用于减少内皮素-1分泌、干细胞因子合成和蛋白质羰基化的白松树皮提取物

背景技术

根据定义，黑素生成是由称为黑素细胞的细胞产生黑色素色素。皮肤中的黑素细胞被角质形成细胞包围(一个黑素细胞被大约36个角质形成细胞包围)，它们将其黑色素色素转移至角质形成细胞。黑素细胞和角质形成细胞在外部刺激(例如，紫外线辐射(UVR)和药物)或内在刺激(例如，角质形成细胞和成纤维细胞、内分泌、炎症细胞和神经元细胞)下广泛地彼此相互作用。响应于UVR，角质形成细胞产生多种因子，对黑素细胞具有旁分泌作用。更具体地，角质形成细胞衍生的细胞因子(包括碱性成纤维细胞生长因子、内皮素-1、α-促黑素细胞激素(α-MSH)、干细胞因子(SCF)和一氧化氮)已经显示出在UVB照射后其产生和分泌/释放上调，并且可以充当刺激人黑素细胞的增殖和黑素生成的促细胞分裂剂和/或黑素原。

已经提出了与北美乔松(Pinus strobus)提取物有关的紫外线防护和皮肤增白活性(KR 100860604和US 2010/0129304)。然而，这些文献并未启示对角质形成细胞具有任何作用。

发明内容

本发明提供了一种通过使角质形成细胞与有效量的北美乔松树皮的水性提取物接触来减少角质形成细胞中的内皮素-1分泌、干细胞因子合成和/或蛋白质羰基化的方法。在一些实施方案中，内皮素-1分泌减少了至少30％；干细胞因子合成减少了至少50％；蛋白质羰基化减少了至少10％。在某些实施方案中，北美乔松树皮的水性提取物包含4％的黄酮类化合物、15％的多酚类化合物、0.1％的反式白藜芦醇和0.1％的儿茶素。在其他实施方案中，北美乔松树皮的水性提取物为乳膏、软膏、泡沫、洗剂、膏药(plaster)、凝胶、溶液或乳剂的形式。

附图简述

图1显示了北美乔松树皮提取物调节α-MSH刺激后的鼠黑素细胞中的黑色素合成。

图2显示了北美乔松树皮提取物抑制人角质形成细胞中的内皮素-1合成。未经(松树皮提取物)处理的角质形成细胞的细胞培养物用作对照。***p<0.001。

图3显示了北美乔松树皮提取物抑制人角质形成细胞中的干细胞因子(SCF)合成。未经(松树皮提取物)处理的角质形成细胞的细胞培养物用作对照。***p<0.001。

图4显示了北美乔松树皮提取物抑制人角质形成细胞中的蛋白质羰基化。20μM的HNE(4-羟基壬烯醛)用作蛋白质羰基化的参考激活剂。DNPH(2,4-二硝基苯肼)用作羰基化的检测剂(对于0.5μg/μL的蛋白质为1μL)。*，p<0.05；**，p<0.01。

图5是使用重建人表皮(RHE)来证明北美乔松树皮提取物抑制黑色素合成的离体方案设计的示意图。

图6显示了在人皮肤的离体模型中，北美乔松树皮提取物抑制皮肤色素沉着。经安慰剂配方(不含松树皮提取物的配方)处理的离体培养物用作对照。**p<0.01，***p<0.001。

发明详述

现已发现，北美乔松树皮的水性提取物调节人黑素细胞的增殖和黑素生成所涉及的角质形成细胞衍生的细胞因子。特别地，北美乔松树皮提取物减少了角质形成细胞中的内皮素-1分泌、干细胞因子合成和/或蛋白质羰基化。因此，本发明提供了一种通过使角质形成细胞与有效量的北美乔松树皮的水性提取物接触来减少角质形成细胞中的内皮素-1分泌、干细胞因子合成或蛋白质羰基化的方法。鉴于这些活性，北美乔松树皮提取物可用于维持皮肤稳态以及通过改善美白、暗度和发红来调节肤色以提供更光彩的皮肤。

