一种直投式发酵剂的制备方法及其在臭鳜鱼发酵中的应用

技术领域

本发明涉及一种直投式发酵剂的制备方法及其在臭鳜鱼发酵中的应用，属于发酵食品加工技术领域。

背景技术

鳜鱼，在鱼类分类学上属鲈形科，是我国“四大淡水名鱼”之一，其肉质细嫩，刺少，富含蛋白质、脂肪酸、氨基酸等多种营养物质，是名贵的淡水鱼类。臭鳜鱼，又称作“腌鲜鱼”、“桶鲜鱼”，是中国徽式风味代表菜品之一，具有“轻度腐败，重盐好色”的特点。新鲜鳜鱼经过短期的盐腌发酵，在微生物和内源酶的作用下，发生蛋白质水解及脂肪分解等多种复杂的生理生化反应，其风味发生巨大变化，发酵成熟的臭鳜鱼，具有闻起来臭，吃起来香的特点，广受消费者的青睐。

其中，吲哚被认为是构成臭鳜鱼风味的重要物质，吲哚是一种吡咯与苯并联的化合物，广泛存在于自然界，在低浓度时呈现丁香水仙花香味，高浓度时呈现特殊的臭味。有研究学者对不同来源的臭鳜鱼样品进行风味物质的分析，发现吲哚是所有臭鳜鱼样品中共有的挥发性风味物质且具有较高的含量，为臭鳜鱼提供臭味等特殊风味。如柯泽华等人研究六种品牌臭鳜鱼发现吲哚含量在70-490ng/100g之间；梁好钻等则发现发酵成熟的臭鳜鱼其吲哚含量在总挥发性化合物中的占比达到了25％；沈莹颖等则指出吲哚是发酵成熟的臭鳜鱼腥臭味的物质来源，在传统发酵的臭鳜鱼中吲哚的含量达到了1167ng/100g。吴燕燕、柯泽华等研究者对臭鳜鱼中具有重要贡献的风味物质进行研究，发现吲哚具有较高的OAV值，是臭鳜鱼特殊臭味的主要贡献者。提高发酵臭鳜鱼中的吲哚等物质的含量，能够显著增强臭鳜鱼特殊风味，改善其食用品质。

添加微生物发酵剂进行人工发酵，是一种改善食品的风味的有效手段，在臭鳜鱼的制备中，利用微生物发酵剂进行人工发酵也得到了广泛的应用。如公开号为CN116042435A的专利申请公开了一种清酒乳杆菌亚种(保藏编号为CCTCC M 2022621)及其应用，该菌株具有较好的耐盐性、耐低温性，并具有显著的抗氧化和抑菌作用；能很好地应用于臭鳜鱼的低温发酵中，改善了臭鳜鱼的感官评价，还有效降低臭鳜鱼发酵过程中亚硝酸盐、硫代巴比妥酸反应物和组胺的生成。又如公开号为CN109402010A的专利申请公开了一株乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)M10和一株食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)M3，并利用上述乳酸乳球菌M10和食窦魏斯氏菌M3混合接种快速发酵臭鳜鱼。然而，目前在于臭鳜鱼的人工发酵技术中，臭鳜鱼中关重要风味物质-吲哚的含量并未得到显著的提升。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种直投式发酵剂的制备方法及其在臭鳜鱼发酵中的应用，目的在于解决目前在于臭鳜鱼的人工发酵技术中，臭鳜鱼中关重要风味物质-吲哚的含量并未得到显著地提升的技术问题。

本发明提供的第一个技术方案为一种直投式发酵剂的制备方法，所述方法为将耐盐芽孢杆菌SJ1-6和肉葡萄球菌F2，分别进行培养，离心收集菌体，以及再用生理盐水对菌体重悬制备耐盐芽孢杆菌菌液和肉葡萄球菌菌液，将所述耐盐芽孢杆菌菌液和所述肉葡萄球菌菌液混合获得直投式发酵剂；所述耐盐芽孢杆菌SJ1-6保藏号为CGMCC No.28187，于2023年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述肉葡萄球菌F2保藏号为CGMCC No.28186，于2023年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3中国科学院微生物研究所。本发明涉及的耐盐芽孢杆菌SJ1-6和肉葡萄球菌F2均分离自发酵臭鳜鱼食品中。

