具有聚丙氨酸C结构域子区段的单链胰岛素类似物

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号DK040949和DK074176下由政府支持完成。政府对本发明享有一定的权利。

背景技术

本发明涉及多肽激素类似物，相对于相应野生型人激素的可溶性制剂，其显示出增强的药学性质，例如增加的热力学稳定性、对高于室温的热纤维化(fibrillation)的抗性增加、减少的促有丝分裂性和/或改变的药代动力学和药效学性质，即赋予更长的作用持续时间或更快速的作用持续时间。更具体地，本发明涉及由单条多肽链组成的胰岛素类似物，所述单条多肽链含有在A结构域和B结构域之间的一类新型缩短的连接(C)结构域。在长度4-11个残基中，这类C结构域由N末端酸性元件和含有至少一个碱性氨基酸残基的C末端区段组成。本发明的单链胰岛素类似物可以任选地含有在A结构域或B结构域中的其它位点处的标准或非标准氨基酸取代。

非标准蛋白质包括治疗剂和疫苗的改造，可能具有广泛的医学和社会益处。天然存在的蛋白质—如在人类、其它哺乳动物、脊椎动物生物体、无脊椎动物生物体或一般而言的真核细胞的基因组中编码的—经常赋予多重生物活性。非标准蛋白质的益处是达到在室温或高于室温下对降解的抗性加强，促进运输、分配和使用。治疗性蛋白质的实例由胰岛素提供。野生型人胰岛素和其它哺乳动物的基因组中编码的胰岛素分子与多重器官和不同类型的细胞中的胰岛素受体结合，而不管由RNA剪接的替代模式或翻译后糖基化的替代模式生成的受体同种型。野生型胰岛素也以较低的亲和力与同源的1型胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)结合。

进一步的医学益处的实例是蛋白质针对解折叠或降解的稳定性优化。这种社会益处通过蛋白质的改造得到增强，所述蛋白质关于在室温或高于室温下的降解比标准蛋白质更具抵抗性，特别是用于其中电力和冷藏无法持续获得的发展中国家的地区中。由单条多肽链组成并任选地含有非标准氨基酸取代的胰岛素类似物可能显示出关于对热降解的抗性或减少的促有丝分裂性的优异性质。由其物理降解所造成的挑战通过糖尿病在非洲和亚洲发展的地方性流行得到加深。由于纤维化造成高于室温的主要降解途径，因此抗纤维化制剂的设计可能增强胰岛素替代疗法在此类挑战地区的安全性和功效。

胰岛素的施用早已被确立为用于糖尿病的治疗。糖尿病患者中的常规胰岛素替代疗法的主要目标是血糖浓度的严格控制，以防止其高于或低于健康人受试者特征性的正常范围的偏移。低于正常范围的偏移与直接的肾上腺素能或神经低血糖症(neuroglycopenic)症状相关，所述症状在严重发作下导致抽搐、昏迷和死亡。高于正常范围的偏移与微血管疾病的长期风险增加相关，所述微血管疾病包括视网膜病变、失明和肾衰竭。

胰岛素是小球状蛋白质，其在脊椎动物的新陈代谢中起关键作用。胰岛素含有两条链：含有21个残基的A链以及含有30个残基的B链。该激素作为Zn

纤维化(在用于治疗糖尿病的胰岛素和胰岛素类似物的制造、贮存和使用中的重大关注)随着更高的温度，更低的pH，搅动，或者尿素、胍、乙醇共溶剂的存在或疏水表面而增强。当前的美国药物法规要求，如果纤维化在1%或更多的水平下发生，则胰岛素被丢弃。由于纤维化在更高的温度下增强，因此糖尿病患者最好应该将胰岛素在使用前保持冷藏。对于利用外部胰岛素泵的此类患者，胰岛素或胰岛素类似物的纤维化可能是特别的关注，在所述外部胰岛素泵中，以规律的间隔将少量的胰岛素或胰岛素类似物注射到患者的体内。在这种使用中，胰岛素或胰岛素类似物在泵仪器内并不保持冷藏，并且胰岛素的纤维化可以导致用于将胰岛素或胰岛素类似物注射到体内的导管堵塞，潜在地导致不可预测的血糖水平波动或甚至危险的高血糖症。在高于25°C的温度下，对于每10°C增量，胰岛素显示出10倍或更多的降解率增加；相应地，指南要求在< 30°C的温度下贮存，且优选使用冷藏。配制为pH小于5的可溶性溶液的基础胰岛素类似物(例如Lantus® (Sanofi-Aventis)，其含有在pH 4.0下的非缓冲的甘精胰岛素和锌离子溶液)的纤维化，由于在室温或高于室温下的物理降解也可以限制其贮存期限；此类制剂中采用的酸性条件损害胰岛素的自组装并削弱锌离子的结合，降低了胰岛素类似物可以通过在锌-蛋白质组装内的隔离得到保护的程度。

