鞘氨醇杆菌HY-100C及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及鞘氨醇杆菌HY-100C及其应用。

背景技术

邻二氯苯是氯苯类化合物中较为典型的一种，是一类持久性疏水有机污染物。这类污染物来源广泛，主要来自于医药、化工、电子等行业，常作为化工原料以及化学中间体。

邻二氯苯物理化学性质稳定，普遍存在于大气、水、土壤中难以降解，其具有的生物累积性和持久性，会对生态造成潜在危害。该类物质具有刺激性芳香气味，可由皮肤接触、呼吸、食入等途径进入人体。短期内大剂量摄入会抑制中枢神经系统，并对眼、呼吸道等造成刺激性作用；若误服则会引起腹痛、呕吐等急性中毒症状。长期处于邻二氯苯浓度较高的环境中，则会损害肝肾等器官。邻二氯苯已被美国环保局(EPA)列为优先控制污染物和有毒污染物，它也被我国列入中国环境优先污染物黑名单中。但是，传统处理技术存在成本高、处理不完全、易产生二次污染等问题，目前仍缺乏针对邻二氯苯的高效降解技术。生物法是经济高效、绿色安全的VOCs治理技术，获得具备邻二氯苯降解能力的降解菌株是实现邻二氯苯高效生物降解的关键。

此前已有研究者利用鞘氨醇杆菌来处理VOCs，如厦门大学袁军曾利用鞘氨醇杆菌在三角瓶中处理多环芳烃达到了90％的去除率，这说明利用鞘氨醇杆菌来处理VOCs是可行的。但未曾发现国内外有报道称筛选出鞘氨醇杆菌以邻二氯苯为唯一碳源来实现邻二氯苯的高效降解。如果能筛选得到以邻二氯苯为唯一碳源的鞘氨醇杆菌来实现邻二氯苯的高效降解，既能很好的解决邻二氯苯的生物降解问题，也能为鞘氨醇杆菌高效处理VOCs增添又一新的实例。

本发明从环境中筛选到一株以邻二氯苯为唯一碳源的高效降解菌株，为处理含该类污染物的生物净化工程提供了有力支持。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供鞘氨醇杆菌HY-100C及其应用的技术方案。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明第一方面提供了鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)HY-100C，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年09月20日，保藏编号：CCTCC No:M20221449，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

本发明第二方面提供了上述鞘氨醇杆菌HY-100C在降解有机污染物中的应用。

进一步，所述有机污染物为邻二氯苯、氯苯、甲苯或乙苯。

本发明第三方面提供了利用上述的鞘氨醇杆菌降解有机污染物的方法，其包括以下步骤：

1)将鞘氨醇杆菌HY-100C经扩大培养获得的菌液作为酶源；

2)以有机污染物为底物，于无机盐培养基中，在pH3～10、20℃～40℃条件下进行降解反应，实现对有机污染物的降解。

进一步，所述步骤1)具体包括：

a斜面培养：将鞘氨醇杆菌HY-100C接种于斜面LB固体培养基，30℃培养24～36h，获得斜面菌体；

b扩大培养：用接种环挑取步骤1)获得的斜面菌体接种至LB液体培养基中，30℃，培养24～36h，获得OD

进一步，所述步骤1)中酶源用量以无机盐培养基中OD

进一步，所述步骤2)中有机污染物为邻二氯苯、氯苯、甲苯或乙苯。

进一步，所述步骤2)中无机盐培养基终浓度组成为：Na

所述的微量元素母液浓度组成：FeSO

进一步，所述斜面LB固体培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，琼脂18～20g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

进一步，所述LB液体培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

本发明提供了一株有机污染物特别是邻二氯苯的高效降解菌——鞘氨醇杆菌HY-100C，该菌为革兰氏阳性细菌，能以邻二氯苯等有机污染物为唯一碳源和能源生长繁殖并高效降解该底物，在初始菌量(以OD

附图说明

图1为鞘氨醇杆菌HY-100C的透射电镜照片；

图2为系统发育树；

图3为鞘氨醇杆菌HY-100C的菌体生长、邻二氯苯降解曲线图；

图4为不同pH值培养液对鞘氨醇杆菌HY-100C的邻二氯苯降解(A)、生长(B)、矿化(C)的影响柱形图；

图5为不同温度对鞘氨醇杆菌HY-100C的邻二氯苯降解(A)、矿化(B)的影响柱形图；

图6为鞘氨醇杆菌HY-100C对不同初始浓度邻二氯苯的降解曲线图；

图7为鞘氨醇杆菌HY-100C在不同初始邻二氯苯浓度下的生长曲线；

图8为模拟生物滴滤塔处理邻二氯苯废气进出口浓度及去除率；

图9为模拟生物滴滤塔处理混合废气进出口浓度及去除率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例中所用无机盐培养基组成为：Na