在某些实施方式中，所述耐盐芽孢杆菌菌液和所述肉葡萄球菌菌液的活菌数量比例为1:(0.5～10)。

在某些实施方式中，直投式发酵剂的耐盐芽孢杆菌SJ1-6的活菌数为1～5×10

在某些实施方式中，培养所述耐盐芽孢杆菌SJ1-6的培养基为LB肉汤培养基，在LB肉汤培养基中接种耐盐芽孢杆菌SJ1-6后置于37℃培养箱中培养12～20h；培养所述肉葡萄球菌F2的培养基为LB肉汤培养基，在LB肉汤培养基中接种肉葡萄球菌F2后置于37℃培养箱中培养12～20h。

本发明提供的第二个技术方案为利用第一个技术方案所述的方法制备的直投式发酵剂。

本发明提供的第三个技术方案为一种利用第二个技术方案所述的直投式发酵剂发酵臭鳜鱼的方法，包括以下步骤：

S1、预处理：鳜鱼去内脏、鱼鳞和鱼鳃；

S2、发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的水，加入调味料、第二个技术方案所述的一种直投式发酵剂，得发酵液；

S3、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于步骤S2所得发酵液中发酵，得臭鳜鱼。

在某些实施方式中，所述调味料含有盐、大葱、姜、八角、茴香、孜然、辣椒和花椒。

在某些实施方式中，所述发酵液中，耐盐芽孢杆菌SJ1-6和肉葡萄球菌F2的总活菌数为1～5×10

在某些实施方式中，步骤S3中，发酵的温度为10～15℃，发酵的时间为5～9天。

本发明提供的第四个技术方案为一种提升臭鳜鱼发酵生产中吲哚风味物质含量的方法，所述方法是利用第二个技术方案所述的直投式发酵剂对鳜鱼进行发酵，增强臭鳜鱼发酵过程中特征风味物质吲哚的含量。其中吲哚含量提高了2.0～283.91倍。

本发明的直投式发酵剂，应用于臭鳜鱼产品的发酵过程中，显著增加吲哚、等物质的含量，吲哚在高浓度时呈现发酵腐味，在低浓度时呈现花香味，是臭鳜鱼中重要的呈味物质。

本发明提供的第五个技术方案为一种抑制发酵臭鳜鱼中包含假单胞菌、肠杆菌的腐败菌生长繁殖的方法，所述方法是利用第二个技术方案所述的直投式发酵剂进行发酵，抑制臭鳜鱼发酵过程中腐败菌的生长繁殖，达到降低腐败菌数量提高食用安全性的目的。其中每克发酵鱼肉中假单胞菌、肠杆菌的含量明显降低。

本发明具有以下有益效果：本发明利用耐盐芽孢杆菌SJ1-6和肉葡萄球菌F2两株微生物，制备成直投式发酵剂，用于臭鳜鱼发酵中。本发明的直投式发酵剂使用简便，与自然发酵7～16天相比，在缩短发酵周期的同时能够明显将臭鳜鱼产品中特殊风味物质—吲哚含量提高2.0～283.91倍，从而达到增强臭鳜鱼特殊风味的目的，此外，该发酵剂的添加可以同时起到降低臭鳜鱼中假单胞菌、肠杆菌的数量与占比，提高食用安全性的作用。

生物材料保藏

耐盐芽孢杆菌SJ1-6，分类学命名为耐盐芽孢杆菌Bacillus halotolerans，保藏编号为CGMCC No.28187，于2023年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3中国科学院微生物研究所。

肉葡萄球菌F2，分类学命名为肉葡萄球菌Staphylococcus camosus，保藏编号为CGMCC No.28186，于2023年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为耐盐芽孢杆菌SJ1-6的LB培养物照片；

图2为耐盐芽孢杆菌SJ1-6的微生物学镜检照片；

图3为肉葡萄球菌F2的LB培养物照片；

图4为肉葡萄球菌F2的微生物学镜检照片；

图5为耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌F2对7种病原微生物的抑制效果。

具体实施方式

以下实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，有助于了解本发明，但本发明的实施方案不受所述实施例的限制，本发明的保护范围有权利要求来决定。

