一种无质粒无缺陷型L-亮氨酸生产菌株的构建

技术领域

本发明涉及一种无质粒无缺陷型L-亮氨酸生产菌株的构建，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-亮氨酸是一种支链氨基酸，也是人体必需氨基酸，其在医药、食品、饲料等诸多领域具有广泛的应用潜力。亮氨酸是合成肌肉蛋白质的重要组成成分，且作为信号分子调节蛋白质合成过程。近年来，动物饲料氨基酸在世界氨基酸需求中的比重快速上升，其中饲料级L-亮氨酸的增长速度也十分显著。然而，通过化学合成L-亮氨酸需要严格控制反应条件，且容易对环境造成污染。随着合成生物学方法生产高价值化学品的重大突破和进展，人们对于构建高效生产L-亮氨酸的微生物细胞工厂产生了极大的兴趣。

目前，由于微生物发酵法具有“绿色生产”等优势已取代了传统的化学合成的方法。构建L-亮氨酸生产菌株的策略主要包括促进葡萄糖摄取、消除竞争消耗和增强L-亮氨酸生物合成途径。Vogt等人通过增加前体物的供应和解除关键酶α-异丙基苹果酸合成酶的反馈抑制，发酵72h L-亮氨酸产量达到23.7g/L。此外，每合成1mol的L-亮氨酸需要消耗2mol的NADPH，维持胞内氧化还原平衡是实现L-亮氨酸高效合成必要途径。Wang等人通过将L-亮氨酸生物合成途径中的转氨酶和谷氨酸脱氢酶的辅因子需求从NADPH转换为NADH，L-亮氨酸产量达到23.31g/L。由于L-亮氨酸的生物合成途径冗长且复杂，并与细胞内氧化还原失衡交织在一起，迫切需要一种更有效的方法以构建氧化还原平衡的L-亮氨酸生产菌株。

丙酮酸和乙酰辅酶A是L-亮氨酸合成的直接前体，增强前体物的供应成为限制L-亮氨酸高效生产的另一个重要因素。丙酮酸的分布在L-亮氨酸生物合成和细胞生长之间存在权衡。丙酮酸供应不足可以解释L-亮氨酸发酵产率低的原因。通过阻断或减弱三羧酸循环中的代谢通量，可促进L-亮氨酸的生物合成途径。先前抑制TCA循环的策略主要集中在降低柠檬酸合成酶的活性上。然而，静态地抑制三羧酸循环会导致生物细胞量的过早降低，该策略不是提高L-亮氨酸产率的最佳策略。最近，一种不使用诱导剂的群体感应(QS)电路被应用于多种化学品的高效生产，并动态改变了代谢过程中碳通量的分布。群体感应(QS)系统被认为是一种由细胞密度调节的自动诱导系统。特定的信号小分子在细胞中积累，诱导QS回路的激活，可用于动态调节目标基因的表达。群体感应功能控制细菌中的细胞密度依赖过程，并已应用于诱导重组蛋白表达、控制赖氨酸和平衡多个细胞群体等。然而，关于利用动态调节来增加丙酮酸供应从而增加L-亮氨酸产量的研究并不多见。

大肠杆菌具有清晰的遗传背景和较短的发酵周期等优势，是氨基酸生产中最有潜力的工业化生产底盘。大肠杆菌中，L-亮氨酸是由α-酮异戊酸酯经过四个反应合成，所涉及的leuABCD四个基因构成leu操纵子，且受到亮氨酸介导的转录衰减调控。其中α-异丙基苹果酸合成酶(IPMS)是合成L-亮氨酸的关键限速酶，受到L-亮氨酸的反馈抑制。张成林等通过强化L-亮氨酸的合成途径，引入非氧化糖酵解途径，增强了丙酮酸和乙酰辅酶A库，提高了了L-亮氨酸的发酵水平。科学创新是加快生产力的重要支撑，本发明旨在突破现有L-亮氨酸的产量瓶颈，助力工业化生产。

发明内容

技术问题：

本发明要解决的技术问题是进一步优化L-亮氨酸的合成，提高L-亮氨酸的产量。

技术方案：

为解决上述技术问题，本发明通过基因编辑技术构建了一株能高效合成L-亮氨酸的工程菌株。

本发明的第一个目的是提供一株生产L-亮氨酸的工程菌株，以大肠杆菌为宿主，抑制或降低基因组DNA结合转录激活因子tdcA的表达。

在本发明的一种实施方式中，利用CRISPR/Cas 9实现抑制或降低基因组tdcA的表达。

在本发明的一种实施方法中，所述tdcA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方法中，以大肠杆菌工程菌LEU27为宿主。

在本发明的一种实施方法中，所述大肠杆菌工程菌LEU27为经过系列代谢改造的工程菌株，5L发酵罐发酵产L-亮氨酸产量为55g/L，记载于文献：Hao,Y.,Pan,X.,Li,G.etal.Construction of a plasmid-free L-leucine overproducing Escherichia colistrain through reprogramming of the metabolic flux.Biotechnol Biofuels 16,145(2023).。

本发明的第二个目的是提供一种提高L-亮氨酸产量的方法，所述方法为敲除或大肠杆菌基因组上的DNA结合转录激活因子tdcA。

在本发明的一种实施方法中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌工程菌LEU27。

本发明的第三个目的是提供构建所述工程菌株的方法，所述方法为以大肠杆菌工程菌LEU27为宿主，敲除或敲低基因组上核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA结合转录激活因子tdcA。

