降尿酸的鲍鱼内脏多肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种降尿酸的鲍鱼内脏多肽及其制备方法和应用。

背景技术

鲍鱼属于单壳软体动物，是中国传统的名贵食材，位居四大海味之首，被称为“海味珍品之冠”，有“一口鲍鱼一口金”之说。鲍鱼具有较高的营养价值及药用价值，《食疗本草》记载，鲍鱼“入肝通瘀，入肠涤垢，不伤元气”，实验表明鲍鱼能够提高免疫力，破坏癌细胞代谢过程，提高抑瘤率，有保护免疫系统的作用。鲍鱼内脏在食用时常常作为副产物被丢弃，但其内脏中含有大量多糖、脂质和蛋白肽，从鲍鱼内脏中提取制备蛋白肽，可以实现鲍鱼加工生产废弃物的有效利用。

高尿酸血症在我国成年人中的患病率已达24.4％，除了患病率迅速上升外，受影响人口的平均年龄也逐渐下降，高尿酸血症的特征是血清中尿酸水平的升高，尿酸结晶在关节内聚积会进一步诱发痛风性关节炎、肾结石和其他肾脏疾病。造成尿酸水平上升的主要原因是黄嘌呤氧化酶(XOD)，催化黄嘌呤和次黄嘌呤形成尿酸。目前高尿酸血症的治疗常用丙磺舒、苯溴马隆(促进尿酸排泄类药物)，普瑞凯希、拉布立酶(尿酸分解类药物)以及别嘌呤醇等(尿酸合成抑制类药物)。其中，部分药物可导致较为严重的副作用：肝、肾功能损伤，超敏反应，腹泻，胃痛、皮疹等。因此现在迫切需要筛选效果好副作用少的天然降尿酸物质以缓解高尿酸血症。

发明内容

为解决上述问题，本发明的实施例在第一方面提出了一种降尿酸的鲍鱼内脏多肽，其氨基酸序列为LES。

根据本发明实施例的一种降尿酸的鲍鱼内脏多肽，该多肽具有黄嘌呤氧化酶抑制作用强和可降尿酸的优点，可用作降尿酸的药品，拓宽鲍鱼内脏的附加值。

本发明的实施例在第二方面提出了一种上述的降尿酸的鲍鱼内脏多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)鲍鱼内脏按照料液比1g:10～15mL加蒸馏水均质，调节pH至7.0～8.0，得鲍鱼内脏浆液；

(2)鲍鱼内脏浆液中，按照鲍鱼内脏质量添加4％～6％的木瓜蛋白酶，调整酶解温度为40～50℃，酶解处理4～6h后，沸水灭酶10min，得一次酶解液；调节一次酶解液pH至1.0～3.0，按照鲍鱼内脏质量添加4％～6％的酸性蛋白酶，调整酶解温度为45～55℃，酶解处理4～6h后沸水灭酶10min，得二次酶解液；

(3)将二次酶解液离心，取上清液，经超滤和层析，得到降尿酸的鲍鱼内脏多肽。

根据本发明的实施例，该方法对鲍鱼内脏进行分步酶解，再经超滤和层析，获得可降尿酸的鲍鱼内脏多肽。

可选地，步骤(1)中，木瓜蛋白酶的酶活力≥200U/mg。

可选地，步骤(2)中，酸性蛋白酶的酶活力≥200U/mg。

可选地，步骤(3)中，超滤为使用截留分子量为3kD的超滤管收集分子量小于3kD的酶解产物。

可选地，步骤(3)中，使用Sephadex G-15凝胶色谱柱对超滤后的上清液进行柱层析：上样浓度为20～40mg/mL，上样量1mL，流速800μL/min，每5min收集一管，在280nm检测并绘制吸光度曲线，利用蛋白质固相序列分析仪鉴定鲍鱼内脏多肽的氨基酸序列为LES。

根据本发明的实施例，本发明还提出上述的鲍鱼内脏多肽在制备降尿酸药物中的应用，以实现鲍鱼内脏高附加值的综合利用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为根据本发明实施例的样品的SephadexG-15柱层析洗脱图；

图2为根据本发明实施例的多肽在XOD活性口袋中的构象；

图3为根据本发明实施例的多肽对HK-2细胞的XOD酶活抑制作用；

图4为根据本发明实施例的多肽对HK-2细胞的体外降尿酸作用。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1

(1)样品前处理：选择5g鲍鱼内脏，加25mL蒸馏水均质成浆，调节pH至7.0。

(2)酶解：一次酶解条件为：使用木瓜蛋白酶，料液比1:10，加酶量5％，酶解5h，酶解温度50℃，初始pH为7.0；二次酶解条件为：使用酸性蛋白酶，加酶量4％，酶解4.5h，酶解温度50℃，初始pH为2.0；酶解处理后，沸水灭活酶，获得酶解液，酶解液冷却至室温后，在4℃下10000r/min离心10min，离心后取上清液。