实施例1耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌F2的分离鉴定、生物活性测定、益生性评价

1、耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌F2的分离与筛选

(1)样品：采集自大连国家海洋食品研究中心生物实验室购买的市售发酵臭鳜鱼。

(2)分离筛选方法采用富集-筛选培养法，具体如下：

取市售发酵臭鳜鱼1g，加入到10mL生理盐水中，移入均质袋，拍打30min，500g离心5min去除鱼渣，无菌条件下移取含菌的浑浊液体部分至50mL离心管中。将培养液适当稀释后涂布在LB固体培养基上，待液体吸收干净后，37℃倒置培养24-48h。之后挑取单菌落，划线至LB固体培养基，分离单菌落。连续纯化三代，挑取单菌落进行镜检，确定未污染后，接入LB液体培养基中扩大培养，取部分培养好的菌株冻存保藏，另一部分培养液用于吲哚实验。

(3)吲哚实验法初筛产吲哚菌株，具体如下：

取上述10mL培养液中加入乙醚1-2mL，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5-10滴吲哚试剂(加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察)，如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。选取颜色较深的前十株菌株，置于LB液体培养液中培养，取培养液采用超高效液相色谱-质谱联用法对其进行产吲哚定量测定。

(4)超高效液相色谱-质谱联用法复筛产吲哚菌株，具体如下：

样品预处理：分别量取上述菌株培养液1mL于50ml离心管中，然后加入10mL乙腈，以最大转速涡旋震荡10min，静置半小时后，放入离心机以4000rpm/min离心10min，取上清液过0.22μm有机滤膜，所得试液加入进样小瓶供超高效液相色谱质谱联用仪分析。

色谱条件：色谱柱：WATERS ACQUITY C18(100×2.1mm，1.8μm)；进样量：10μL；柱温：25℃，流动相梯度洗脱程序为0-22min，流动相A为10％的0.1％甲酸水溶液，流动相B为90％的乙腈；22-24min，流动相A为90％的0.1％甲酸水溶液，流动相B为10％的乙腈；24-25min，流动相A为90％的0.1％甲酸水溶液，流动相B为10％的乙腈。

质谱条件：电离模式：APCI正模式；扫描方式：多反应监测(SRM)；放电电流(+)：5μA；离子传输管温度：350℃；蒸发温度：400℃；辅助气10arb；鞘层气体40arb；母离子的(m/z)为118.112、子离子的(m/z)为91.248，碰撞能为32.3V；母离子的(m/z)为118.112、子离子的(m/z)为114.222，碰撞能为55V，透镜电压为64.89V。

选取吲哚产量最高的两株菌，分别命名为为SJ1-6和F2，进行后续鉴定。

2、菌株的鉴定：提取菌株SJ1-6和F2的基因组进行16s rDNA鉴定，基因组提取方法按照《精编分子生物学实验指南》玻璃珠法进行提取。

PCR条件如下：扩增体系为：2×Taq Master Mix 25μL、引物27F,2μL、引物1492R,2μL、灭菌水19μL、模板2μL。PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15S；55℃退火15S；72℃延伸1min；72℃5min；30个循环；4℃无穷。PCR结束后进行琼脂糖凝胶(1.0％)电泳检测酵母菌样品PCR产物，跑出条带且条带明亮的为PCR扩增成功的基因组，成功的基因组即可送测序。

所述菌株SJ1-6的16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

将上述测序结果进行Blastn分析，发现该菌与Bacillus halotolerans的同源性最高，达到99％。因此该菌株鉴定为Bacillus halotolerans，命名为耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)SJ1-6。所述耐盐芽孢杆菌SJ1-6在LB固体平板中生长良好。菌株SJ1-6在LB固体平板上生长良好，37℃培养24-48h，如图1所示，形成圆形、稍扁平、边缘齐整、乳白色菌落；如图2所示，镜检发现菌体呈杆状，长大于宽。

经形态学和16s rDNA鉴定，该菌株SJ1-6暂定为耐盐芽孢杆菌(Bacillushalotolerans)并已于2023年8月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.28187。保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

所述菌株F2的16s rDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

将上述测序结果进行Blastn分析，发现该菌与Staphylococcus camosus的同源性最高，达到98％。因此该菌株鉴定为Staphylococcus camosus，命名为肉葡萄球菌(Staphylococcus camosus)F2。所述耐盐芽孢杆菌F2在LB固体平板中生长良好。菌株F2在LB固体平板上生长良好，37℃培养24-48h，如图3所示，形成圆形、稍扁平、边缘齐整、乳白色菌落；如图4所示，镜检发现菌体呈小球状。

经形态学和16s rDNA鉴定，该菌株F2暂定为肉葡萄球菌(Staphylococcuscamosus)并已于2023年8月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.28186。保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