胰岛素易受化学降解影响，所述化学降解涉及化学键的断裂，伴随分子内的原子重排丧失、或不同胰岛素分子之间的化学键形成。这种化学键的变化通常在蛋白质的解折叠状态下介导，并且因此加强其热力学稳定性的胰岛素修饰也很可能延迟或防止化学降解。

胰岛素也易受物理降解影响。目前的蛋白质纤维化理论认为，纤维化的机制经由部分折叠的中间状态进行，所述中间状态继而又聚集以形成淀粉样蛋白核(amyloidogenicnucleus)。根据这一理论，有可能稳定天然状态的氨基酸取代可能稳定或可能不稳定部分折叠的中间状态，并且可能增加(或降低)或可能不增加(或降低)天然状态和中间状态之间的自由能垒。因此，目前的理论指示，双链胰岛素分子中的给定氨基酸取代增加或减少纤维化风险的趋势是高度不可预测的。胰岛素分子的结构模型设想了三个α螺旋的接近完全的解折叠(如在天然状态中可见的)，其中β折叠的平行排列形成了B链的相继堆叠和A链的相继堆叠；链之间和A链内的天然二硫键配对得到保留。这种平行的交叉β折叠需要在A链的N末端和B链的C末端之间的基本分开(>30 Å)，末端通常在胰岛素单体的天然状态下紧密接近(< 10 Å)。

具有缩短的C结构域的单链胰岛素类似物对纤维化的显著抗性是本领域已知的，并且被认为反映了胰岛素原丝中的平行交叉β折叠的展开结构与具有天然二硫键配对的单链胰岛素类似物的结构之间的拓扑不相容性，其中缩短的C-结构域限制在原丝中不利的A链的N末端和B链的C末端之间的距离。相对于含有Lys

本发明解决了通过A链和B链之间(例如，Lys

因此，需要这样的单链胰岛素类似物，其含有简化的C结构域序列，使得其生物学和生物物理学性质容易地优化，用于有利的治疗应用。此类应用的实例通过以下提供：(i)在外部或内部胰岛素泵的性能中的快速作用，以及(ii)在用于发展中国家的挑战地区的超稳定和单组分可溶性制剂中的双相性作用。特别需要简化的C结构域序列，其中SCI对糖尿病哺乳动物中的皮下注射的快速作用，在A结构域或B结构域中的稳定取代的存在下、和/或在本领域已知加速双链胰岛素类似物吸收的B结构域取代的存在下得到维持。

发明内容

因此，本发明的一个方面提供了单链胰岛素类似物，其含有具有内部聚丙氨酸子区段的简化的C结构域序列。这些序列具有长度4-11，并且含有N末端酸性残基(天冬氨酸或谷氨酸)、以及其为丙氨酸、酸性残基或碱性残基(

附图说明

图1A是人胰岛素原的序列的示意图，所述人胰岛素原的序列包括A链和B链、以及显示有侧翼二元切割位点(实心圆圈)和C肽(空心圆圈)的连接区。

图1B是胰岛素原的结构模型，由胰岛素样部分和无序的连接肽(虚线)组成。

图1C是人胰岛素的序列的示意图，其指示了B链中的残基B27和B30的位置。

图2描绘了SCI-c (PDB: 2JZQ (29))的溶液结构，其中显示了A结构域、B结构域、C结构域和天然二硫键。

图3A是[Asp

图3B是Hua, Q.X.等人((2008) “Design of an active ultrastable single-chain insulin analog: synthesis, structure, and therapeutic implications.”

