circ-0007527作为靶点在筛选用于治疗腹膜透析相关腹膜纤维化的药物中的应用

技术领域

本发明属于药物学领域，涉及环状RNA circ-0007527，具体来说是circ-0007527作为靶点在筛选用于治疗腹膜透析相关腹膜纤维化的药物中的应用。

背景技术

慢性肾脏病(Chronic kidney disease，CKD)是一种全球性的高发疾病，据首个全国性慢性肾脏病横断面研究显示，我国CKD总患病率已达10.8％，患病人数超过1.2亿。CKD患者肾脏功能持续性恶化就会进一步发展为终末期肾病(End stage renal disease，ESRD)。近年来，随着糖尿病和高血压的发病率不断升高，ESRD在各国的患病人数也不断攀升，且因其预后转归不理想、病程跨度大、个人及社会负担大等因素，致使ESRD已成为一个全球关注的重大公共卫生问题。

目前，腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)是ESRD患者肾脏替代治疗方法之一，是肾脏移植前较为理想且有效的治疗手段。腹膜透析是利用患者自身腹膜来滤过溶质，将非生理性1.5％或2.5％葡萄糖-乳酸盐的腹膜透析液通过导管注入患者腹腔内，利用腹膜两侧的浓度梯度差(溶质的弥散作用和水分的渗透作用)来清除尿毒症患者体内的代谢产物、毒性物质并纠正水、电解质紊乱。

与血液透析相比，腹膜透析具有以下几个优点：保护患者残肾功能、血流动力学稳定、经济负担轻、适合居家治疗、时间相对自由以及回归社会率高等。因此，腹膜透析在临床上有较高的普及率，也更容易被ESRD患者及其家庭所接受。但长期腹膜透析会引起腹膜纤维化，造成腹膜结构改变和功能受损，从而导致超滤失败，退出腹膜透析队列继而只能选择血液透析或肾脏移植。因此，对于腹膜纤维化发生机制和预防的研究，对临床PD患者的生存质量和预后转归具有重要的意义。

腹膜纤维化是临床PD患者一种常见的并发症，腹膜正常结构被破坏，腹膜间皮细胞出现损伤，影响了腹膜透析超滤功能，对患者的生存质量、治疗效果以及预后转归都产生重大的影响。非生理性腹透液所含有的葡萄糖以及生产加工消毒过程中产生的葡萄糖降解产物(Glucose degradation products，GDPs)和糖基化终末期产物(Advance glycationend productions，AGEs)，包括甲基乙二醛、乙二醛和3-脱氧葡糖醛酮，会直接造成腹膜间皮细胞的损伤和脱落，是细胞表型转化发生的原因之一。

研究证实，腹膜间皮细胞损伤是整个腹膜纤维化过程中的始动因素，主要表现为腹膜间皮细胞正常骨架破坏松散，细胞依附能力减弱并脱落，失去原有细胞形态并发生上皮细胞-间充质转化(Epithelial mesenchymal transformation，EMT)，侵袭性增加，引起细胞外基质堆积，纤维组织增生，最终发展为腹膜纤维化病变。因此，腹膜间皮细胞表型转化、增殖及凋亡是腹膜纤维化发生的关键调控机制。

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类具有闭合环状结构的非编码RNA分子，没有5’帽子结构和3’poly(A)结构，主要位于细胞质或储存于外泌体中，不受RNA外切酶影响，表达更稳定且不易降解，已被证明广泛存在于多种真核生物体内。大多数circRNA是由外显子环化而成，也有部分circRNA是由内含子环化而成的套索结构。circRNA具有组织特异性、疾病特异性、时序特异性及高稳定性等特征。

近几年，大量的研究表明circRNA在生物的生长发育、胁迫应答、疾病发生和发展等方面密切相关，并预测其在疾病诊断标记物及靶向治疗等方面的应用前景，但其生物学功能在很大程度上仍然未知。目前研究已证实circRNA在多种肿瘤疾病中发挥重要调控作用，并参与多种实质性脏器的纤维化过程，例如肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化以及心肌纤维化等，但circRNA与腹膜透析相关腹膜纤维化的作用关系尚未有研究报道。