3、耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌菌F2的氨肽酶、羧肽酶活性测定：

从-80℃冰箱取出耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌菌F2菌株的保藏甘油管，接取含菌冰渣一环至含10mL LB培养基中，于200-250rpm、37℃振荡培养24h；然后以1％(v/v)接种量转接至含50mL LB培养基的250mL三角瓶中，继续以200-250rpm、37℃振荡培养48h。然后8000rpm离心10min后收集培养基上清，进行氨肽酶、羧肽酶活性分析。

参考文献(中国酿造,2017,36(2):99-101；中国酿造,2010,216(3):30-33)所述方法，进行耐盐芽孢杆菌SJ1-6的氨肽酶、羧肽酶活性测定，结果显示，摇瓶水平下，37℃，200rpm条件下培养48h的耐盐芽孢杆菌SJ1-6培养液上清，以Leu-pNA(L-亮氨酸-4-硝基苯胺)为底物时酶活为850U/mL；以Cbz-Glu-Tyr(N-苄氧羰酰基-L-谷氨酰-L酪氨酸)为底物时酶活为270U/mL。说明耐盐芽孢杆菌SJ1-6同时具有氨肽酶和羧肽酶活性。

参考文献(中国酿造,2017,36(2):99-101；中国酿造,2010,216(3):30-33)所述方法，进行肉葡萄球菌菌F2的氨肽酶、羧肽酶活性测定，结果显示，摇瓶水平下，37℃，200rpm条件下培养48h的肉葡萄球菌菌F2培养液上清，以Leu-pNA(L-亮氨酸-4-硝基苯胺)为底物时酶活为880U/mL；以Cbz-Glu-Tyr(N-苄氧羰酰基-L-谷氨酰-L酪氨酸)为底物时酶活为250U/mL。说明肉葡萄球菌菌F2同时具有氨肽酶和羧肽酶活性。

4、耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌菌F2的菌株耐酸性检测：

将活菌数量为3×10

将活菌数量为5×10

5、耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌菌F2的胆盐耐受性试验：

耐酸试验(pH3.0)中，耐盐芽孢杆菌SJ1-6在2h后通过胃到达肠道，活菌数降至3×10

耐酸试验(pH3.0)中，肉葡萄球菌菌F2在2h后通过胃到达肠道，活菌数降至5×10

6、耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌菌F2的抗氧化实验

DPPH自由基清除率试验：0.2mmol/L DPPH：0.0078g DPPH，用无水乙醇溶解，定容至100mL，避光放置，现配现用。将10

DPPH自由基清除率试验：0.2mmol/L DPPH：0.0078g DPPH，用无水乙醇溶解，定容至100mL，避光放置，现配现用。将10

结果显示，耐盐芽孢杆菌SJ1-6的DPPH清除活性为88.71％，ABTS清除活性为91.87％，说明耐盐芽孢杆菌SJ1-6具有很好的抗氧化活性，肉葡萄球菌菌F2的DPPH清除活性为85.77％，ABTS清除活性为90.87％，说明肉葡萄球菌菌F2具有很好的抗氧化活性。

DPPH自由基清除率的计算：

Ai为1mL待测菌液加1mL DPPH乙醇溶液的吸光值；

Aj为1mL待测菌液加1mL无水乙醇的吸光值；

Ac为1mL PBS加1mL DPPH乙醇溶液的吸光值。

ABTS自由基清除率试验：将ABTS(14mM)和过硫酸钾(5mM)溶解在0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中，以1:1的比例混合，并在25℃下反应12–16h，获得ABTS工作液。将100μL菌株DL-GBS01(108CFU/mL)添加到900μL ABTS工作液中，并在25℃下黑暗中培养15min。离心(14000g，1分钟)后，在734nm处测量上清液的吸光度。

ABTS自由基清除率的计算：

As为100μL待测菌液加900μL ABTS工作液的吸光值；

7、耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌F2的抑菌性实验

以致病大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)、沙门氏菌(Salmonellaenterica subsp.enterica serovar Typhi CMCC(B)50071)、志贺氏菌(Shigellaflexneri CMCC(B)51572)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 25923)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes ATCC 19115)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis ATCC 29212)等7种有害菌为指示菌，通过牛津杯法分析耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌F2培养上清的抑菌活性(牛津杯法参考文献：Khan M N,Lin H,Li M,et al.Identification and growthoptimization of a Marine Bacillus DK1-SA11 having potential of producingbroad spectrum antimicrobial compounds.Pakistan Journal of PharmaceuticalSciences,2017,30(3):839-853.)。37℃温育24h，牛津杯周围出现透明圈，分别测定抑制菌圈直径，汇总分析。如图5所示，耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌F2所产的抗菌物质对这7株指标菌都具有很好的抑菌活性，尤其是单增李斯特菌和粪肠球菌。