如本文中使用的，术语“北美乔松树皮的水性提取物”和“北美乔松树皮提取物”可互换地使用，并且是指已经用水从北美乔松的树皮中提取的材料。本发明的北美乔松树皮提取物可以通过将北美乔松(通常称为白松)的干燥树皮研磨至小于0.5mm的粒度并且将研磨后的材料进行热水提取而获得。可以以1份植物材料与5-20份水的w/w比率(或更优选地以1:16的比率)用水提取研磨后的树皮。最初，添加至研磨后的树皮中的水的温度高于70℃、75℃或80℃，并且优选处于85℃。实际上，低于70℃并且高于90℃的温度已显示出对于从桑树中提取槲皮素和山柰酚产生不利影响(Tchabo等人(2018)Intern.J.FoodProper.21(1):717-732)。此外，从辐射松(Pinus radiata)树皮中水提取原花色素已显示出显著依赖于温度，其中在80℃时达到最大值(Ku等人(2011)Forest Prod.J.61(4):321-5)。

理想地，在搅拌并且不补充热量的情况下，将北美乔松的提取进行约0.5至5小时，优选约1小时。一旦将颗粒状树皮材料移除(例如，通过过滤和/或离心)，就将水性提取物干燥。作为干燥方法，可以提及喷雾干燥、冷冻干燥等(不限于此)。尽管提取物可以以其干燥形式使用并且直接掺入化妆品制剂中，但是理想地，将提取物溶于水和甘油的混合物中(例如，60-90％甘油溶液，或更优选地70-80％甘油溶液)。特别地，将2.5％的提取物(固体含量)溶解在20％的水和77.5％的甘油中。

北美乔松树皮提取物的活性可以使用角膜细胞细胞培养物或重建人表皮来评价，如本文中例示的。角膜细胞细胞系和重建人表皮是本领域中众所周知的，并且可从商业来源获得。例如，重建人色素表皮(RHPE，皮肤类型IV)可以从SkinEthic(Lyon，法国)获得。这种RHPE的特征是置于允许气液界面的0.4μM TRANSWELL室中的包皮的3-D角质形成细胞和黑素细胞培养物。

根据本发明，基于提取物的固体含量，展现出减少角质形成细胞中的内皮素-1分泌、干细胞因子合成和/或蛋白质羰基化的所需活性的北美乔松树皮提取物包含约4％(且不超过8％)的黄酮类化合物、15％(且不超过30％)的多酚类化合物、0.1％的反式白藜芦醇和0.1％的儿茶素。北美乔松树皮提取物的化学组成可以如本文所述或使用任何其他常规方法来确定。例如，总黄酮含量可以使用分光光度法，使用儿茶素作为参考化合物，基于黄酮-氯化铝(AlCl

如本文所述，本发明提供了一种减少角质形成细胞中的内皮素-1分泌、干细胞因子合成和/或蛋白质羰基化的方法。所述方法包括使角质形成细胞与北美乔松树皮的水性提取物或任选地含有其的制剂接触。理想地，将提取物局部施用于皮肤，以对角质形成细胞产生所需作用。根据本发明的方法，提供有效量的北美乔松树皮提取物以产生可测量的角质形成细胞的内皮素-1分泌、干细胞因子合成和/或蛋白质羰基化的减少。在特别的实施方案中，内皮素-1分泌减少了至少30％、40％、50％或60％。在其他实施方案中，干细胞因子合成减少了至少50％或60％。在另外的实施方案中，蛋白质羰基化减少了至少10％或15％。