所述LB固体培养基组成为：NaCl 10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，琼脂18～20g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

所述LB液体培养基组成为：NaCl 10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

所述室温是指25-30℃。

实施例1：鞘氨醇杆菌HY-100C的分离、纯化与鉴定

(1)鞘氨醇杆菌HY-100C的分离及纯化

现场采集浙江某石化企业污水处理池的活性污泥，取静置后的下层污泥与无机盐培养基按1:2(v/v)混合，接入3L混合液至5L污泥驯化罐(结构参见金小君.二噁烷降解新菌株的分离鉴定、降解特性及菌剂制备研究[D].浙江工业大学,2012.)，每天加入500mg/L底物邻二氯苯作为唯一碳源和能源，室温下驯化培养，将近20天后，从驯化罐取5mL污泥加入装有50mL无机盐的摇瓶中，发现驯化的污泥在摇瓶中每天可稳定降解100mg/L邻二氯苯，降解率可达80-90％(摇瓶实验条件：30℃、160r/min)，获得驯化样品。

将摇瓶中的污泥样品分别取1、2mL转接入其他摇瓶进一步测试性能，发现转接后的污泥在摇瓶中每天可稳定降解100mg/L邻二氯苯，将此污泥样继续转接富集6代(每次转接1mL)，然后将富集6代后的污泥按10

(2)菌株HY-100C的鉴定

菌株HY-100C的形态特征(如图1所示)：菌体呈短杆状，大小为(0.61～0.68)μm×(0.93～1.19)μm，无芽孢，四周有菌毛；菌落呈圆形、前期呈乳白色后期逐渐转为浅黄色、不透明、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长。

菌株HY-100C的生理生化特征为：好氧，革兰氏染色为阴性。

PCR扩增及测序工作由生工生物工程(上海)有限公司完成。所述鞘氨醇杆菌HY-100C的16s rDNA的Genebank登录号为OP389123，菌株的16S rDNA序列(SEQ ID NO.1)如下：

通过将菌株HY-100C的16S rDNA序列上传到Ezbiocloud.net网站，与网站上的标准菌株进行比对，并用MEGA5.05软件，采用Neighbor-Joining法构建细菌发育进化树，并用Bootstrap法(重复1000次)进行评估，构建的系统发育树如图2，从而确定该菌株HY-100C为Sphingobacterium，命名为鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)HY-100C，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年09月20日，保藏编号CCTCC No：M 20221449，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

实施例2：鞘氨醇杆菌HY-100C的种子液制备

1)斜面培养：将鞘氨醇杆菌HY-100C接种于斜面LB固体培养基，30℃培养18～36h，获得斜面菌体。

2)种子培养：用接种环挑取步骤1)获得的斜面菌体接种至LB液体培养基中，30℃培养24～36h，获得OD

实施例3：鞘氨醇杆菌HY-100C降解邻二氯苯的性能

以邻二氯苯作为鞘氨醇杆菌HY-100C的唯一碳源，取实施例2方法制备的OD

实施例4：无机盐培养基初始pH值对鞘氨醇杆菌HY-100C降解邻二氯苯的影响

用1mol/L NaOH水溶液或1mol/L H

实施例5：温度对鞘氨醇杆菌HY-100C降解邻二氯苯的影响

在初始邻二氯苯浓度为100mg/L的无机盐培养基中，接入实施例2方法制备的菌液，使各平行样中的初始菌体浓度以OD

实施例6：底物浓度对鞘氨醇杆菌HY-100C降解邻二氯苯的影响

在适宜的培养条件(pH＝7，t＝30℃)下，研究鞘氨醇杆菌HY-100C菌株对不同浓度邻二氯苯的降解。在新鲜无机盐培养基中加入不同浓度的底物邻二氯苯，使底物初始浓度分别为25、50、100、200、300、500、600mg/L，分别接种实施例2方法制备的菌液，使各平行样中的初始菌体浓度以OD

实施例7：鞘氨醇杆菌HY-100C对不同碳源底物的降解能力

接种实施例2方法制备的鞘氨醇杆菌HY-100C菌液至除邻二氯苯之外的其他底物(加入浓度见表1)，使初始菌体浓度以OD

表1:HY-100C对不同碳源的降解能力

实施例8：模拟生物滴滤塔处理邻二氯苯废气进出口浓度及去除率

将实施例2方法培养制备的OD

经过20天的挂膜启动后，邻二氯苯去除率达86％以上，结果如图8所示。第21天，开始加入混合废气(混合废气成分为100mg/m