实施例2耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌菌F2的安全性测定

(1)耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌菌F2的抗生素敏感性实验：

使用纸片扩散法对耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌菌F2的抗生素敏感性谱进行了表征。将活化好的耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌菌F2制成1×10

(2)耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌菌F2的溶血实验

培养基配置：哥伦比亚琼脂，5％脱纤维羊血。

取耐盐芽孢杆菌SJ1-6(约1×10

取肉葡萄球菌菌F2(约1×10

结果发现，金黄色葡萄球菌ATCC 25923阳性对照组菌株周围出现宽大(6-8mm)、界限分明、完全透明的溶血环，为典型的β溶血。而本发明提供的耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌F2落周围无溶血，菌株安全性好。

实施例3：耐盐芽孢杆菌SJ1-6与肉葡萄球菌F2按照比例2：1混合在臭鳜鱼中的应用，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等，

S2：直投式发酵剂制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的耐盐芽孢杆菌SJ1-6，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

挑取保存于-80℃的肉葡萄球菌F2，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

将耐盐芽孢杆菌SJ1-6的菌液与肉葡萄球菌F2的菌液按照活菌数量比例1:0.5混合，制备获得直投式发酵剂。

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，以及加入直投式发酵剂，得到发酵液，其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃下发酵5天，产品命名为实施例3。

实施例4：耐盐芽孢杆菌与肉葡萄球菌按照比例1：1混合在臭鳜鱼中的应用，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等，

S2：直投式发酵剂的制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的耐盐芽孢杆菌SJ1-6，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010 F2.7中使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

挑取保存于-80℃的肉葡萄球菌F2，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010F2.7中使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

将耐盐芽孢杆菌SJ1-6的菌液与肉葡萄球菌F2的菌液按照活菌数量比例1:1混合，制备获得直投式发酵剂。

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，以及加入直投式发酵剂获得发酵液；其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃下发酵5天，产品命名为实施例4。

实施例5：耐盐芽孢杆菌与肉葡萄球菌按照比例1：10混合在臭鳜鱼中的应用，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等，

S2：直投式发酵剂的制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的耐盐芽孢杆菌SJ1-6，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010 F2.7中使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

挑取保存于-80℃的肉葡萄球菌F2，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010 F2.7中使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

将耐盐芽孢杆菌SJ1-6的菌液与肉葡萄球菌F2的菌液按照活菌数量比例1:10混合，制备获得直投式发酵剂。

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，以及加入直投式发酵剂获得发酵液；其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃下发酵5天，产品命名为实施例5。

对比例1：自然发酵

臭鳜鱼制作：

S1、新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃，

S2、制备发酵液：称取与步骤S1所得鳜鱼等质量的饮用水，以饮用水的质量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒。

S3、发酵：将S1所得鳜鱼浸入S2所得发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃条件下发酵5天，所得产品命名为对比例1。

对比例2：添加耐盐芽孢杆菌SJ1-6单菌发酵

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等；

S2：菌液(发酵剂)制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的耐盐芽孢杆菌SJ1-6，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010 F2.7中使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，耐盐芽孢杆菌SJ1-6菌液(发酵剂)；其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃下发酵5天，产品命名为对比例2。

对比例3：添加肉葡萄球菌F2单菌发酵，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等；

S2：菌液(发酵剂)制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的肉葡萄球菌CGMCCNo.28186，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010 F2.7中使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，以及加入肉葡萄球菌F2菌液(发酵剂)；其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃下发酵5天，产品命名为对比例3。

对比例4：添加清酒乳杆菌CICC 22728单菌发酵，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等；

S2：菌液(发酵剂)制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的清酒乳杆菌CICC 22728，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010 F2.7中使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，以及加入清酒乳杆菌CICC 22728菌液(发酵剂)；其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃下发酵5天，产品命名为对比例4。

对比例5：添加木糖葡萄球菌CICC 22943单菌发酵，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等；

S2：菌液(发酵剂)制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的木糖葡萄球菌CICC22943，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010 F2.7中使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，木糖葡萄球菌CICC 22943菌液(发酵剂)；其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃下发酵5天，产品命名为对比例5。

