一种用于检测HVP基因分型的引物荧光探针、方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术与医学技术领域，涉及一种用于检测HVP基因分型的引物荧光探针、方法及应用。

背景技术

宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤，原位癌高发年龄为30至35岁，浸润癌为45至55岁，国家癌症中心2018年发布的数据显示，90％的宫颈癌患者确诊时已经发展成浸润癌，生存率大大降低，预后也较差，因此，宫颈癌早期筛查是有效预防宫颈癌的重要途径，宫颈癌早筛方案也为降低宫颈癌发病率和死亡率提供了有利支撑。

目前，临床上用于HPV检测的方法主要包括细胞学方法、免疫组化、荧光原位杂交、斑点杂交、熔解曲线和荧光PCR等，不同检测方法各有优缺点。实时荧光PCR检测方法是HPV诊断的最常见检测方法，在完全封闭的系统中运行，能有效避免污染，加入特异性探针，既提高了检测的灵敏度和特异性，又可以实时荧光监测扩增过程。但也存在一些不足，常规的荧光PCR只有四个通道，每一个通道只能检测一种靶标基因，通量比较小，不利于分型检测。反向点杂交法，优点是通过大，灵敏度高，适用于分型检测，缺点是成本高，易于污染。Digene公司推出的杂交捕获第二代检测技术(Hybrid Capture Test-Ⅱ,HC2)，灵敏度较高，但容易发生交叉反应，成本高，操作不方便。高度多重熔解曲线检测是基于熔解曲线技术，结合TaqMan探针检测法，设计与靶标结合的TaqMan探针，探针的Tm值不同，产生的熔解峰Tm也不同，使得单荧光可以检测出多种靶标基因。高度多重溶解曲线法，具备熔解曲线法和荧光探针的优点，检测通量大、操作简便、高效廉价，适用于宫颈癌筛查。

现有HPV检测产品，部分产品不具有分型功能，HPV荧光分型产品，每条通道只能检测一种靶标，单次检测样本通量少，极大地增加了试剂成本和人工成本。现有获批的熔解曲线分型检测产品较少，且灵敏度不高，检测限在500-1000拷贝/反应，显著低于其它方法学检测产品。

因此，亟需提供一种高灵敏、低成本的HPV分型检测试剂盒，用于HPV的分型检测。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于检测HVP基因分型的引物荧光探针、方法及应用，采用共探针标记及通用引物扩增，减少探针和引物数量，降低引物探针之间的相互抑制，使反应更加高效，极大地提高灵敏度和特异性；单管分型检测21种HPV型别及内参，增加检测通量，降低材料成本，缩短检测时间，节省人工；采用双淬灭探针，降低荧光本底，能够有效地减少非特异峰的产生，进一步提高特异性。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种用于检测HVP基因分型的引物及荧光探针，所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.38所示的序列中的任意一个或至少两个的组合；所述荧光探针的核酸序列包括SEQ ID NO.39-SEQ ID NO.56所示的序列中的任意一个或至少两个的组合；所述HVP基因分型包括HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82、HPV6、HPV11或HPV81中的任意一个或至少两个的组合。

本发明采用共探针标记及通用引物扩增，减少探针和引物数量，降低引物探针之间的相互抑制，使反应更加高效，极大地提高灵敏度和特异性；单管分型检测21种HPV型别及内参，增加检测通量，降低材料成本，缩短检测时间，节省人工；采用双淬灭探针，降低荧光本底，能够有效地减少非特异峰的产生，进一步提高特异性。

引物探针序列如表1所示。

表1

优选地，所述荧光探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团。

优选地，所述荧光基团包括FAM、VIC、ROX或CY5中任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、DBQ1或BHQ3中任意一种或至少两种的组合。

第二方面，本发明提供了第一方面所述的用于检测HVP基因分型的引物及荧光探针在制备用于检测HVP基因分型的产品中的应用。

第三方面，本发明提供了一种用于检测HVP基因分型的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测HVP基因分型的引物及荧光探针。

