一种检测水稻红色颖壳基因OsRH3的功能标记及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，尤其涉及一种检测水稻红色颖壳基因OsRH3的功能标记及其应用。

背景技术

水稻是世界上主要的粮食作物之一，对于我国乃至世界的粮食安全具有举足轻重的作用。颖壳是水稻的重要花器官结构，主要由内、外稃组成。目前最常见颖壳颜色为黄色，而黑色、红色、褐色等较为少见，研究表明这主要是由于类黄酮的积累不同导致的。类黄酮化合物是植物花、果实、种子等器官色素的重要组成成分，且在植物抗逆、抗氧化、清除自由基、抵御病虫害等方面发挥着重要作用；不仅影响植物果实的农艺品质，而且对于人类的健康有关键作用。

近年来，随着测序技术、分子生物学的不断发展，促进了水稻颖壳颜色基因的克隆及其分子机理的解析。水稻基因LOC_Os03g60509编码查尔酮异构酶，Cheng等利用gh1突变系与粳稻春江06杂交构建F

现有技术中未见根据水稻颖壳颜色基因变异开发功能标记的报道。因此，提供一种检测水稻红色颖壳基因OsRH3的功能标记及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

红色颖壳基因OsRH3为新的等位基因，本发明提供了基于启动子7.3kb的插入变异开发的水稻红色颖壳基因OsRH3的功能标记及其应用，利用该功能标记能准确快速鉴定水稻OsRH3基因的非功能型(正常色颖壳)、功能型(红色颖壳)及杂合基因型。

一种检测水稻红色颖壳基因OsRH3的功能标记，所述功能标记OsRH3-P12位于所述水稻红色颖壳基因OsRH3编码区上游及插入序列上，其物理位置为水稻第3染色体34,395,063-34,395,731(参照水稻品种日本晴的基因组)，所述功能标记包含的引物组合为：

正向引物1，序列如SEQ ID NO.1所示；

正向引物2，序列如SEQ ID NO.2所示；

反向通用引物3，序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步的，所述水稻红色颖壳基因OsRH3来源于水稻品种川7，所述OsRH3基因组序列如SEQ ID NO.5所示；

所述插入序列为水稻红色颖壳基因OsRH3编码区起始密码子ATG上游-12bp处插入7.3kb的DNA序列，所述插入序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步的，根据所述功能标记检测结果，可快速区分水稻红色颖壳基因OsRH3的功能型、非功能型及杂合型。

一种检测水稻红色颖壳基因OsRH3的方法包括以下步骤：

(1)提取待测水稻植株的基因组DNA；

(2)使用权利要求1所述的引物组合对所述水稻基因组DNA进行PCR扩增反应，得到功能标记扩增产物；

(3)对步骤(2)制备的功能标记扩增产物进行电泳检测；

(4)对步骤(3)所获得的电泳凝胶进行显色和基因分型，若扩增产物大小为669bp，则水稻品种携带OsRH3的非功能基因(正常色颖壳)；

若扩增产物大小为975bp，则水稻品种携带OsRH3功能基因(红色颖壳)；

若扩增产物包含669bp和975bp条带，则为杂合基因型。

进一步的，步骤(2)所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。

一种检测水稻红色颖壳基因OsRH3的功能标记在水稻红色颖壳基因OsRH3等位基因类型鉴别、红色颖壳水稻品种选育中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明研究发现水稻品种川7的OsRH3基因ATG上游-12bp处插入7.3kb的DNA序列，导致基因完全不表达，类黄酮大量积累，引起颖壳颜色发生变化，产生红色颖壳性状。OsRH3为一个新的等位基因，基于其7.3kb的插入变异，本发明开发一组功能标记引物，通过该引物组合可以区分水稻OsRH3基因的非功能型(正常色颖壳)、功能型(红色颖壳)及杂合基因型，也可在抽穗前快速、准确地鉴定水稻是否含功能型的OsRH3基因。