对比例6：添加发酵剂干酪乳杆菌CICC 6104，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等，

S2：菌液(发酵剂)制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的干酪乳杆菌CICC 6104，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010 F2.7中使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，以及加入干酪乳杆菌CICC 6104菌液(发酵剂)；其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃下发酵5天，产品命名为对比例6。

对比例7：添加副干酪乳杆菌CGMCC 1.9089单菌发酵，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等，

S2：菌液(发酵剂)制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的副干酪乳杆菌CGMCC1.9089，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010 F2.7中使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，以及加入副干酪乳杆菌CGMCC 1.9089菌液(发酵剂)；其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃下发酵5天，产品命名为对比例7。

对比例8：添加毕赤酵母CICC 1960单菌发酵，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等，

S2：菌液(发酵剂)制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的毕赤酵母CICC 1960，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010 F2.7中使用YPD固体培养基30℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入YPD肉汤培养基中，在30℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至YPD肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，以及加入毕赤酵母CICC 1960菌液(发酵剂)；其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃下发酵5天，产品命名为对比例8。

对比例9：添加发酵剂格氏乳球菌CICC 21038，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等，

S2：菌液(发酵剂)制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的格氏乳球菌CICC 21038，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010 F2.7中使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，以及加入格氏乳球菌CICC 21038菌液(发酵剂)；其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃下发酵5天，产品命名为对比例9。

对比例10：添加复合发酵剂乳酸芽孢杆菌CICC 20133，植物乳杆菌CICC 22213，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等，

S2：菌液(发酵剂)制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的乳酸芽孢杆菌CICC20133，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入营养肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

挑取保存于-80℃的肉葡萄球菌F2，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用MRS固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入MRS肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，以及加入乳酸芽孢杆菌CICC 20133与植物乳杆菌CICC 22213菌液(发酵剂)；其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃下发酵5天，产品命名为对比例10。

对比例11：添加复合发酵剂戊糖片球菌CICC 22227，肉葡萄球菌CGMCC No.28186，清酒乳杆菌CICC 22728，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等，

S2：菌液(发酵剂)制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的戊糖片球菌CICC 22227，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用MRS固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入营养肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至MRS肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

挑取保存于-80℃的肉葡萄球菌CGMCC NO28186，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

挑取保存于-80℃的清酒乳杆菌CICC 22728，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用MRS固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入营养肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至MRS肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，戊糖片球菌CICC 22227，以及加入肉葡萄球菌F2和清酒乳杆菌CICC 22728菌液(发酵剂)；其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃下发酵5天，产品命名为对比例11。

对比例12：添加复合发酵剂食窦魏斯氏菌CGMCC 16611和乳酸乳球菌CGMCC16612，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等；

S2：菌液(发酵剂)制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的食窦魏斯氏菌CGMCC16611，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用MRS固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入营养肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至MRS肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

挑取保存于-80℃的乳酸乳球菌CGMCC 16612，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用MRS固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入MRS肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，以及加入食窦魏斯氏菌CGMCC 16611与乳酸乳球菌CGMCC 16612菌液(发酵剂)；其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃下发酵5天，产品命名为对比例12。

对比例13：添加复合发酵剂清酒乳杆菌CICC 22728和腐生葡萄球菌CICC 24371，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等；

S2：菌液(发酵剂)制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的清酒乳杆菌CICC 22728，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用MRS固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入营养肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至MRS肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

挑取保存于-80℃的腐生葡萄球菌CICC 24371，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，以及加入清酒乳杆菌CICC 22728与腐生葡萄球菌CICC 24371菌液(发酵剂)；其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃下发酵5天，产品命名为对比例13。

对比例14：添加干酪乳杆菌CICC 6104单菌发酵，具体方法如下：

S1、新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等，

S2、菌液制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的干酪乳杆菌CICC 6104，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用MRS固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入营养肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至MRS肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3、发酵：

取鲜鳜鱼肉50g，用1％食盐腌制，待盐渗入肉中后，将优选菌株菌液调整浓度为1×10

对比例15：添加副干酪乳杆菌CGMCC 1.9089单菌发酵，具体方法如下：

S1、新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等，

S2、菌液制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的毕赤酵母CICC 1960，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用MRS固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入营养肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至MRS肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3、发酵：

取鲜鳜鱼肉50g，用1％食盐腌制，待盐渗入肉中后，将优选菌株菌液调整浓度为1×10

对比例16：添加毕赤酵母CICC 1960单菌发酵，具体方法如下：

S1、新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等，

S2、菌液制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的毕赤酵母CICC 1960，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用MRS固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入营养肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至MRS肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3、发酵：