第四方面，本发明提供了第一方面所述的用于检测HVP基因分型的引物及荧光探针在检测检测HVP基因分型中的应用。

第五方面，本发明提供了一种非疾病诊断和/或治疗为目的的检测HVP基因分型的方法，所述方法包括：

以待测样本的核酸为模板，利用第一方面所述的用于检测HVP基因分型的引物及荧光探针进行荧光PCR扩增，根据荧光PCR扩增结果进行判断。

优选地，所述荧光PCR扩增的靶点包括HPVE6基因序列和HPVE7区基因序列。

以E6和E7区作为检测靶点，能够有效地避免HPV整合过程的基因丢失(如L1和E1基因丢失)导致假阴性。

优选地，所述HVP基因分型包括HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82、HPV6、HPV11或HPV81中的任意一个或至少两个的组合。

优选地，所述荧光PCR扩增的体系包括第一方面所述的用于检测HVP基因分型的引物及荧光探针。

优选地，所述荧光PCR扩增的体系还包括：PCRbuffer缓冲液、dNTP、Taq酶、UDG酶和模板。

本发明中，PCR反应体系为25μL体系，PCRbuffer缓冲液含Mg

优选地，所述dNTP的浓度为0.20-0.8mmol/L；所述Taq酶的浓度为2.0-4.0U；所述引物中上游引物的终浓度为0.10-0.30mmol/L；所述引物中下游引物的终浓度为0.30-0.80mmol/L；所述荧光探针的终浓度为0.20-0.40mmol/L；所述UDG酶的终浓度为0.20-0.80U；所述模板的用量为1-3μL。

上述0.20-0.8mmol/L中的具体点值可以选择0.20mmol/L、0.30mmol/L、0.40mmol/L、0.50mmol/L、0.60mmol/L、0.70mmol/L、0.8mmol/L等。

上述2.0-4.0U中的具体点值可以选择2.0U、3.0U、4.0U等。

上述0.20-0.80U中的具体点值可以选择0.20U、0.30U、0.40、0.50U、0.60、0.70、0.80U等。

上述1-3μL中的具体点值可以选择1μL、2μL、3μL等。

50-52℃3-5min，93-95℃2-5min，1个循环；93-95℃6-10s，64-68℃20-40s，72-75℃10-20s，40-50个循环；93-95℃10-20s，40-45℃2-5min，40-78℃以0.05℃/s升温且期间连续采荧光，40-45℃10-20s，1个循环。

上述50-52℃中的具体点值可以选择50℃、51℃、52℃等。

上述3-5min中的具体点值可以选择3min、4min、5min等。

上述93-95℃中的具体点值可以选择93℃、94℃、95℃等。

上述2-5min中的具体点值可以选择2min、3min、4min、5min等。

上述6-10s中的具体点值可以选择6s、7s、8s、9s、10s等。

上述64-68℃中的具体点值可以选择64℃、65℃、66℃、67℃、68℃等。

上述20-40s中的具体点值可以选择20s、25s、30s、35s、40s等。

上述72-75℃中的具体点值可以选择72℃、73℃、74℃、75℃等。

上述10-20s中的具体点值可以选择10s、12s、14s、16s、18s、20s等。

上述40-50个循环中的具体点值可以选择40个循环、42个循环、44个循环、46个循环、48个循环、50个循环等。

上述40-45℃中的具体点值可以选择40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃等。

上述40-78℃中的具体点值可以选择40℃、50℃、60℃、70℃、72℃、74℃、78℃等。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明方法基于熔解曲线技术基础，结合TaqMan探针技术，使得单荧光通道可以检测出更多的靶标基因，荧光PCR仪包含多条荧光通道，使检测的靶标数量大大增加，熔解曲线探针的设计决定熔解峰Tm值，探针的长度和靶序列的匹配度，可以直接反映在Tm值上，因此，本发明在同一条探针的3‘端和5’端同时设计两个检测靶标，且两个靶标的Tm值不一致，根据Tm值的不同，单条探针可以同时检测出两个靶标基因，提高检测测通量；

