一种检测样品中酚类杂质含量的前处理方法

技术领域

本发明属于化学分析领域，具体涉及一种检测样品中酚类杂质含量的前处理方法。

背景技术

在新药的审评中，酚类遗传毒性杂质是必须控制的一类杂质。由于酚类物质具有强的化学活性，极易被氧化，现有方法均未能准确、有效测定样品中的痕量酚类杂质。

现有的测定方法通常使用液相色谱法测定酚类直接溶解并稀释的溶液，这种溶液在配制后，酚类杂质会部分氧化为醌类产物，导致响应值增加，测定结果较正常值偏大，溶液放置时间越久，结果偏差越大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测样品中酚类杂质含量的前处理方法。本发明筛选到一种合适的还原剂维生素C，在酚类杂质检测的前处理过程中加入维生素C，可以有效抑制样品中酚类杂质的氧化，从而提高检测准确性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种检测样品中酚类杂质含量的前处理方法，包括以下步骤：

称量样品，置于容量瓶中，加入维生素C的乙腈溶液，溶解样品，摇匀，以维生素C的甲酸溶液定容，过滤，滤液作仪器分析用；

所述维生素C的乙腈溶液和维生素C的甲酸溶液，其中维生素C的含量为90-110μg/ml，优选100μg/ml；

优选地，所述维生素C的乙腈溶液，其溶剂是45-55%（体积百分比）的乙腈溶液；特别优选地，溶剂是50%（体积百分比）的乙腈溶液；

优选地，所述维生素C的甲酸溶液，其溶剂是0.05-0.15%（体积百分比）的甲酸溶液；特别优选地，溶剂是0.1%（体积百分比）的甲酸溶液；

由于酚类杂质极性较大，出峰较快，为减少溶剂效应，本发明先采用维生素C的50%乙腈溶液溶解样品，再加入维生素C的0.1%甲酸溶液使得稀释后的样品溶剂接近于流动相初始比例，以达到减少溶剂效应的目的。

所述的酚类杂质为1,2,4-苯三酚；

所述的样品，可以是原料药或药物制剂；

所述的药物制剂可以是注射剂、片剂、混悬剂、胶囊剂等常见的药物剂型。

所述的仪器分析，优选采用液相色谱分析；

所述的液相色谱分析，采用紫外检测器，直接进样；

所述的液相色谱分析，其部分分析条件如表1所示：

所述的液相色谱分析，还包括配制对照品溶液，具体步骤是：按与样品溶解、定容一样的步骤将对照品溶解、定容，再根据不同药物测定限度的要求，稀释（使用维生素C的甲酸溶液）成不同浓度的对照品溶液。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明的酚类杂质检测前处理方法，可有效解决酚类杂质在测定过程中的稳定性问题，维生素C作为一种还原剂，可以有效抑制酚类目标化合物的氧化，使对照品溶液的稳定时间延长至30小时，使加标回收溶液的稳定时间延长至11小时，同时维生素C和酚类目标物在相应的色谱系统中可以有效地分离，不干扰目标化合物的测定。该方法使检测结果更加准确、稳定和可靠，具有良好的方法耐用性。

2、采用本发明的前处理方法，在酚类杂质检测中可以达到极低的检测限和定量限，且重复性良好。

附图说明

图1是实施例1中空白溶剂（100μg/ml的维生素C溶液）的液相色谱谱图。

图2是实施例1（维生素C溶液为稀释剂）供试品中酚类杂质的液相色谱谱图。

图3是实施例1（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液中酚类杂质的液相色谱谱图（维生素C的含量为90μg/ml）。

图4是实施例1（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液中酚类杂质的液相色谱谱图（维生素C的含量为100μg/ml）。

图5是实施例1（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液中酚类杂质的液相色谱谱图（维生素C的含量为110μg/ml）。

图6是实施例1（维生素C溶液为稀释剂）加标供试品溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

图7是实施例1（维生素C的45%乙腈溶液为稀释剂）对照品溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

图8是实施例1（维生素C的50%乙腈溶液为稀释剂）对照品溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

图9是实施例1（维生素C的55%乙腈溶液为稀释剂）对照品溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

图10是实施例1中（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液0.02mg/L酚类杂质的液相色谱谱图。

图11是实施例1中（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液0.05mg/L酚类杂质的液相色谱谱图。

图12是实施例1中（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液0.1mg/L酚类杂质的液相色谱谱图。

图13是实施例1中（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液0.2mg/L酚类杂质的液相色谱谱图。

图14是实施例1中（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液0.3mg/L酚类杂质的液相色谱谱图。

图15是实施例1中（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液0.4mg/L酚类杂质的液相色谱谱图。