取鲜鳜鱼肉50g，用1％食盐腌制，待盐渗入肉中后，将优选菌株菌液调整浓度为1×10

对比例17：添加发酵剂戊糖片球菌CICC 22227，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等，

S2：菌液(发酵剂)制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的戊糖片球菌CICC 22227，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010 F2.7中使用MRS固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入MRS肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至MRS肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，以及加入格氏乳球菌CICC 21038菌液(发酵剂)；其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃下发酵5天，产品命名为对比例17。

对比例18：添加腐生葡萄球菌CICC 24371单菌发酵，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等，

S2：菌液(发酵剂)制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的腐生葡萄球菌CICC24371，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010 F2.7中使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，以及加入腐生葡萄球菌CICC 24371菌液(发酵剂)；其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在12℃下发酵5天，产品命名为对比例18。

对比例19：添加复合发酵剂清酒乳杆菌CICC 22728,腐生葡萄球菌CICC 24371，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等；

S2：菌液(发酵剂)制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的清酒乳杆菌CICC 22728，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用MRS固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入营养肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至MRS肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

挑取保存于-80℃的腐生葡萄球菌CICC 24371，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3：发酵液制备：称取与步骤S1所得鳜鱼等重量的饮用水，倒入容器中，以饮用水的重量为100％计，加入3wt％盐、1wt％大葱、0.6wt％姜、0.1wt％八角、0.05wt％茴香、0.05wt％孜然、0.01wt％辣椒、0.01wt％花椒，以及加入清酒乳杆菌CICC 22728与腐生葡萄球菌CICC 24371菌液(发酵剂)；其中发酵液中含有混合得菌体5×10

S4、发酵：将步骤S1所得鳜鱼浸于发酵液中，鱼体用石头压实，在8℃下发酵5天，产品命名为对比例19。

对比例20：添加复合发酵剂戊糖片球菌CICC 22227，肉葡萄球菌CGMCC No.28186，清酒乳杆菌CICC 22728，具体方法如下：

S1：新鲜鳜鱼去内脏、鱼鳞、鱼鳃等；

S2：菌液(发酵剂)制备：

首先制备菌体，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的戊糖片球菌CICC 22227，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用MRS固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入营养肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至MRS肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

挑取保存于-80℃的肉葡萄球菌CGMCC NO28186，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用LB固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入LB肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至LB肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

挑取保存于-80℃的清酒乳杆菌CICC 22728，根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT2660-2010中F2.7使用MRS固体培养基37℃，24h对菌种进行复苏。挑取复苏后的单菌落挑入营养肉汤培养基中，在37℃，200rpm，摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至MRS肉汤培养基中，37℃下160rpm下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮并调至10

S3：发酵液制备：戊糖片球菌CICC 22227，肉葡萄球菌CGMCC No.28186，清酒乳杆菌CICC 22728按菌数3:1:1混合制备发酵液。

S4、发酵：将步骤S3所得发酵液按照1.0％接种量接种于S1所得鳜鱼中，在22℃下发酵4天，产品命名为对比例20。

上述对比例中涉及的菌株信息具体如下：

清酒乳杆菌CICC 22728，植物乳杆菌CICC 22213，干酪乳杆菌CICC 6104，毕赤酵母CICC 1960,格氏乳球菌CICC 21038，木糖葡萄球菌CICC 22943，戊糖片球菌CICC 22227，腐生葡萄球菌CICC 24371，乳酸芽孢杆菌CICC 20133购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；副干酪乳杆菌CGMCC 1.9089，腐生葡萄球菌CICC 24371，食窦魏斯氏菌CGMCC 16611，乳酸乳球菌CGMCC 16612，购自中国普通微生物保藏管理中心。

上述实施例和对比例中使用的培养基具体如下：

LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g/L；酵母浸粉5.0g/L；氯化钠10.0g/L；琼脂15.0g/L；PH值7.0±0.2

