用于捕获细菌的探针材料的制备方法及其在冷却肉中细菌磁分离前处理中的应用

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，涉及纳米技术和生物技术。具体地，尤其涉及一种可用于捕获细菌的探针材料制备方法及其在冷却肉中细菌磁分离前处理中的应用，其利用磁性复合材料的捕获性能和磁分离特性来高效率识别、分离和富集冷却猪肉样品中的细菌。

背景技术

对食品中细菌数量的检测通常被用作食品质量指标，以揭示微生物的水平，预警食品的受污染程度。但是由于食品基质的复杂性，要有效分离富集细菌是颇具挑战性的。因此开发选择性强、捕获率高、分离富集时间短的前处理方法显得至关重要。近年来，磁性材料发展迅速，被广泛应用于生物学、医学等领域。其中，磁性Fe

磁分离技术利用磁性材料的磁响应性和生物兼容性，可以实现对细菌精准、快速的分离和富集，在复杂食品样品的预处理中得到了深入研究。因此，结合磁分离技术和对细菌有识别作用的生物标记材料，旨在构建针对冷却猪肉中细菌的磁分离前处理方法，为净化食品基质和富集微量目标提供了新的选择，为发展高灵敏度和高效率的食品安全检测新技术提供了新的方向。

CN114181834A公开了一种聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米粒子快速富集分离金黄色葡萄球菌的方法，属于生物技术领域。本发明方法包括磁性纳米粒子与聚乙烯亚胺进行偶联、聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米粒子复合物捕获样品液中的目的菌，通过外加磁场的作用，将被捕获目标菌与样品液进行分离及重悬等步骤。本发明通过磁分离捕获到的目的菌可以直接进行后续分析；与传统的细菌磁分离方法相比，本发明方法可以对食品基质中的大部分细菌进行磁分离，不仅提高了样品中金黄色葡萄球菌分离效率，同时也降低了成本。

CN114480199A一种通用型分离细菌的磁性纳米材料制备方法，以期为后续更好地进行目的菌的高灵敏检测提供基础，涉及材料化学领域和生物技术领域。该方法包括磁性纳米粒子与聚乙二醇的偶联、氨苄青霉素偶联聚乙二醇偶连的磁性纳米粒子、氨苄青霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物对样品液中细菌的识别捕获以及细菌-氨苄青霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物的富集分离等步骤。通过磁分离捕获到的目的菌可以直接进行后续分析，与传统的细菌磁分离方法相比，该方法可以对食品基质中的大部分细菌进行磁分离，不仅提高了样品中细菌分离效率，同时也降低了成本。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种可用于捕获细菌的探针材料制备方法及其在冷却肉中细菌磁分离前处理中的应用，该前处理方法具有选择性强、捕获率高、分离富集时间短等特点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于捕获细菌的探针材料的制备方法，包括如下步骤：

将Fe

进一步，Fe

进一步，在含0.2g Fe

进一步，所述Fe

进一步，在220-260mL乙二醇中加入8-10g六水氯化铁、14-15g无水乙酸钠和3-4g二水合柠檬酸钠。该方法制备获得的Fe

进一步，壳聚糖溶液的浓度为1-2mg/mL，所述壳聚糖溶液是将壳聚糖溶解于体积分数为1％的乙酸溶液中配置而成；以0.8mg Fe

本发明还提供利用所述的制备方法制得的用于捕获细菌的探针材料在冷却肉中细菌磁分离前处理中的应用，包括以下步骤

a)将冷却猪肉样品中加入一定量的无菌生理盐水，拍打均质后取其均质液，通过差速离心去除均质液中的肌浆蛋白和肌原纤维蛋白等食品基质得到处理后的样品；

b)将步骤a)处理后的样品与捕获探针Fe

进一步，步骤a)中，差速离心条件为：首先在500-2000rpm的条件下离心1-5min，然后在6000-10000rpm的条件下离心1-3min。

进一步，步骤b)中，样品体积为1

进一步，步骤b)中，所述细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、液化沙雷氏菌、密歇根克雷伯菌或嗜根考克氏菌。

本发明先合成了捕获探针Fe

与现有的传统前处理方法相比，本发明具有如下有益效果：

1)所用材料与试剂稳定、简单且操作方便快捷；

2)本发明利用壳聚糖对细菌的捕获性及Fe

3)本发明分离富集时间短、捕获率高，前处理时间在40min内，对纯培养细菌和加标冷却猪肉中细菌的捕获率都在70％以上。

附图说明

图1为本发明制备的Fe

图2为本发明制备的Fe

图3为本发明制备的Fe

图4为壳聚糖，本发明制备的Fe

图5为本发明中捕获探针对不同浓度纯培养的革兰氏阴性菌(大肠杆菌)(a)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)(b)的捕获率图；

图6为本发明中分离含不同细菌的冷却猪肉样品中的细菌时，经过差速离心前后的捕获率图。

图7为本发明的原理，包括(a)探针材料制备过程和(b)对冷却肉中细菌的磁分离前处理过程。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例1

一种可用于细菌捕获的探针材料的制备方法，具体包括如下步骤：

1)将9.73g六水三氯化铁和14.40g无水乙酸钠和3.53g柠檬酸钠分别溶解在80mL乙二醇中，磁力搅拌15min。然后，将三种溶液混合在一起并超声处理30min，将所得溶液转移到300mL内衬特氟隆的反应釜中，并在200℃下加热12h。冷却至室温后，黑色Fe

2)取0.2g上述步骤1)制备所得Fe

3)取0.8mg上述步骤2)中制备所得Fe

图1为实施例1制备的Fe

图2为实施例1制备的Fe

图3为实施例1制备的Fe

图4为壳聚糖、本发明制备的Fe

实施例2

利用实施例1制得的Fe

(1)将处于对数生长期的大肠杆菌(ATCC 43895)和金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)在无菌操作下梯度稀释为10

(2)将经过拍打均质的冷却猪肉样品均质液(冷却猪肉样品的处理参考GB4789.2-2022)，分别用不同的细菌人工污染，(具体操作为：取过夜培养的细菌8000rpm离心5分钟后弃上清，将细菌重悬于PBS缓冲液并测OD值以确定其浓度，将细菌加入样品均质液中，使均质液中细菌终浓度为10

结果分析：通过计算捕获率可知本发明的方法对不同浓度纯培养的细菌捕获率均可达到80％以上，且经过差速离心的冷却猪肉样品中细菌的捕获率也达到了70％以上，分离结果的相对标准偏差不超过6％，说明本发明前处理方法具有良好的重复性和可信度。与本方法相比，传统的前处理法耗时长，需要1-2天，且操作较为繁琐。

图5为本发明中不同浓度纯培养的大肠杆菌(a)和金黄色葡萄球菌(b)的捕获率，对于革兰氏阳性菌和阴性菌不同浓度的捕获率都在80％以上。

图6为本发明中含不同细菌的冷却猪肉样品的前处理结果。冷却猪肉样品的处理参考GB 4789.2-2022，具体为：猪肉样品(25g)首先用75％乙醇消毒，然后与225mL无菌生理盐水混合，用拍打均质机在12下/分钟条件下均质2分钟。然后，将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、液化沙雷氏菌、密歇根克雷伯菌或嗜根考克氏菌分别加入至1mL均质后的上清液中使均质液中细菌终浓度为10

图7为本发明的原理，包括(a)探针材料制备过程和(b)对冷却肉中细菌的磁分离前处理过程。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。