本发明提供的功能标记基于基因本身启动子序列差异所开发，能准确通过基因型反映表型，特别是在回交的过程中筛选携带OsRH3功能基因而表现出正常颜色的杂合型单株。本方法仅需要在PCR后进行凝胶电泳，就能准确快速鉴定水稻OsRH3基因是否有功能，且具有操作简便、高效和低成本的特点。因此，本发明所提供的红色颖壳基因功能标记OsRH3-P12具有重要的应用价值，利用此标记可以提高OsRH3功能基因在种质资源筛选、分子标记辅助选择育种的效率，加速选育进程，同时可以利用颖壳颜色差异对亲本混播混收，实现全程机械化制种。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的OsRH3基因的精细定位；

图2为本发明实施例1提供的功能标记OsRH3-P12的准确性验证结果。泳道M为250bp DNA Ladder(15000bp、8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道1、2分别为爽1S和川7；

图3为本发明实施例2提供的红色颖壳OsRH3基因的标记开发。泳道M为DL2000 DNAMarker(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道1～18的样品依次为爽1S、川7(红色颖壳)、粤农丝苗、先恢K01(红色颖壳)、湘陵628S、鹅湖香稻、S373、S305、华占、泰丰A、泰丰B、竹香占、赣宁粳2号、湘早籼6号、湘早籼45号、宁粳8号、长粒早稻、化感2205；

图4为本发明实施例3提供的功能标记OsRH3-P12对育种群体OsRH3基因型的鉴定结果。泳道M为DL2000 DNA Marker，1、2分别为爽1S和川7(红色颖壳)，3～39为爽1S/////爽1S////爽1S///爽1S//爽1S/川7群体的部分单株。若PCR扩增产物大小为669bp，则水稻品种携带非功能基因OsRH3，为正常色颖壳单株；PCR扩增产物大小为975bp，表明含插入DNA序列，携带功能基因OsRH3，为红色颖壳单株；扩增产物包含669bp和975bp条带，则为杂合基因型。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1红色颖壳基因OsRH3的精细定位及候选基因确定。

利用红色颖壳水稻材料川7和先恢K01，构建了爽1S/川7、粤农丝苗/先恢K01的F

根据启动子插入片段两侧的序列，开发了正向引物1和反向通用引物3，对插入序列进行验证。所述引物如下：

正向引物1序列：5’-TAGCCACCCAGCTAACACCATCTCG-3’，如SEQ ID NO.1所示；

反向通用引物3序列：5’-CGACGCAGTTCTCCGTCACCTTG-3’，如SEQ ID NO.3所示。

正常色颖壳单株不含插入序列，扩增产物大小为669bp；若为红色颖壳单株，包含插入序列，扩增产物大小为8000bp左右。

利用正向引物1和反向通用引物3对亲本爽1S、川7进行扩增。

PCR反应体系为：DNA(50～200ng/μL)1.0μL，正向、反向引物(10μmol/L)各1μL，2×Vazyme Lamp DNA MasterMix预混液12.5μL(诺唯赞公司)，补ddH

PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火/延伸8min，30个循环；68℃延伸7min。

利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物送至擎科生物公司进行测序。结果表明，正常色颖壳水稻爽1S的扩增大小为669bp，红色颖壳水稻川7的扩增大小为8000bp左右，说明其有7.3kb的插入变异(图2)。

进一步通过PCR扩增和测序比对，发现与爽1S、粤农丝苗相比，川7、先恢K01的OsRH3启动子插入7.3kb的DNA序列，导致基因OsRH3完全不表达，表现为红色颖壳。。