图16是实施例1（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液线性图。

图17是实施例1（维生素C溶液为稀释剂）检测限溶液中酚类杂质（0.01mg/L）的液相色谱谱图。

图18是实施例1（维生素C溶液为稀释剂）定量限溶液中酚类杂质（0.02mg/L）的液相色谱谱图。

图19是实施例1（维生素C溶液为稀释剂）第1批样品溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

图20是实施例1（维生素C溶液为稀释剂）第2批样品溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

图21是实施例1（维生素C溶液为稀释剂）第3批样品溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

图22是实施例1（维生素C溶液为稀释剂）第4批样品溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

图23是实施例1（维生素C溶液为稀释剂）第5批样品溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

图24是实施例2（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液放置0h酚类杂质的液相色谱谱图。

图25是实施例2（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液放置2h酚类杂质的液相色谱谱图。

图26是实施例2（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液放置4h酚类杂质的液相色谱谱图。

图27是实施例2（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液放置8h酚类杂质的液相色谱谱图。

图28是实施例2（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液放置12h酚类杂质的液相色谱谱图。

图29是实施例2（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液放置17h酚类杂质的液相色谱谱图。

图30是实施例2（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液放置30h酚类杂质的液相色谱谱图。

图31是实施例2（维生素C溶液为稀释剂）对照品溶液放置40h酚类杂质的液相色谱谱图。

图32是实施例2（维生素C溶液为稀释剂） 加标回收溶液放置0h酚类杂质的液相色谱谱图。

图33是实施例2（维生素C溶液为稀释剂）加标回收溶液放置2h酚类杂质的液相色谱谱图。

图34是实施例2（维生素C溶液为稀释剂）加标回收溶液放置4h酚类杂质的液相色谱谱图。

图35是实施例2（维生素C溶液为稀释剂）加标回收溶液放置8h酚类杂质的液相色谱谱图。

图36是实施例2（维生素C溶液为稀释剂）加标回收溶液放置11h酚类杂质的液相色谱谱图。

图37是实施例2（维生素C溶液为稀释剂）加标回收溶液放置16h酚类杂质的液相色谱谱图。

图38是实施例2（维生素C溶液为稀释剂）加标回收溶液放置30h酚类杂质的液相色谱谱图。

图39是实施例2（维生素C溶液为稀释剂）加标回收溶液放置40h酚类杂质的液相色谱谱图。

图40是对比例1（10%氢氧化钠溶液为稀释剂）对照品溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

图41是对比例1（10%氢氧化钠溶液为稀释剂）加标供试品溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

图42是对比例2（0.3%过氧化氢溶液为稀释剂）空白溶剂中酚类杂质的液相色谱谱图。

图43是对比例2（0.3%过氧化氢溶液为稀释剂）供试品中酚类杂质的液相色谱谱图。

图44是对比例2（0.3%过氧化氢溶液为稀释剂）对照品溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

图45是对比例2（0.3%过氧化氢溶液为稀释剂）加标回收溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

图46是对比例3中0.06%过氧化氢溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

图47是对比例3中0.15%过氧化氢溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

图48是对比例3中0.3%过氧化氢溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

图49是对比例4（0.3%过氧化氢溶液为稀释剂，同时添加二氧化锰催化剂）空白溶剂中酚类杂质的液相色谱谱图。

图50是对比例4（0.3%过氧化氢溶液为稀释剂，同时添加二氧化锰催化剂）对照品溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

图51是对比例4（0.3%过氧化氢溶液为稀释剂，同时添加二氧化锰催化剂）加标回收溶液中酚类杂质的液相色谱谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

对市售的5批次盐酸帕罗西汀原料药行酚类杂质含量的测定，包括以下步骤：

（1）对照品溶液的配制

精密称量1,2,4-苯三酚对照品10mg，置于10mL容量瓶，先加入0.5mL维生素C（含量100μg/ml）的50%乙腈溶液溶解对照品，再加入维生素C（含量100μg/ml）的0.1%甲酸溶液稀释，定容至刻度，得到浓度为1 mg/mL的酚类杂质对照品储备液Ⅰ，再根据不同药物测定限度的要求，以维生素C（含量100μg/ml）的0.1%甲酸溶液稀释配制成不同浓度的对照品溶液；

（2）样品前处理

供试品：精密称量原料药粉末0.1g，置于10mL容量瓶中，先加入0.5mL的维生素C（含量100μg/ml）的50%乙腈溶液，溶解样品，摇匀，以维生素C（含量100μg/ml）的0.1%甲酸溶液定容至刻度，摇匀，过滤；