(2)引物设计在保守区，不同亚型可以共用相同引物，减少引物的数量，减少反应体系引物探针之间的抑制，提高灵敏度；

(3)常规的实时荧光PCR法，一般分为4个荧光通道，每个通道检测一个基因，通量较小，在本发明中，实现单管四通道分型检测21种型别，检测通量大，操作方便快捷，提高检测效率，降低成本，一个反应管内可以同时分型检测出21种HPV型别(HPV16，HPV18，HPV26，HPV31，HPV33，HPV35，HPV39，HPV45，HPV51，HPV52，HPV53，HPV56，HPV58，HPV59，HPV66，HPV68，HPV73，HPV82，HPV6，HPV11，HPV81)，操作方便，价格低廉，适用于宫颈癌早筛；

(4)本发明采用双淬灭探针，在淬灭探针新增了一个探针内部淬灭基团，降低荧光本底，使淬灭更彻底，背景信号更低，减少不同通道的干扰，能够有效地减少非特异峰的产生降低非特异，提高灵敏度；

(5)防污染的PCR反应体系，在PCR反应液配制时，将dUTP和dTTP按一定的比例混用，使得扩增产物都含有脱氧尿嘧啶，进行PCR扩增前，在PCR混合液添加UDG酶，消除PCR扩增中的残余污染，确保实验的准确性。

附图说明

图1A为常规探针测试图(16型)；

图1B为常规探针测试图(18型)；

图1C为共用探针测试图；(16、18型)

图2A为双淬灭探针测试图(11型)；

图2B为双淬灭探针测试图(45型)；

图3A非兼并引物测试图(56、66型)；

图3B兼并/非兼并引物混合测试图(56、66型)；

图3C兼并/非兼并引物混合测试图(56、66型)；

图3D兼并引物测试图(56、66型)；

图4A为UDG酶的优化测试图(无UDG酶对照体系)；

图4B为UDG酶的优化测试图(UDG酶0.1U/反应)；

图4C为UDG酶的优化测试图(UDG酶0.2U/反应)；

图4D为UDG酶的优化测试图(UDG酶0.4U/反应)；

图4E为UDG酶的优化测试图(UDG酶0.8U/反应)；

图5A为HPV熔解曲线法的建立图(阳性样本)；

图5B为HPV熔解曲线法的建立图(阴性质控)；

图6A为HPV熔解曲线检测限结果图(FAM通道示例)；

图6B为HPV熔解曲线检测限结果图(VIC通道示例)；

图6C为HPV熔解曲线检测限结果图(ROX通道示例)；

图6D为HPV熔解曲线检测限结果图(CY5通道示例)。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

常规探针与共探针的比较研究。

针对16型和18型设计特异性探针和引物，每种型别设计三套引物探针，分别筛选出16型和18型最佳引物探针组合；设计三套16/18型共用探针，筛选出最优引物探针组合，比较最佳常规探针与最佳共用探针的灵敏及特异性。共用探针的长度一般不超过50bp，如果探针太长，也会影响探针的结合效率，配制16型和18型常规探针和共用探针反应体系(见表2)，分别测试10例16型和18型阳性样本，比较常规探针和共用探针的准确率和灵敏度。

表2

常规/共探针的测试结果见表3。

表3

检测结果：常规探针的检测限为80copies/反应，共用探针的检测限为40copies/反应，具体结果见表3，共用探针的灵敏度显著高于常规探针灵敏度，见图1A-1C。

实施例2

双淬灭探针的设计及测试。

双淬灭探针有利于降低荧光本底，减少非特异峰产生，针对个测试过程中本底较高的型别(11型和45型)，设计单淬灭和双淬灭探针，评估单/双淬灭探针的熔解峰效果。

检测结果：相对于单淬灭探针，双淬灭探针的本底更低，熔解峰更高，不容易产生非特异峰，更有利于熔解峰值的判读，见图2A-2B。

实施例3

兼并引物和特异性探针的设计及测试。

针对同源性较高的HPV型别，设计兼并引物，在探针设计上，选择高特异区段作为探针序列，根据表4引物探针组合，配制反应体系，评估引物探针的灵敏度。

表4

兼并/非兼并引物的测试结果见表5。

表5

检测结果：当上下游为非兼并引物，56型和66型灵敏度都为100copies/反应；当上游为兼并引物，当下游为非兼并引物，56型和66型灵敏度都为60copies/反应；当上游为非兼并引物，当下游为兼并引物，56型和66型灵敏度都为40copies/反应；当上下游为兼并引物，56型和66型灵敏度都为20copies/反应，见表5和图3A-3D。使用兼并引物，减少反应体系中引物数量，进而减少引物之间的相互抑制，减少抑制，提高灵敏度。