小干扰RNA(Small interfering RNA；siRNA)有时称为短干扰RNA(shortinterfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA)，是一个长20到25个核苷酸的双股RNA，在生物学上有许多不同的用途。已知siRNA主要参与RNA干扰(RNAi)现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了circ-0007527作为靶点在筛选用于治疗腹膜透析相关腹膜纤维化的药物中的应用，所述的这种应用要解决现有技术中尚无有效的药物用于治疗长时间腹膜透析后腹膜纤维化的技术问题。

本发明提供了circ-0007527作为靶点在筛选用于治疗腹膜透析相关腹膜纤维化的药物中的应用。

本发明还提供了circ-0007527的抑制剂在制备用于治疗腹膜透析相关腹膜纤维化的药物中的应用。

本发明还提供了circ_0007527siRNA在制备用于治疗腹膜透析相关腹膜纤维化的药物中的应用，所述的circ_0007527siRNA的正义链为5'-GAACAAGGACCAUGGGUUUTT-3'，反义链为5'-AAACCCAUGGUCCUUGUUCTT-3'。

本发明还提供了检测circ-0007527的试剂在制备检测腹膜组织纤维化的试剂盒中的应用。

本发明通过circRNA高通量测序，在高糖腹透液诱导的小鼠腹膜纤维化模型中，筛选其腹膜组织中所表达的circRNA，经生物信息学分析后发现circ-0007527在纤维化的腹膜组织中差异表达量最高，并通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)验证其在纤维化的腹膜组织中高表达。进一步体外细胞实验发现下调circ-0007527的表达，能够显著抑制腹膜间皮细胞表型转化、增殖及凋亡，进而减轻腹膜损伤，延缓腹膜纤维化进展。

本发明所述的circ-0007527是第一个被发现且证实有效的调控腹膜纤维化的环状RNA，填补了circRNA与腹膜透析相关腹膜纤维化作用关系这一领域的研究空白。本发明所述的circ-0007527的具体信息如下。染色体编号：chr16；circRNA全长的起始位点：20656542；circRNA全长的终止位点：20657609；正负链：+；circRNA全长：1067；circRNA剪切后的长度：147；circRNA来源基因：ENSMUSG00000006998；circRNA剪切信息：exon:20656543-20656689。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明所筛选的circ-0007527，是第一个被发现且证实有效的调控腹膜纤维化的环状RNA，下调circ-0007527的表达，能够显著抑制腹膜间皮细胞表型转化、增殖及凋亡，进而减轻腹膜损伤，延缓腹膜纤维化进展。因此，circ-0007527为制备防治腹膜透析相关腹膜纤维化药物提供了新的治疗靶点和治疗途径。其相关的抑制剂有望成为临床用药用于防治腹膜透析后腹膜纤维化的发生。

本发明公开了一种环状RNA circ-0007527及其在制备防治腹膜透析相关腹膜纤维化药物中的应用。研究表明通过下调circ-0007527的表达，能够显著抑制腹膜间皮细胞表型转化、增殖及凋亡，进而减轻腹膜损伤，延缓腹膜纤维化进展。

附图说明

图1：构建4.25％高糖腹透液诱导的小鼠腹膜纤维化模型。

图2：circ-0007527高表达于纤维化的腹膜组织中。

图3：抑制circ-0007527表达可阻断腹膜间皮细胞表型转化。

图4：抑制circ-0007527表达可下调Fibronectin的表达，并恢复E-cadherin的表达。

图5：抑制circ-0007527表达可阻断腹膜间皮细胞增殖。

图6：抑制circ-0007527表达可阻断腹膜间皮细胞凋亡。

具体实施方式

实施例1材料和方法

1)试剂耗材

Fibronectin、E-cadherin、p27、Cyclin E、Bax、Cleaved caspase 3和Bcl-2抗体均购于Cell Signaling Technology公司。Collagen I(A2)、PCNA和GAPDH抗体购于SantaCruz公司。α-SMA抗体和其他试剂购于Sigma公司。siRNA购于上海吉玛基因。