本发明的第四个目的是提供一种发酵生产L-亮氨酸的方法，所述方法为利用所述工程菌株发酵生产L-亮氨酸。

在本发明的一种实施方式中，在含有碳源的反应体系中进行L-亮氨酸的发酵生产。

在本发明的一种实施方式中，所述碳源包括葡萄糖、甘油、蔗糖、淀粉或玉米糖浆。

在本发明的一种实施方法中，所述反应体系包括K

或，所述反应体系包括K

本发明还提供了上述大肠杆菌工程菌株或上述方法在L-亮氨酸生产中的应用。

有益效果：

本发明提供了一种通过敲除DNA结合转录激活因子tdcA实现L-亮氨酸产量的提高，构建得到的工程菌株L18能够显著提高L-亮氨酸的产量，5L发酵罐中培养48h后L-亮氨酸产量提高至64g/L。

附图说明

图1 5L发酵罐水平上鉴定工程菌株L18的L-亮氨酸产量。

具体实施方式

下述实施例中涉及的培养基：

种子培养基：K

摇瓶培养基：K

发酵培养基：K

下述实施例中涉及的发酵生产L-亮氨酸的方法：

摇瓶发酵：将工程菌株在斜面上培养，然后转移到摇瓶中30mL的种子培养基中，37℃，200rpm振荡培养。然后，15％(v/v)的种子培养接种物转移到含有摇瓶培养基的摇瓶中。通过氢氧化铵(25％，v/v)控制pH维持在7.0以上。当培养物处于糖耗尽状态时，在无菌条件下间歇性地提供葡萄糖溶液(60％，w/v)。

下述实施例中涉及的L-亮氨酸检测方法：

在发酵过程中，用紫外分光光度计测定细胞密度，检测OD600。葡萄糖浓度测定采用SBA-40C生物传感器。L-亮氨酸含量采用高效液相色谱法测定，流动相为乙腈/水(50:50,v/v)和50mM乙酸钠。本研究中的数据代表三个独立样本的平均值和标准差。本研究中的数据代表了三个独立培养的平均值和标准差。

表1下述实施例中涉及的引物

实施例1大肠杆菌L-亮氨酸代谢途径

代谢途径中单基因转录水平的调控往往不能显著提高目标产物的效价，甚至导致碳氮代谢网络和辅因子网络的失衡。全局调控因子(gTME)可以激活或抑制特定代谢途径中多个基因的协同表达，因此可以根据不同的代谢调节要求表达具有特定功能的转录因子，从而有效增加目标代谢产物的合成。比较转录组学已被应用于分析不同转录水平，是鉴定在目标产物的合成和代谢中起重要作用的蛋白质的有效方法。

通过比较亮氨酸生产菌株LEU27(公开于文献Hao,Y.,Pan,X.,Li,G.etal.Construction of a plasmid-free L-leucine overproducing Escherichia colistrain through reprogramming of the metabolic flux.Biotechnol Biofuels 16,145(2023).)和野生菌株W3110的转录组水平，挖掘差异性基因和转录调控因子。为了鉴定不同条件下基因表达水平，在5L发酵罐水平培养L-亮氨酸大肠杆菌野生菌株W3110(样本命名为LE01)和菌株LEU27(样本命名为LE02)，并取样测定转录组。进行5L发酵罐测试，在5L生物反应器上进行补料分批发酵，发酵时间为48h采样，并测转录组。

LE01和LE02样品的比较转录组分析显示，挑选个与大肠杆菌代谢相关的差异较明显一系列基因tdcA、yidF、ygeK，将其进行过表达或敲除。

以DNA结合转录激活因子tdcA为例，使用CRISPR/Cas9基因编辑方法在大肠杆菌中进行基因缺失和整合。将引物(gRNA-tdcA-S和gRNA-tdcA-A)退火形成dsDNA，该dsDNA包括一个20bp的互补序列和一个与pGRB质粒(Plasmid#71539)主干同源的序列。然后，通过dsDNA与线性化载体的同源重组构建pGRB-tdcA质粒。用上游同源臂(引物UP-tdcA-S和UP-tdcA-A)和下游同源臂(DN-tdcA-S和DN-tdcA-A)扩增得到总DNA-tdcA片段。将DNA-tdcA和pGRB序列转染到含有pRED-Cas9(Plasmid#71541)的细胞中。

经电转化后，转化后的细胞在添加壮观霉素和氨苄的LB琼脂板上30℃培养。将菌悬液在LB培养基上30℃培养16-18h，用菌落PCR验证阳性单菌落。为了丢失表达目标gRNA的质粒，将阳性单菌落在含0.2％l-阿拉伯糖的LB中培养14h。将菌液在42℃摇培养箱中进一步培养10h，使pRED-Cas9质粒丢失。最后，利用染色体整合技术将带有目标基因的供体DNA片段整合到宿主基因组中，获得工程菌L18。这些相同的程序被用于所有其他菌株的构建。

将构建的系列菌株进行24h摇瓶发酵测试，结果显示，敲除基因tdcA的工程菌株L18的L-亮氨酸产量明显提高，达到14.2g/L，相比出发菌株LEU27提高了8.8％。而整合其余转录因子yidF或ygeK对L-亮氨酸的提高无影响。

实施例2微溶氧条件下5L发酵罐中的补料分批发酵

将实施例1构建的工程菌株L18接种于含2L种子培养基的生物反应器中培养。当菌种培养液在600nm处的吸光度(OD600)达到11-15时，以15％(v/v)的接种量转移到含有发酵培养基的5L的生物反应器中，温度设置为37℃。发酵过程中，通过控制曝气速率和搅拌速度，将溶解氧含量控制在20％。通过氢氧化铵(25％，v/v)的自动加料，将pH控制在6.5。待培养基中的糖耗尽后，自动加入葡萄糖(80％，w/v)，使其最终浓度不高于3g/L。

结果显示，发酵48h后，5L发酵罐产量可达64g/L(图1)，明显高于LEU27(55g/L)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。