写字母代表是在0.05水平下比较，差异显著；大写字母代表在0.01水平下比较，差异极显著。

“+”表示菌丝稀疏、纤弱；“++”表示菌丝密、长势一般；“+++”表示菌丝稠密、粗壮。

**：数据为4次的平均值和标准差，下同。

氮源对菌丝生长的影响

由表2可知，供试菌株在7种氮源培养基上均可生长；菌丝平均生长速度由快到慢依次为：酵母粉>硝酸钾>硝酸铵>蛋白胨>氯化铵>空白>硝酸钠>尿素；在以酵母粉为氮源时，菌丝生长速度最快，长势最好，与空白对照存在显著性差异；以硝酸钠、尿素为氮源时，与空白对照不存在显著性差异，说明硝酸钠、尿素对菌丝生长速度影响不大；综合菌丝生长速度及长势，酵母粉为弯柄灵芝菌丝生长最适氮源。

表2

pH对菌丝生长的影响

由表3可知，在不同的pH梯度中，弯柄灵芝均能生长；综合菌丝长势及生长速度，在pH为9.0时弯柄灵芝菌丝生长情况最好；其它p H梯度培养基中菌丝生长情况较差，差异不显著；由此可见，弯柄灵芝菌丝生长最适p H为9.0。

表3

温度对菌丝生长的影响

由表4可知，弯柄灵芝在4种温度下均能生长，菌丝平均生长速度由快到慢依次为：30℃>32℃>25℃>20℃>15℃；综合菌丝长势和生长速度，弯柄灵芝菌丝生长的最适温度为30℃。

表4

正交试验

单因素试验并未考虑到因素间交互作用的影响，不能将其结果作为最终结论。因此对碳源、氮源、pH和温度4个因素进行正交试验，从单因素试验中挑出每种因素3个最优水平处理，组建4因素3水平的正交分析表(表5)，以期选出最适宜的培养基组合，为弯柄灵芝的驯化栽培奠定基础。

表5

由表6可知，根据4因素分别对弯柄灵芝菌丝生长速率分析发现，当碳源为淀粉、氮源为酵母粉、pH为9.0、温度为30℃时，最适合菌丝生长，与单因素试验相符。4种生长因素对弯柄灵芝的显著性差异顺序是：pH>氮源>温度>碳源，与直观分析结果一致。

表6

由上述弯柄灵芝生长因子单因素试验和在此基础上进行的正交试验结果表明，弯柄灵芝的最适培养条件为：碳源淀粉(20g/L)、氮源酵母粉(2g/L)、pH9.0、温度30℃。据相关报道，多数大型真菌在碳源选择上以葡萄糖为最优，但在本研究中淀粉是弯柄灵芝的最佳碳源。氮源利用方面，酵母粉为有机氮源，其氮源物质大多以易吸收的蛋白质降解物形式存在，而降解物特别是氨基酸可通过转氨作用直接被菌丝吸收，为速效氮源，易于菌丝更快地利用。本发明得出弯柄灵芝菌丝在pH值为9.0的情况下生长最快，长势较好，表明其更喜欢在偏碱性环境下生长。这与Sérgio Luiz Moreira Neto等研究得出大多数多孔菌适宜在pH值显酸性环境中生长不一致。本发明中，菌丝在30℃情况下生长最快，长势最优，菌落边缘整齐且菌丝洁白，在35℃时，平板生长减慢，而接种块在40℃菌丝不生长。根据供试菌株的采集时间和气候条件分析，弯柄灵芝应为高温型真菌。正交试验考虑了各因素之间的交互影响作用，本试验得出4种因素对弯柄灵芝菌丝生长影响显著性差异顺序是pH>氮源>温度>碳源，pH较其它3种因素对菌丝生长优劣的影响较大，多种因素共同作用时菌丝的生长会倾向于对其影响更大的因素，而对影响较小的因素采取一定适应性，建议培养弯柄灵芝优先满足最适pH，其次考虑氮源，最后为生长温度和碳源。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。