2)小鼠腹膜纤维化模型和实验分组

根据文献报道方法建立小鼠腹膜纤维化模型。所有动物实验均遵守中国实验动物管理和使用条例。

28天4.25％高糖腹透液诱导小鼠腹膜纤维化模型：

a.Sham组(n＝10只)：腹腔注射同等剂量的0.9％生理盐水，持续28天；

b.PDF组(n＝10只)：腹腔注射100ml/kg 4.25％高糖腹透液，持续28天。

3)细胞培养及处理

人腹膜间皮细胞(HMrSV5)用含5％胎牛血清，0.5％青霉素和链霉素的DMEM/Highglucose培养液培养，培养条件为37℃，5％二氧化碳和95％空气。使用TGF-β1(2ng/ml)或高糖腹透液(4.25％)刺激36小时，并分别转染Con siRNA和circ-0007527siRNA。36小时后提取蛋白，-80℃冰箱冻存以做分子生物学分析。

4)环状RNA测序

确定组间差异性表达蛋白，采用ClusterProfiler软件对差异基因集进行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析和基因集富集分析(GSEA)，并通过基因共表达网络构建(WGCNA)确定相关基因在信号通路上的富集表达情况。

5)腹膜形态及纤维化定性观察

Masson染色：组织固定于4％多聚甲醛液，常规脱水包埋，切片脱蜡至水后用重铬酸钾媒染剂处理组织12-18h，Weiger氏铁苏木素染5-10分钟流水稍洗，1％盐酸酒精分化，流水冲洗数分钟返蓝，丽春红酸性品红液染5-10分钟，蒸馏水快速漂洗，磷钼酸水溶液处理约3-5分钟，不用水洗，直接用苯胺蓝液复染2-5分钟，1％冰醋酸处理1分钟，95％酒精脱水多次，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

6)免疫印迹

细胞样品加200ul蛋白裂解液混匀，静置20分钟。4℃，12000r/min.离心10min，取上清，用BCA蛋白定量试剂盒(sunbio)测定蛋白浓度。再依次制作8％分离胶和5％浓缩胶，加样，电泳，待溴酚蓝至胶底时终止电泳，湿法电转移至PVDF膜，90min，放入TBST中洗3次5min/次，用TBST配制5％脱脂奶粉，将膜浸入后，室温放置lh。用封闭液将一抗按比例(1：1000)稀释，与膜共同孵育，4℃过夜。TBST洗3次，5min/次。用封闭液稀释HRP标记的二抗，稀释比倒1：2000，与膜共同孵育1.5h。TBST洗3次，5min/次，ECL曝光。照相后用LabWorks软件对图像进行灰度分析。相对含量的变化＝目的蛋白灰度/GAPDH灰度。

7)免疫荧光染色

(a)封闭：用疏水笔将组织圈起，配制封闭液(PBS+2％BSA+0.2％ Triton X-100)，室温封闭1小时。(b)一抗孵育：倒去封闭液，每个组织滴加50μL一抗稀释液(用封闭液配制)，剪取适当大小的封口膜盖在一抗稀释液上，使抗体在切片上孵育均匀，4℃冰箱过夜。(c)二抗孵育：PBS洗片四次后配置相应荧光二抗(1:1000)，每个组织滴加50μL，室温避光孵育1小时。(d)DAPI复染细胞核：将二抗弃去，PBS漂洗4次后使用DAPI染液染色10min。(e)封片：滴加抗荧光淬灭剂，从组织一侧慢慢盖上盖玻片，不要产生气泡，手指轻轻按压盖玻片，以排除多余淬灭剂。用指甲油涂抹盖玻片和载玻片空隙，晾干，及时拍照，封片后可置于4℃冰箱保存。(f)数据分析：封片后显微镜下观察，并分析图像结果。

8)统计学分析

采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计学分析，所有涉及定量资料均采用均值±标准差表示，并使用t检验分析和方差分析，P＜0.05判定为具有统计学差异。

实施例2构建4.25％高糖腹透液诱导的小鼠腹膜纤维化模型

本发明中所使用的动物模型是4.25％高糖腹透液诱导的小鼠腹膜纤维化模型。每天给予小鼠腹腔注射4.25％的高糖腹透液(100ml/kg)，28天后收取小鼠腹膜标本及血清标本，进行后续实验检测。Masson染色(图1A)及天狼星红染色(图1C)都可在PDF组中观察到增厚的腹膜下区域，提示有腹膜纤维化病灶产生。同时，与Sham对照组相比，其定量的阳性面积百分比也显著升高(图1B和1D)，说明我们已成功建立小鼠腹膜纤维化模型，为后续研究提供必要实验基础。