实施例4

防污染体系的建立。

在PCR体系加入5×10

检测结果：在0.2U/反应、0.4U/反应、0.8U/反应的浓度下，能够将含dUTP的PCR扩增产物全部清除(见图4A-4E)，为了节约成本，选择0.2U/反应作为体系的反应浓度。

实施例5

高危HPV检测试剂盒反应体系的建立。

将单体系优化过的21种HPV型别和内参的引物/探针分配到1个反应管，见表6。

表6

1.1样本采集

收集HPV阳性样本和阴性样本，提取样本DNA，用于评估HPV检测试剂盒的性能。

1.2PCR引物/探针浓度的优化

在反应体系中，将引物/探针浓度稀释到0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L，稀释后进行检测，分析实验结果，确定试剂盒前引物终浓度为0.10μmol/L，后引物终浓度为0.30μmol/L，探针终浓度为0.20μmol/L。

1.3Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化

通过比较Taq酶用量(1.0U、2.0U、3.0U、4.0U、5.0U)的优化实验结果，选定2.0U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用量。

1.4dNTP浓度的优化

反应体系中加入不同的dNTP浓度(0.10mmol/L、0.20mmol/L、0.30mmol/L、0.40mmol/L)进行检测，综合评估后选0.20mmol/L作为试剂盒反应体系中dNTP的使用量。

1.5UDG酶用量的优化

通过比较UDG酶用量(0.1U、0.2U、0.4U、0.8U)的优化实验结果，选定0.2U作为试剂盒反应体系中UDG酶的用量。

利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光PCR反应体系为25μL体系，所需各组分及相应浓度见表5。

表7

2.仪器检测通道的选择：

在进行荧光PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。

3.PCR条件选择如下：

50℃3min，95℃2min，1个循环；95℃8s，64℃30s，72℃10s，50个循环；95℃15s，40℃2min，40-78℃以0.05℃/s升温且期间连续采荧光，40℃10s，1个循环。

4.利用建立的反应体系对提取样本DNA进行检测，阳性样本内参与对应型别处均有典型熔解峰且为正峰(见图5A)，且峰值大于等10，阴性质控无熔解峰(见图5B)。

实施例5

测试试剂盒的检测下限。

合成HPV16，HPV18，HPV26，HPV31，HPV33，HPV35，HPV39，HPV45，HPV51，HPV52，HPV53，HPV56，HPV58，HPV59，HPV66，HPV68，HPV73，HPV82，HPV6，HPV11，HPV81的质粒，每个型别按2个拷贝/反应、2×10

实施例6

临床样本的检测。

用A1公司的单管检测试剂盒(备案号20183400427)，A2公司的多管检测试剂盒(备案号20153400364)和本发明试剂盒分别测试118例HPV阳性样本(21种型别，每种型别各2-10例)和36例阴性样本，检测结果见表8。

表8

检测结果：本发明试剂盒和A2公司的多管检测试剂盒的准确率为99.3％，A1公司的单管检测试剂盒的准确率为95.0％。结果表明本发明试剂盒的准确性高，单管检测，操作方便，价格低廉，适用于HPV分型检测。

综上所述，本发明采用共探针标记及通用引物扩增，减少探针和引物数量，降低引物探针之间的相互抑制，使反应更加高效，极大地提高灵敏度和特异性；单管分型检测21种HPV型别(HPV16，HPV18，HPV26，HPV31，HPV33，HPV35，HPV39，HPV45，HPV51，HPV52，HPV53，HPV56，HPV58，HPV59，HPV66，HPV68，HPV73，HPV82，HPV6，HPV11，HPV81)及内参，增加检测通量，降低材料成本，缩短检测时间，节省人工；采用双淬灭探针，降低荧光本底，能够有效地减少非特异峰的产生，进一步提高特异性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。