除了本文实施例中公开的方法以外，任何常规方法均可以用于评估北美乔松树皮提取物对角质形成细胞的作用。例如，角质形成细胞分泌的内皮素-1的浓度可以使用放射免疫测定法(Ando等人(1989)FEBS Lett.245:164-6)或酶联免疫测定(ELISA；Kurita等人(2011)Biochem.Biophys.Res.Comm.409(1):103-7)来测量。干细胞因子合成可以通过蛋白质印迹分析或ELISA(Grabbe等人(1996)J.Invest.Dermatol.107:219-224)来测量。蛋白质羰基化分析可以通过以下方式进行：将羰基衍生化(最常见的是使用二硝基苯酚肼)并且通过免疫测定法对二硝基苯酚腙(DNP)加合物进行定量(Alamdari等人(2005)FreeRad.Biol.Med.39(10):1362-7；Buss&Winterbourn(2002)Meth.Mol.Biol.186:123-8)。质谱分光光度法也可以用于通过非标记技术或使用同位素标记的衍生化试剂的羰基化肽的鉴定和相对定量。

为了促进北美乔松树皮提取物向皮肤的施用，本发明还提供了包含北美乔松树皮提取物的制备物或制剂。这样的组合物可以以各种形式制备，并且期望地以促进局部施用于皮肤的形式制备。因此，合适的制备物形式包括乳膏、软膏、泡沫、洗剂、膏药、凝胶、溶液和乳剂。这样的组合物的局部施用频率可以取决于多个因素，包括所需的抑制内皮素-1分泌、干细胞因子合成和/或蛋白质羰基化的水平。本发明的组合物可以适宜地每天两次地施用于皮肤，并且特别适宜地早上施用一次并且晚上施用一次。

制剂中存在的北美乔松树皮提取物的量将取决于多个因素，包括所需的活性水平、用于特定提取物的特定制备物的容量以及其他因素。当作为流体使用(例如，溶于甘油溶液中)时，北美乔松树皮提取物占总组合物的约0.01％至约50％(wt/wt)。更适宜地，北美乔松树皮提取物占总组合物的约0.10％至约25％(wt/wt)。仍更适宜地，北美乔松树皮提取物占总组合物的约0.25％至10％(wt/wt)。当作为固体使用时，北美乔松树皮提取物占总组合物的约0.001％至10％(wt/wt)。更适宜地，北美乔松树皮提取物占总组合物的约0.002％至1％(wt/wt)。仍更适宜地，北美乔松树皮提取物占总组合物的约0.005％至0.5％(wt/wt)。

本发明的制剂特别良好地适合于局部施用和用于人类皮肤。因此，本发明还包括根据本发明的制剂的化妆品用途。具体地，本发明包括含有通过热水(即70至85℃)提取北美乔松树皮获得的北美乔松树皮提取物的组合物的化妆品用途。

含有北美乔松树皮提取物的制剂可以是粘性或半粘性流体，或者是粘性较小的流体，诸如可以用于喷雾剂或气雾剂的流体。它可以采取溶液、混悬液或乳剂的形式。它可以采取固体形式，诸如粉末或颗粒，其可以设计成在使用前添加到液体(例如水)中。在一些实施方案中，将制剂施用于载体，或者可以将制剂施用于载体，诸如海绵、棉签、刷子、垫、纸巾、布、擦拭巾、皮肤贴剂或敷料(其包括绷带、膏药、皮肤粘合剂或设计用于施用至组织表面的其他材料)，以促进其给药。

根据本发明的制剂可以含有赋形剂和已知用于局部制剂的其他添加剂。设计用于局部或区域施用的制剂中适用的赋形剂将是本领域技术人员众所周知的。包括的那些将取决于制剂预期施用模式和施用部位。在局部施用于皮肤的制剂的情况下，例如可以在威廉姆斯的“透皮和局部药物递送”(Transdermal and Topical Drug Delivery)(Pharmaceutical Press,2003)和其他类似的参考书中找到实例。还参见例如Date等人((2006)Skin Pharmacol.Physiol.19(1):2-16)，综述了局部递送策略，以及SkinDelivery Systems((2006)John J Wille,Ed,Blackwell出版社。