加标回收样品：精密称量原料药粉末0.1g，加入适量（200μL、400μL或600μL）1,2,4-苯三酚对照品溶液（浓度约为5μg/ml），置于10mL容量瓶中，按与供试品一样的步骤溶解，定容，过滤；

（3）液相色谱分析条件

酚类杂质的液相色谱分析结果如图1-图9所示。

空白溶剂（100μg/ml的维C溶液）对杂质检测无干扰（图1）。供试品溶液中未检出该杂质1,2,4-苯三酚（图2）。

维生素C的含量为90μg/ml，200ng/ml的酚类杂质对照品溶液在1.492min出峰，峰形良好，且出峰处无干扰峰，峰面积为0.043mAU*min（图3）。

维生素C的含量为100μg/ml，200ng/ml的酚类杂质对照品溶液在1.492min出峰，峰形良好，且出峰处无干扰峰，峰面积为0.044mAU*min（图4）。

维生素C的含量为110μg/ml，200ng/ml的酚类杂质对照品溶液在1.492min出峰，峰形良好，且出峰处无干扰峰，峰面积为0.043mAU*min（图5）。

在加标回收率溶液中，杂质出峰不受影响，和原料药完全分离，峰面积为0.046mAU*min（图6），回收率达104.5%，回收率良好。

维生素C的45%乙腈溶液，200ng/ml的酚类杂质对照品溶液在1.492min出峰，峰形良好，且出峰处无干扰峰，峰面积为0.043mAU*min（图7）。

维生素C的50%乙腈溶液，200ng/ml的酚类杂质对照品溶液在1.492min出峰，峰形良好，且出峰处无干扰峰，峰面积为0.044mAU*min（图8）。

维生素C的55%乙腈溶液，200ng/ml的酚类杂质对照品溶液在1.492min出峰，峰形良好，且出峰处无干扰峰，峰面积为0.042mAU*min（图9）。

故针对酚类杂质的检测，可采用维生素C溶液为稀释剂，回收率合格，空白溶剂无干扰。

（4）结果计算

（5）方法的线性关系及定量限

根据图10-图15不同浓度对照品溶液的色谱图，以峰面积为纵坐标，酚类杂质浓度为横坐标作图（图16），得到酚类杂质的线性方程为y＝0.0002x+0.0009，相关系数为0.9996；

以信噪比为3估算方法的检出限，以信噪比为10估算方法的定量限，酚类杂质的检出限为0.01mg/L（图17），定量限为0.02mg/L（图18）。

（6）实际样品检测

应用以上步骤建立的方法和方程，对本实施例供试品以外的、市售的5批次原料药样品进行酚类杂质（1,2,4-苯三酚）含量的测定，结果表明，所测5批次样品中1,2,4-苯三酚的含量在0.01mg/L～30mg/L之间（图19~图23）。方法重复性良好，同一浓度样品平行配制6份，测定的结果RSD为2.4%，不同操作人员，另外配制6份相同的样品，12份样品测定结果重复性RSD为2.6%。

实施例2

考察酚类杂质在测定过程中的稳定性时间，包括以下步骤：

（1）对照品溶液的配制，同实施例1；

（2）样品前处理，同实施例1；

（3）液相色谱分析条件，同实施例1；

（4）结果分析

在放置不同时长后，检测对照品溶液和加标回收溶液中酚类杂质的浓度，液相色谱分析结果如图24-图39、表4、表5所示：

杂质对照品溶液在0h测得浓度为197.10ng/ml，在30h测得浓度为177.73ng/ml，浓度变化率绝对值为9.8%，在40h测得浓度为157.80ng/ml，浓度变化率绝对值为19.9%，超过15%，由此可知通过加入维生素C溶液，能使对照品溶液的稳定时间延长至30小时。

杂质加标回收溶液在0h测得浓度为199.10ng/ml，在11h测得浓度为227.48ng/ml，浓度变化率绝对值为14.3%，在16h测得浓度为240.91ng/ml，浓度变化率绝对值为21.0%，超过15%，由此可知通过加入维生素C溶液，能使加标回收溶液的稳定时间达到11小时。

通过加入维生素C溶液，可以有效抑制酚类目标化合物的氧化，使对照品溶液的稳定时间延长至30小时，使加标回收溶液的稳定时间延长至11小时，同时维生素C和酚类目标物在相应的色谱系统中可以有效地分离，不干扰目标化合物的测定。该方法使检测结果更加准确、稳定和可靠，具有良好的方法耐用性。

对比例1（样品稀释溶剂采用10%氢氧化钠溶液）

一种检测样品中酚类杂质含量的方法，包括以下步骤：

（1）对照品溶液的配制

精密称量1,2,4-苯三酚对照品10mg，置于10mL容量瓶，以10%（质量体积比；下同）氢氧化钠溶液溶解对照品，定容至刻度，得到浓度约为1 mg/mL的酚类杂质对照品储备液Ⅰ，再根据不同药物测定限度的要求，以10%氢氧化钠溶液配制成不同浓度的对照品溶液。

