原人参二醇型毛蕊铁线莲新苷类化合物、制备方法及应用

技术领域

本发明属于农药与植物化学技术领域，具体涉及一种原人参二醇型毛蕊铁线莲新苷类化合物、制备方法及应用。

背景技术

随着农药残留及抗药性增强带来的农产品质量安全及环境安全等问题，研发环境兼容性较好的新型植物源杀虫剂越来越得到人们的青睐。从植物资源中挖掘和发现具有新颖结构的生物活性天然产物，是新型农药创制的源头和热点研究领域，也是开发绿色环保型农药的有效途径之一。目前，以茶皂素、除虫菊素、印楝素、鱼藤酮等为有效成分，已开发出了一系列植物源杀虫剂产品。

毛蕊铁线莲Clematis lasiandra Maxim.为毛茛科铁线莲属的一种多年生草质藤本植物。茎攀援圆柱形，表面棕黑色或暗红色，有明显的六条纵纹，羽状复叶，花钟状，顶端反卷，萼片4枚，粉红色至紫红色，具有很高的观赏价值。主要分布于陕西、云南、四川、贵州、湖南等地的沟边、山坡荒地及灌木丛中，是我国铁线莲属分布最为广泛的品种之一，其根具有祛瘀、利尿、解毒的功效。

发明内容

基于上述目的，本发明提供了一种原人参二醇型毛蕊铁线莲新苷类化合物、制备方法及应用，该化合物为首次从毛蕊铁线莲中提取，具有杀虫活性和拒食活性，可广泛应用于制备杀虫剂和拒食剂。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案予以实现：

本发明的原人参二醇型毛蕊铁线莲新苷类化合物具有如下式(I)所示的化学结构式：

本发明还公开了一种原人参二醇型毛蕊铁线莲新苷类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，采集新鲜毛蕊铁线莲，干燥、粉碎，粉碎物用乙醇或甲醇冷浸提取，每4～7天更换一次溶剂，共提取3～4次，提取液合并浓缩，得到提取物；

步骤2，将提取物分散于水中，调制呈混悬状态，依次石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，将正丁醇萃取物浓缩后得毛蕊铁线莲总皂苷；

步骤3，对毛蕊铁线莲总皂苷进行正相梯度洗脱，洗脱液包括二氯甲烷、甲醇和水，其中，二氯甲烷、甲醇、水按体积比为100:1:0～1:1:0.5的比例混合；获得馏分1；

步骤4，对馏分1进行反相梯度洗脱，洗脱剂包括甲醇和水，甲醇和水的体积比为30：70～100：0；得到馏分2；

步骤5，采用液相色谱法对馏分2进行梯度洗脱，液相色谱条件为：洗脱剂包括甲醇、水和三氟乙酸，所述甲醇：水：三氟乙酸的体积比为50：50：0.1～100：0：0.1；检测波长为210～254nm；洗脱剂流速为8～10mL/min；得到毛蕊铁线莲新苷类化合物。

优选的，所述步骤1中溶剂为65％～80％乙醇或65％～80％甲醇；毛蕊铁线莲粉碎物与甲醇或乙醇溶剂的体积比为1:2～1:3。

优选的，所述步骤1中，粉碎后的毛蕊铁线莲过30～50目筛。

优选的，所述步骤2中萃取过程具体为：先用石油醚萃取3～4次，然后将石油醚萃取后的下层液相用乙酸乙酯萃取3～4次，最后将乙酸乙酯萃取后的下层液相用正丁醇萃取3～4次。

优选的，所述步骤2中石油醚、乙酸乙酯和正丁醇的体积比为1:1:1。

优选的，所述步骤3中正相梯度洗脱采用正相硅胶柱；所述步骤4中反相梯度洗脱采用C-18反相柱；所述步骤5采用YMC-C18色谱柱进行液相洗脱。

进一步的，所述步骤4的馏分2还通过葡聚糖凝胶色谱进行洗脱，洗脱剂包括甲醇和水，甲醇和水的体积比为1：1；得到馏分3；再将馏分3采用步骤5的液相色谱法进行洗脱。

本发明还公开了上述原人参二醇型毛蕊铁线莲新苷类化合物用作杀虫剂和拒食剂方面的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明首次从铁线莲属植物中提取出一种具有原人参二醇型毛蕊铁线莲新苷类化合物，该新的化合物对鳞翅目害虫小菜蛾和半翅目害虫豌豆蚜表现出了良好的胃毒活性、忌避活性和拒食活性，为进一步以本发明的毛蕊铁线莲新苷类化合物为有效成分研发新型植物源杀虫剂提供了重要理论依据，为农作物虫害的绿色防控和农产品质量安全保障提供了新的策略和思路。

具体实施方式

本发明首次从毛蕊铁线莲提取出一种原人参二醇型毛蕊铁线莲新苷类化合物，该化合物具有如下式(I)所示的化学结构式：

本发明的原人参二醇型毛蕊铁线莲新苷类化合物具体通过以下手段制备获得：

步骤1，采集新鲜毛蕊铁线莲阴干后、粉碎，粉碎物用乙醇或甲醇溶剂冷浸提取，每4～7天更换一次溶剂，共提取3～4次，提取液合并浓度，得到提取物；

本步骤中的毛蕊铁线莲粉碎后，过30～50目筛得到粉碎物；提取溶剂优选体积占比为65％～80％的乙醇或65％～80％的甲醇，其中毛蕊铁线莲粉碎物与乙醇溶剂的体积比为1:2～1:3。