当制剂旨在用于局部施用于皮肤时，合适的添加剂的实例包括润肤剂、保湿剂、香料、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、胶凝剂和表面活性剂；其他添加剂可以在威廉姆斯的“透皮和局部药物递送”(Transdermal and Topical Drug Delivery)(参见上文)中找到。组合物中使用的任何其他添加剂都不得是刺激性的，并且不应不利地影响所需的减少角质形成细胞中的内皮素-1分泌、干细胞因子合成和/或蛋白质羰基化的活性。

北美乔松树皮提取物可以单独使用，或者可以与一种或多种另外的活性成分组合使用，所述另外的活性成分诸如抗微生物剂、抗炎剂、抗痤疮剂、角质层分离剂、粉刺溶解剂、能够使角质形成细胞和/或皮脂腺细胞功能正常化的试剂、消炎剂、抗增殖剂、抗雄激素药、抑制皮脂剂/皮脂抑制剂、止痒剂、免疫调节剂、抗刺激剂、促进伤口愈合的试剂、防晒剂、皮肤美白剂、抗衰老物质及其混合物。

可以将用于本发明的方法的制剂掺入并且因此以以下形式施用：化妆品；皮肤护理制剂(例如皮肤清洁剂、爽肤水或保湿剂)；清洁制剂(例如洗面奶或磨砂膏)；药妆制剂；盥洗用品(例如沐浴或淋浴添加剂或肥皂)。制剂可以是或者掺入至冲洗型(wash-off)皮肤处理产品(诸如皮肤清洁剂)，或者特别是免洗型(leave-on)皮肤产品。

通过以下非限制性实施例更详细地描述本发明。

实施例1：北美乔松树皮提取物的提取和化学组成

提取过程。仅使用来自加拿大林业的残留北美乔松树皮来制备提取物。收集树皮，然后干燥至水分含量小于10％。一旦干燥，将它们在第一锤磨机中碾磨至2mm，然后再次碾磨并且筛分至0.5mm。然后按照规定的一组参数，通过在热水中浸渍，提取均匀的树皮材料。更具体地，首先将植物材料与水以1:16的重量比混合。使混合物达到85℃，移除热量，并且将混合物在搅拌下在该温度下放置一小时。提取完成后，经由连续离心分离器进行固体和液体的第一次分离，随后使用压滤机移除细屑。将所得澄清提取物在真空和低热下浓缩，随后进行瞬时巴氏灭菌。将浓缩的提取物置于真空和低热下数小时，以使水完全蒸发，得到干粉。随后将粉末(认为其是纯提取物)在强烈搅拌和适度加热下在数小时内溶于水和甘油的混合物中。该混合物用于随后的分析和最终产品制备。

化学组成。在其制备期间和之后监测北美乔松提取物的化学性质，以评估其质量和可用性。化学性质包括多酚类化合物、黄酮类化合物、儿茶素和反式白藜芦醇的量。这些性质用于确保批次之间的可重复性，并且提供产品的总体可量化质量。如本领域中常规的，总黄酮含量的浓度由校准曲线(5-200μg/mL槲皮素)计算并且表示为槲皮素当量。同样地，基于没食子酸的标准曲线(5-500mg/L)，以没食子酸当量计算酚含量。参见例如Chandra等人(2014)Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,vol.2014,文章编号253875)。北美乔松提取物的化学组成分析表明，提取物含有4％的黄酮类化合物(槲皮素当量)、15％的多酚类化合物(没食子酸当量)、0.1％的反式白藜芦醇和0.1％的儿茶素。

实施例2：北美乔松树皮提取物对黑色素合成的作用

皮肤色素沉着是黑素细胞通过黑素生成进行黑色素合成的结果。一旦合成，黑色素通过角质形成细胞转移到称为黑素体的囊泡中。然后，表皮更新将黑色素色素带到表面，并且出现皮肤色素沉着。为了研究北美乔松树皮提取物对皮肤色素沉着的生理活性，使用B16-F1细胞培养物来评估提取物减少黑色素生成的能力。