(3)超滤：利用膜过滤系统对鲍鱼内脏活性肽溶液进行超滤分离，使用截留分子量为3kD的超滤管进行分离分级，得到小于3kD组分后，冷冻干燥检测其活性；

(4)凝胶柱层析：将超滤后的组分重溶后，以5000rpm常温离心10min，上清液过SephadexG-15凝胶色谱柱，上样浓度为20mg/mL，上样量为1mL，流速为800μL/min，每5min收集一管，在280nm检测并绘制吸光度曲线，结果如图2所示，洗脱液自含100％乙腈开始，至10％乙腈和90％0.1％三氟乙酸-水(v/v)的混合液结束，进行梯度洗脱，收集38％乙腈和62％0.1％三氟乙酸-水(v/v)处的洗脱峰对应的组分，得到高纯度的降尿酸鲍鱼内脏活性肽组分0.242g。

实施例2

将实施例1得到的降尿酸鲍鱼内脏活性肽用蛋白质固相序列分析仪(AppliedBiosystems Model 476A,Perkin ElmerCo.MA,U.S.A)测定，得知该降尿酸鲍鱼内脏活性肽的氨基酸全序列为LES。

基于分子对接使用软件Autodock(version 4.2)对实例1得到的多肽进行分子模拟，多肽的空间结构由ChemDraw 11.0(Cambridge Soft Corporation,Cambridge,Massachusetts,USA)软件绘制。使用Open Babel GUI将多肽结构保存为mol2格式，以Tripos力场能量最小化原则构建多肽分子结构。在Autodock中进行质子化状态和氢取向的优化，并保存为pdbqt文件作为配体文件。采用Lamarkian genetic algorithm(LGA)进行对接的计算，并设置energy range＝4.0，exhaustiveness＝9.0，num modes＝30.0。

从PDB数据库中获取XOD的3D结构(PDB ID:3BDJ)，保留含MoS的C链做对接研究。去除水分子，加上极性氢原子后，将赋予XOD全原子Kollman联合双原子局部电荷。将盒子(Gridbox)设定在预测得到的XOD活性口袋(含MoS疏水空腔中)，网格定位为

结果如图2所示，活性肽进入了XOD的活性中心，占据的疏水口袋，并与周围的氨基酸残基产生键合作用，结合较为紧密，可以有效防止嘌呤类底物的进入，达到黄嘌呤氧化酶的活性抑制效果。

实施例3

将实施例1制备的鲍鱼内脏多肽LES进行体外XOD抑制实验：将100μL PBS(0.1M，pH＝7.0)、25μL多肽溶液，25μL XOD(5U/mL)依次加入96孔板中，振荡混匀，在37℃避光孵育10min后，依次加入50μL黄嘌呤(1mM)和25μL NBT(1mM)，振荡混匀，在37℃下避光孵育30min后，用酶标仪在560nm处检测吸光值。阳性药物为别嘌呤醇，调零组用PBS代替样品和黄嘌呤；完全反应组用PBS代替样品；样品对照组用PBS代替黄嘌呤氧化酶。

XOD抑制率(％)＝[1-(C

式中：C

结果如图3所示，LES多肽对黄嘌呤氧化酶具有良好的抑制效果，呈浓度依赖性，具有明显的抑制黄嘌呤氧化酶活性作用。

将实施例1制备的鲍鱼内脏多肽LES进行BRL-3A高尿酸血症模型：将HK-2细胞在完全培养基中培养至亚融合状态，以1×100个/mL(总体积1.0mL/孔)密度接种于24孔板中，37℃孵育48h后，吸出培养液，用PBS洗涤2次，然后空白对照组和模型组换成无血清的不完全培养基，样品组加入含有不同浓度LES的不完全培养基,进行后续培养。24h后，PBS洗涤三次，空白对照组：HK-2细胞在不完全培养基中继续培养38h，严格按照尿酸试剂盒内说明书操作，对细胞培养液上清中的尿酸含量进行检测；模型组：HK-2细胞在加入腺苷(2.5mmoL/L)诱导的不完全培养液中继续培养30h，然后加入XO(0.005U/mL)，继续培养8h，严格按照尿酸试剂盒内说明书操作，对细胞培养液上清中的尿酸含量进行检测；样品组：HK-2细胞在加入腺苷(2.5mmoL/L)诱导的不完全培养液中继续培养30h，然后加入XO(0.005U/mL),继续培养8h，严格按照尿酸试剂盒内说明书操作，对细胞培养液上清中的尿酸含量进行检测。(补充实验过程)。

结果如图4所示，LES多肽可降低高尿酸血症HK-2细胞培养液上清中尿酸含量，并呈剂量依赖性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。