图3C是根据Vinther等人((2013) “Insulin analog with additionaldisulfide bond has increased stability and preserved activity.”

图3D是在

图4提供了本发明的简化的C结构域的示意性图示，所述简化的C结构域含有N末端元件(E-A-)、含有n = 0、1、2、3、4、5、6或7个残基的聚丙氨酸子区段(A

图5提供了天然胰岛素中的A1-A8 α螺旋(显示为圆柱体，且序列在下方)的示意性图示，其突出显示了与本发明相关的静电特征。野生型序列含有中心酸性残基(Glu

图6提供了在使用链脲佐菌素致使糖尿病的Sprague-Dawley大鼠中的生物学测试结果：研究了相对于

具体实施方式

本发明涉及单链胰岛素类似物，其提供了(i)由于简化且缩短的C结构域(长度4-11个残基)的存在，而增强的稳定性和对纤维化的抗性，以及(ii)容易且方便的生物学、生物物理学和药效学性质的共优化。本发明的单链胰岛素类似物可以具有4.0至6.0的等电点(且因此适合于在中性pH条件下配制为速效胰岛素类似物制剂)，或可以具有6.5至8.0的等电点(且因此适合于在酸性pH条件下配制为基础胰岛素类似物制剂)。这一策略的分子实施方案通过在酵母巴斯德毕赤酵母(

本发明的缩短的C结构域在图5中以示意性形式显示。天然胰岛素中的A1-A8 α螺旋(显示为圆柱体，且序列在下方)突出显示了与本发明相关的静电特征。野生型序列含有中心酸性残基(Glu

C结构域的C末端残基提供了“可调旋钮”，以促进类似物的等电点(以及因此的pH依赖性溶解度)、热力学稳定性、区段A1-A8螺旋动力学、药代动力学性质和药效学性质的共优化。虽然不预期受理论限制，但该旋钮定位为通过静电相互作用与包括作为潜在的N帽残基的螺旋偶极轴(图5中的水平箭头)相互作用，以及经由(i, i – 4)侧链相互作用与Glu

本发明的单链胰岛素类似物还可以含有在其分别的A结构域和B结构域内的取代。B结构域取代可以包括本领域已知的变体，以削弱自结合并因此赋予在皮下注射时的快速吸收；实例包括AspB28 (如Novolog®；

鉴于人胰岛素和动物胰岛素之间的相似性，以及过去在患有糖尿病的人患者中的动物胰岛素使用，还设想了可以在胰岛素的序列中引入其它微小修饰，尤其是视为“保守的”那些取代。例如，可以在具有相似侧链的氨基酸组内进行另外的氨基酸取代，而不脱离本发明。这些包括中性疏水性氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)和甲硫氨酸(Met或M)。同样地，中性极性氨基酸可以在其甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Glu或Q)和天冬酰胺(Asn或N)组内彼此取代。碱性氨基酸被认为包括赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和组氨酸(His或H)。酸性氨基酸是天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)。除非另有说明或每当根据上下文显而易见时，本文指出的氨基酸应该被视为L-氨基酸。标准氨基酸也可以被属于同一化学类别的非标准氨基酸取代。作为非限制性实例，碱性侧链Lys可以被较短侧链长度的碱性氨基酸(鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸)替换。Lys也可以被中性脂肪族电子等排体正亮氨酸(Nle)替换，所述正亮氨酸(Nle)继而又可以被含有较短脂肪族侧链的类似物(氨基丁酸或氨基丙酸)取代。

如所述的(Glidden, M.D.等人2017ab, “Solution structure of an ultra-stable single-chain insulin analog connects protein dynamics to a novelmechanism of receptor binding.”

SCI-4的连接结构域或C结构域具有包含N末端[Asp/Glu]-Ala元件的一般结构，所述元件作用于损害SCI与促有丝分裂的1型IGF受体(IGF-1R)的结合。C末端元件Ala-Xaa(其中Xaa选自由丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸或丝氨酸组成的氨基酸子集)提供了可调旋钮(tuneable knob)，以调节类似物的等电点、稳定性、区段螺旋稳定性和药效学性质。本发明的缩短的C结构域任选地包含含有n＝0、1、2、3、4、5、6或7个残基的聚丙氨酸子区段(A

在如通过Menting, J.G.等人(2014, “Protective hinge in insulin opens toenable its receptor engagement.”