水稻红色颖壳基因与正常色颖壳OsRH3基因型相比，其启动子存在长片段DNA插入，该插入位于OsRH3基因ATG上游-12bp处，插入序列为7.3kb的长片段。

OsRH3基因CDS序列，如SEQ ID NO.4所示；

OsRH3基因组DNA，如SEQ ID NO.5所示；

插入片段DNA序列，如SEQ ID NO.6所示。

实施例2基于红色颖壳基因OsRH3启动子插入变异开发功能标记OsRH3-P12及其准确性验证。

根据红色颖壳基因OsRH3起始密码子ATG上游-12bp处插入7.3kb的DNA序列开发了功能标记OsRH3-P12，功能标记包含3条引物组合，正向引物1位于启动子插入位点上游，正向引物2位于插入序列上，反向通用引物位于OsRH3基因本身编码区。

正向引物1序列(SEQ ID NO.1)如下：

5’-TAGCCACCCAGCTAACACCATCTCG-3’；

正向引物2序列(SEQ ID NO.2)如下：

5’-AACTCGACACAACCCCTACCTGGC-3’；

反向通用引物3序列(SEQ ID NO.3)如下：

5’-CGACGCAGTTCTCCGTCACCTTG-3’；

通过CTAB法提取所述待测水稻植株基因组DNA；

利用功能标记对所述水稻基因组DNA进行PCR扩增反应和电泳检测。

PCR反应体系为：DNA(50～200ng/μL)1.0μL，引物(10μmol/L)混合液(2条正向引物加1条反向引物)1.5μL，2×RapidTaqMasterMix(诺唯赞公司)预混液5μL，补dd H

所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。

所述电泳检测如下：取3μL PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，130V，30min。

若扩增产物大小为669bp，则水稻品种携带OsRH3的非功能基因(正常色颖壳)；若扩增产物大小为975bp，则水稻品种携带OsRH3功能基因(红色颖壳)；若扩增产物包含669bp和975bp条带，则为杂合基因型。

选择18份水稻材料，依次为：爽1S、川7(红色颖壳)、粤农丝苗、先恢K01(红色颖壳)、湘陵628S、鹅湖香稻、S373、S305、华占、泰丰A、泰丰B、竹香占、赣宁粳2号、湘早籼6号、湘早籼45号、宁粳8号、长粒早稻、化感2205。

分别提取上述水稻品种的基因组DNA，并以此为模板利用开发的功能标记进行PCR扩增和电泳检测。根据条带大小情况，可以将基因座OsRH3的功能基因型与非功能基因型区分。如图3所示，18份水稻材料中，包含2份红色颖壳材料(泳道2：川7，泳道4：先恢K01)的PCR扩增产物大小为975bp，表明该位点为功能基因型；16份正常色颖壳材料(泳道1，3，5～18)扩增产物大小为669bp，表明该位点为非功能基因OsRH3。说明本发明开发的功能标记可以准确有效区分待检测水稻品种的OsRH3基因是否含有7.3kb的插入序列，具有很强的特异性。

实施例3功能标记OsRH3-P12在培育红色颖壳水稻中的应用。

为了利用功能标记OsRH3-P12辅助选择培育红色颖壳水稻新品种，本实施例以携带红色颖壳基因的川7为供体，分别与不育系爽1S、318S、628S和316S杂交构建了4个回交群体，分别包含106、47、34、41个单株，总计228个单株。

利用功能标记对育种群体爽1S/////爽1S////爽1S///爽1S//爽1S/川7的37个单株进行检测。结果如图4所示：功能标记OsRH3-P12能有效地将川7(含插入序列，红色颖壳)、爽1S(不含插入序列，正常色颖壳)以及杂合型(正常色颖壳)区分开。检测的37个单株中18个为杂合单株、19个为正常色颖壳单株，杂合单株数与正常色颖壳单株数之比接近1：1，与回交群体的预期分离比一致。目前，基于OsRH3基因已育成2个红色颖壳不育系，后期将其应用于父母本混播混收全程机械化制种。上述结果表明，本发明开发的功能标记OsRH3-P12可以对OsRH3基因ATG上游-12bp处的7.3kb插入变异的不同基因型进行快速准确鉴定，有利于红色颖壳水稻的选育以及父母本混播混收全程机械化制种。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。