实施例3circ-0007527高表达于纤维化的腹膜组织中

在上述小鼠模型基础上，我们分别在Sham组和PDF组中进行环状RNA高通量测序，并进行后续的一系列生物信息学分析，包括采用ClusterProfiler软件对差异基因集进行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析和基因集富集分析(GSEA)，并通过基因共表达网络构建(WGCNA)确定相关基因在信号通路上的富集表达情况。数据分析结果发现circ-0007527在纤维化的腹膜组织中差异表达量最高(图2A)。同时，我们通过实时荧光定量PCR技术也再次验证了，在纤维化的腹膜组织中circ-0007527高表达(图2B)。这一结果说明circ-0007527可能参与了腹膜透析相关腹膜纤维化的过程。

实施例4抑制circ-0007527表达可阻断腹膜间皮细胞表型转化

根据实施例3的环状RNA高通量测序结果，确定目标基因circ-0007527的全长基因序列，通过RNase III酶切割RNA前体，以获得合适长度的siRNA分子前身，并转导入细胞中，发挥抑制基因表达的作用。

circ_0007527siRNA的序列5'-GAACAAGGACCAUGGGUUUTT-3'(正义链),5'-AAACCCAUGGUCCUUGUUCTT-3'(反义链)。

进一步在体外细胞实验中使用TGF-β1(2ng/ml)刺激腹膜间皮细胞36小时，并分别转染Con siRNA和circ-0007527siRNA，观察circ-0007527对于腹膜间皮细胞表型转化EMT的影响。荧光定量PCR结果证实TGF-β1刺激能够显著上调circ-0007527在腹膜间皮细胞中的表达量(图3A)。

免疫印迹结果提示使用特异性siRNA抑制circ-0007527的表达，能够下调α-SMA、Collagen I和Fibronectin的表达量，并恢复上皮细胞标志物E-cadherin的表达(图3B-F)，说明circ-0007527与细胞表型转化有关，抑制circ-0007527表达可阻断腹膜间皮细胞表型转化。

实施例5抑制circ-0007527表达可下调Fibronectin的表达，并恢复E-cadherin的表达

在免疫印迹的基础上，我们又通过细胞免疫荧光染色检测了不同处理组中Fibronectin和E-cadherin的表达情况。结果同样证实circ-0007527siRNA组的Fibronectin阳性细胞表达量显著低于Con siRNA组(图4A和4B)，而E-cadherin阳性细胞表达量则明显增多(图4C和4D)，再次说明抑制circ-0007527表达可阻断腹膜间皮细胞表型转化。

实施例6抑制circ-0007527表达可阻断腹膜间皮细胞增殖

在后续实验中，我们通过检测多个与细胞增殖相关的标志物蛋白(p27、PCNA和Cyclin E)来观察circ-0007527与细胞增殖的关系。结果发现TGF-β1能够刺激腹膜间皮细胞发生异常增殖，而转染siRNA抑制circ-0007527的表达后，其p27含量有大幅度升高，而PCNA和Cyclin E的表达量则显著下降(图5A-D)。在免疫荧光染色中也证实circ-0007527siRNA组中PCNA阳性细胞计数显著低于对照组细胞(图5E和5F)。上述结果说明抑制circ-0007527表达可阻断腹膜间皮细胞增殖。

实施例7抑制circ-0007527表达可阻断腹膜间皮细胞凋亡

腹膜间皮细胞凋亡也是腹膜损伤和腹膜纤维化进展中一个关键机制，主要原因是由于腹透患者所用的非生物相容性腹膜透析液中含有的葡萄糖及其降解产物。因此，在体外研究中我们使用4.25％的高糖腹透液来刺激腹膜间皮细胞，从而模拟这一损伤过程。结果证实体外高糖腹透液刺激会诱导腹膜间皮细胞发生凋亡，表现为促凋亡基因Bax和Cleaved caspase 3的升高，以及抗凋亡基因Bcl-2的下降，而使用siRNA抑制circ-0007527的表达后，上述蛋白的表达量得以逆转(图6A-F)，即抑制了腹膜间皮细胞凋亡发生。这一结果说明抑制circ-0007527表达可阻断腹膜间皮细胞凋亡。