用于治疗糖尿病患者的方法包括施用如本文所述的单链胰岛素类似物。本发明的胰岛素类似物可以用作药物或用于治疗疾病。在一些实例中，胰岛素类似物可以用于制造用于治疗糖尿病的药物。

本发明的另一个方面是单链胰岛素类似物可以在酵母(巴斯德毕赤酵母)中进行制备，或经受通过天然片段连接的全化学合成。在非标准修饰，如D-氨基酸取代、Phe或Tyr的芳环内的卤素取代、或者丝氨酸或苏氨酸通过碳水化合物的O联修饰的情况下，合成制备途径是优选的；然而，借助于扩展遗传密码技术或四碱基密码子技术，来制造含有非标准修饰的单链类似物的子集将是可行的。本发明的另外一个方面是非标准氨基酸取代的使用可以加强单链胰岛素类似物对化学降解或物理降解的抗性。我们进一步设想了本发明的类似物提供用于治疗糖尿病或代谢综合征的方法。胰岛素类似物的递送途径通常是通过经由使用注射器或笔装置的皮下注射。可以类似地使用胰岛素泵，例如外部胰岛素泵或可植入腹膜内泵。

本发明的单链胰岛素类似物还可以含有其它修饰，例如在位置B24、B25或B26处的卤素原子，如美国专利号8,921,313中更充分地描述的，所述美国专利的公开内容引入本文作为参考。由于残基B1-B3的缺失，本发明的胰岛素类似物还可以含有缩短的B链。

药物组合物可以包含此类胰岛素类似物及其生理学上可接受的盐，其可以任选地包含锌。锌离子可以以不同的锌离子:蛋白质比率包括，所述比率范围从2.2个锌原子/胰岛素类似物六聚体到10个锌原子/胰岛素类似物六聚体。制剂的pH可以在pH 3.0 – 4.5的范围内(作为pI转变的单链胰岛素类似物的基础制剂)，或在pH 6.5-8.0的范围内(作为其pI类似于野生型胰岛素的单链胰岛素类似物的膳食胰岛素制剂)。在任一此类制剂中，胰岛素类似物的浓度通常为约0.6-5.0 mM；可以在小瓶或笔中使用高达5 mM的浓度；更浓缩的制剂(U-200或更高，包括在U-500直到U-1000的范围内)在具有显著胰岛素抗性的患者中可能是特别有益的。赋形剂可以包括甘油、甘氨酸、精氨酸、Tris、其它缓冲剂和盐，以及抗微生物防腐剂如苯酚和间甲酚；后一种防腐剂已知增强胰岛素六聚体的稳定性。这种药物组合物可以通过向患者施用生理学有效量的组合物，用于治疗患有糖尿病或其它医学病状的患者。

为了比较的目的，提供了作为SEQ ID NO: 1的人胰岛素原的氨基酸序列。

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

人胰岛素的A链的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 2提供。

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

人胰岛素的B链的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 3提供。

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr

SCI-4的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 4提供。

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr-Glu-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

SCI-2的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 5提供。

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

SCI-3的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 6提供

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

基于前述公开内容，目前应该显而易见的是，超稳定的单链胰岛素类似物可以通过含有聚丙氨酸子区段的缩短且简化的C结构域的共同改造，使得与不受干扰的胰岛素信号传导的持续时间相容。所提供的所得到的单链胰岛素类似物将实现上文阐述的目的。即，这些修饰的蛋白质显示出对纤维化的抗性增强，同时保留了期望的药代动力学特征(如可能是治疗上需要的，赋予来自皮下贮库的快速或延长的吸收率)，并且维持野生型胰岛素的至少一小部分生物活性。因此，应理解，任何明显的变化都落入本发明的范围内，并且因此，可以确定特定组分元件的选择，而不脱离本文公开且描述的本发明的精神。