（2）样品前处理

加标回收溶液：精密称量药物原料样品粉末（制剂样品称样量以所含主成分计）0.1g，加入400μL杂质（1,2,4-苯三酚）对照品溶液（浓度约为5μg/ml），置于10mL容量瓶中，加入适量10%氢氧化钠溶液，摇匀，以10%氢氧化钠溶液定容至刻度，过滤；

（3）液相色谱分析条件

酚类杂质的液相色谱图40-图41所示。

由图可知，加标回收溶液中酚类杂质的峰高和峰面积远远小于对照品溶液，对照品溶液中峰面积为0.021mAU*min（图40），加标回收溶液中峰面积为0.009mAU*min（图41），回收率为42.8%，回收率不合格，且峰形不好，响应太差，故10%氢氧化钠溶液为稀释剂不适用。

对比例2（样品稀释溶剂采用0.3%过氧化氢溶液）

一种检测样品中酚类杂质含量的方法，包括以下步骤：

（1）对照品溶液的配制

精密称量1,2,4-苯三酚对照品约10mg，置于10mL容量瓶，以0.3%（体积百分比）过氧化氢溶液溶解对照品，定容至刻度，得到浓度约为1 mg/mL的酚类杂质对照品储备液Ⅰ，再根据不同药物测定限度的要求，以0.3%过氧化氢配制成不同浓度的对照品溶液。

（2）样品前处理

供试品：精密称量药物原料样品粉末（制剂样品称样量以所含主成分计）约0.1g，置于10mL容量瓶中，加入适量0.3%（体积百分比；下同）过氧化氢溶液，摇匀，以0.3%过氧化氢定容至刻度，过滤；

加标回收溶液：精密称量药物原料样品粉末（制剂样品称样量以所含主成分计）约0.1g，置于10mL容量瓶中，加入400μL杂质（1,2,4-苯三酚）对照品溶液（浓度约为5μg/ml），加入适量0.3%过氧化氢溶液，摇匀，以0.3%过氧化氢定容至刻度，过滤；

（3）液相色谱分析条件同对比例1

酚类杂质的液相色谱图42-图45所示。

空白溶剂和供试品中均有杂质检测信号（图42和图43），对照品溶液和加标回收溶液中杂质响应相当，对照品溶液中峰面积为1.057mAU*min（图44），加标回收溶液中峰面积为1.005mAU*min（图45），回收率为95.1%，，回收率良好。但是0.3%过氧化氢溶液会有干扰，不适用。

对比例3（空白溶剂采用不同浓度的过氧化氢溶液）

一种检测样品中酚类杂质含量的方法，包括以下步骤：

（1）空白溶剂的配制

配制成0.06%、0.15%、0.3%（体积百分比）过氧化氢溶液，以考察低浓度的过氧化氢空白溶剂的干扰影响。

（2）液相色谱分析条件同实施例

空白溶剂的液相色谱如图46-图48所示。

0.06%、0.15%、0.3%过氧化氢溶液均有杂质检测信号，经紫外分光光度计检测发现，过氧化氢在200nm~400nm波长下均有信号，故过氧化氢溶液不适用。

对比例4（采用0.3%过氧化氢溶液为稀释剂，同时添加二氧化锰催化剂）

一种检测样品中酚类杂质含量的方法，包括以下步骤：

（1）对照品溶液的配制

精密称量1,2,4-苯三酚对照品10mg，置于10mL容量瓶，以0.3%（体积百分比）过氧化氢溶液溶解对照品，定容至刻度，得到浓度为1 mg/mL的酚类杂质对照品储备液Ⅰ，添加50mg二氧化锰（5g/L），再根据不同药物测定限度的要求，以0.3%过氧化氢配制成不同浓度的对照品溶液。

（2）样品前处理

精密称量药物原料样品粉末（制剂样品称样量以所含主成分计）0.1g，置于10mL容量瓶中，加入适量0.3%过氧化氢溶液，摇匀，添加50mg二氧化锰，以0.3%过氧化氢定容至刻度，过滤；

（3）液相色谱分析条件

液相色谱图49-图51所示。

由图可知，添加二氧化锰后，空白溶剂依然有干扰（图49），同时对照品溶液和加标回收溶液中杂质响应下降（图50和图51），难以达到分析灵敏度，故不适用。

结论：0.3%过氧化氢溶液为稀释剂，再添加二氧化锰，会导致灵敏度下降很多，不适用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。