LB肉汤培养基：胰蛋白胨10.0g/L；酵母浸粉5.0g/L；氯化钠10.0g/L；PH值7.0±0.1。

YPD固体培养基：胨10.0g/L；葡萄糖20.0g/L；酵母浸出粉5.0g/L；琼脂14.0g/L。

YPD肉汤培养基：蛋白胨20.0g/L；葡萄糖20.0g/L；酵母浸粉10.0g/L；pH6.5±0.2。

MRS固体培养基：蛋白胨10.0g/L；牛肉浸粉8.0g/L；酵母浸粉4.0g/L；葡萄糖20.0g/L；磷酸氢二2.0g/L；柠檬酸氢二铵2.0g/L；乙酸钠5.0g/L；硫酸镁0.2g/L；硫酸锰0.04g/L；琼脂14.0g/L；吐温80 1.0g/L；pH值6.5±0.2。

MRS肉汤培养基：蛋白胨10.0g/L；牛肉粉8.0g/L；酵母粉4.0g/L；葡萄糖20.0g/L；磷酸氢二钾2.0g/L；柠檬酸氢二铵2.0g/L；乙酸钠5.0g/L；硫酸镁0.2g/L；硫酸锰0.04g/L；吐温80 1.0g/L；pH值5.7±0.2。

上述实施例和对比例中涉及的检测方法具体如下：

1、利用气相色谱-质谱-选择离子扫描(GC-MS-SIM)检测鱼肉中吲哚的含量

(1)标准品：吲哚＞99.5％(GC)

(2)样品前处理：

取2g样于25mL具塞试管中，用饱和氯化钠溶液漩涡混匀，加入2ml萃取剂(乙醚：正己烷＝1：1)进行萃取，涡旋震荡混匀1min，静置分层5min，取上清液于样品瓶中上机分析。

(3)GC-MS分析检测：

色谱分析条件：安捷伦DB-FFAP毛细色谱柱(60m×0.25mm×0.25μm)，进样口温度：250℃，载气为氦气，流速1.2mL/min，不分流模式，进样量2μl；程序升温：初始温度为40℃，保持1min。以8℃/min上升至80℃，不保持，以2.5℃/min上升至115℃，以8℃/min上升至155℃，不保持，再以5℃/min升温至220℃。

质谱条件：传输线温度250℃；电离方式(EI)；电子能量70eV；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；溶剂延迟7min；定性采用全扫描模式，质谱扫描范围30.00～350.00amu。

定量采用SIM模式，以带定量物质峰面积为纵坐标，带定量物质质量浓度为横坐标建立标准曲线，线性相关系数进行评估。

2、使用平板计数法对臭鳜鱼样品中的微生物进行培养

具体培养条件如下：在超净台中将鱼肉剪碎，取5g样品于无菌均质袋中，加入45mL的无菌生理盐水均质5min，用无菌生理盐水制备梯度稀释液，取1mL适当稀释液分散在琼脂平板中，假单胞菌使用CFC选择性培养基，37℃培养2天，大肠菌群使用VRBA固体平板，37℃培养1天，菌落总数使用PCA固体平板，37℃培养2天。结果表示为log10CFU/g。

3、测试结果

臭鳜鱼中特征风味物质含量结果如表1所示，可知实施例1，2，3中特征风味物质吲哚总量最高，是其他发酵组别的2.0～283.91倍，耐盐芽孢杆菌和肉葡萄球菌按照混合接入臭鳜鱼中，达到了改善风味的效果。其原因可能是耐盐芽孢杆菌和肉葡萄球菌起到了协同的作用，促进了吲哚这一特征风味物质的生成。此类物质在高浓度时均呈现鱼腥味或臭味，对臭鳜鱼的特征风味具有重要的贡献作用。因此，采用本发明直投式发酵剂能够显著改善产品的风味品质。

表1发酵臭鳜鱼中风味物质的含量(ng/100g)

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臭鳜鱼中假单胞菌、肠杆菌活菌数及菌落总数如表2所示，实施例1-3假单胞菌活菌数明显小于对比例1-18，肠杆菌活菌数在2.1～2.2log10 CFU/g之间，数量显著低于对比例1-18。表明耐盐芽孢杆菌SJ1-6于肉葡萄球菌CGMCC No.28186混合接种于鳜鱼进行发酵，可以有效降低样品中有害微生物的数量，提高产品安全性。

表2发酵臭鳜鱼中微生物的含量(log10 CFU/g)

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综上所述，本申请采用耐盐芽孢杆菌SJ1-6、肉葡萄球菌F2组合的复合发酵剂，该直投式发酵剂能够显著提高臭鳜鱼产品中吲哚等风味物质的含量，从而改善产品的风味品质。能够显著降低假单胞菌属和肠杆菌属微生物的活菌数，提高臭鳜鱼食用的生物安全性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。