将B16-F1细胞(鼠黑素细胞细胞系)在37℃在5％CO

实施例3：北美乔松树皮提取物对内皮素-1合成的作用

黑素生成由内皮细胞分泌的旁分泌因子诱导。内皮素-1(一种由角质形成细胞合成的蛋白质)与黑素细胞膜上的特定内皮素B(ET

正常人表皮角质形成细胞(NHEK)在37℃、5％CO

结果表示为内皮素-1分泌的百分比(图2)，并且表明北美乔松树皮提取物展现出剂量依赖性的内皮素-1合成抑制。

实施例4：北美乔松树皮提取物对干细胞因子合成的作用

与内皮素类似，干细胞因子(SCF)由旁分泌因子诱导并且由角质形成细胞分泌。SCF与黑素细胞膜上的c-Kit受体结合并且诱导黑色素生成(dos Santos Videira等人(2013)An.Bras.Dermatologie 88(1):76-83)。因此，评估了北美乔松树皮提取物对人角质形成细胞的SCF合成的作用。

NHEK细胞在37℃、5％CO

该分析表明，在0.05g/L下，北美乔松树皮提取物抑制SCF合成达56％(图3)。

实施例4：北美乔松树皮提取物对蛋白质羰基化的作用

蛋白质羰基化是真皮细胞氧化应激的生物标记。在暴露于外部应力的角质层(SC)中检测到，蛋白质羰基化不仅诱导了持水量的变化，而且还诱导了SC的光学性质的变化，这影响了皮肤透明度(Iwai等人(2008)Int.J.Cosmet.Sci.30(1):41–46)。此外，光致老化的真皮皮肤的分析显示出淡黄色和羰基修饰之间的相关性(Ogura等人(2011)J.Dermatol.Sci.64(1):45-52)。值得注意的是，在总体水平上，可以使用以下方式在蛋白质和蛋白质混合物中检测和定量羰基化：使用2,4-二硝基苯肼(DNPH)将羰基衍生化，随后进行分光光度法测量或使用DNPH特异性抗体在凝胶或ELISA测定中进行免疫检测(Rogowka-Wrzesinska等人(2014)Free Rad.Res.48(10):1145-62)。因此，使用DNPH评估了北美乔松树皮提取物对人角质形成细胞中的蛋白质羰基化的作用。

NHEK细胞在37℃、5％CO

该分析表明，北美乔松树皮提取物显著抑制蛋白质羰基化达至少11％(图4)。鉴于这些结果，北美乔松树皮提取物可用于改善皮肤肤色。

实施例5：离体(Ex vivo)皮肤模型中的黑色素合成评价

角质形成细胞分泌的旁分泌因子已显示出激活黑素细胞上的特定黑素生成受体，从而调节黑色素生成。为了证明北美乔松树皮提取物抑制黑色素合成，在着色重建表皮上分析制剂中提取物的作用。

通过将人黑素细胞和角质形成细胞以4x10

制剂包括Heliogel

表1

通过Fontana-Masson染色评价色素沉着。还通过光学显微镜检查了RHE切片。由于高度浓缩的黑色素区域产生高强度的暗信号，因此亮度的增加显示出黑色素含量的减少。

该分析表明，用北美乔松树皮提取物对着色RHE进行局部处理导致黑色素合成显著减少(11.2％)，其超过两倍剂量的曲酸所提供的减少(8.1％)(图6)。当用北美乔松树皮提取物处理未着色RHE时，用未着色RHE的上清液处理着色RHE也导致黑色素合成显著减少(7.2％)。这表明北美乔松树皮提取物直接作用于角质形成细胞并且调节黑素生成所需的调节分子的分泌。