步骤2，将提取物分散于水中，调制呈混悬状态，依次石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取多次，然后将正丁醇萃取物合并浓缩后得毛蕊铁线莲总皂苷。本发明优选的萃取过程具体为：先用石油醚萃取3～4次，然后将石油醚萃取后的下层液相用乙酸乙酯萃取3～4次，最后将乙酸乙酯萃取后的下层液相用正丁醇萃取3～4次。石油醚、乙酸乙酯和正丁醇的体积比为1:1:1。

将所得毛蕊铁线莲总皂苷依次经过正相洗脱、反相洗脱以及液相色谱洗脱后得到新化合物，具体过程为：

步骤3，对毛蕊铁线莲总皂苷进行正相梯度洗脱，本发明优选正相硅胶柱进行洗脱，洗脱液包括二氯甲烷、甲醇和水，其中，二氯甲烷、甲醇、水按体积比为100:1:0～1:1:0.5的比例混合；

步骤4，对馏分1进行反相梯度洗脱，本发明优选C-18反相柱，洗脱剂包括甲醇和水，甲醇和水的体积比为30:70～100:0；得到馏分2；

步骤5，采用液相色谱法对馏分2进行梯度洗脱，本发明优选的采用YMC-C18色谱柱进行梯度洗脱；本步骤的液相色谱条件为：洗脱剂包括甲醇、水和三氟乙酸，所述甲醇：水：三氟乙酸的体积比为50：50：0.1～100：0：0.1；检测波长为210～254nm；柱温为常温，一般为20～30℃；洗脱剂流速为8～10mL/min，保留时间在35～50min可获得毛蕊铁线莲新苷化合物。

本发明优选的，步骤4中在反相梯度洗脱后，还可将馏分2通过葡聚糖凝胶色谱进行洗脱，洗脱剂包括甲醇和水，甲醇和水的体积比为1：1；得到馏分3；再将馏分3采用步骤5记载的液相色谱法进行梯度洗脱，可进一步提高化合物的纯度。

经实验发现，本发明获得的原人参二醇型毛蕊铁线莲新苷类化合物用作杀虫剂和拒食剂方面的应用，尤其是防治蚜虫和小菜蛾的杀虫剂以及拒食剂方面。

另外，本发明的新化合物为具有原人参二醇结构的达玛烷型四环三萜皂苷类化合物，其结构与西洋参皂苷F1具有相同的皂苷元，结构差异仅在于糖基部分C-3位的葡萄糖被阿拉伯糖取代。毛蕊铁线莲是铁线莲属植物最为常见的品种之一，植物资源丰富，本发明发现的毛蕊铁线莲新苷A可作为西洋参等名贵中药材同类有效成分获取的资源替补，具有显著的经济效益。

以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例中，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。

实施例1

本实施例公开了原人参二醇型毛蕊铁线莲新苷类化合物的制备方法：

(1)毛蕊铁线莲70％提取物：新鲜采集的毛蕊铁线莲阴干后，用植物粉碎机粉碎，过40目筛，用70％乙醇冷浸提取，毛蕊铁线莲粉碎物与70％乙醇的体积比为1：2～3，每4～7天更换一次溶剂，共提取3～4次，最后合并浓缩，得到70％提取物。

(2)毛蕊铁线莲总皂苷的制备：将70％提取物分散于水中，调制呈混悬状态，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3～4次，正丁醇萃取物合并、浓缩后即得毛蕊铁线莲总皂苷。

(3)正相柱色谱分离：毛蕊铁线莲总皂苷上正相硅胶柱层析，用二氯甲烷：甲醇：水按体积比为100:1:0～1:1:0.5的比例进行梯度洗脱，二氯甲烷：甲醇：水的体积比为7：3：0.3洗脱时得馏分1。

(4)反相柱色谱分离：馏分1过C-18反相柱色谱，洗脱剂为甲醇：水，体积比为30:70～100：0，其中，馏分2为甲醇:水70：30洗脱得到。

(5)凝胶柱色谱分离：馏分2上Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱，以甲醇：水为洗脱剂，甲醇与水的体积比为1：1，得馏分3。

(6)HPLC制备分离：将馏分3上制备型HPLC，按如下条件进行制备：色谱柱为YMC-C18色谱柱(250×20mm,5μm)；洗脱剂为甲醇：水：三氟乙酸按体积比为50：50：0.1～100：0：0.1进行梯度洗脱；检测波长为210nm～254nm；柱温为常温；流速为9mL/min；进样量为500μL；保留时间在35～50min，可获得毛蕊铁线莲新苷类化合物。

以下对本实施例得到的毛蕊铁线莲新苷类化合物的结构进行鉴定：

由HRESIMS，ESIMS，

所得化合物为白色无定形粉末，Liebermann-Burchard反应阳性。ESIMS(+)给出化合物准分子离子峰m/z 811[M+Na]

以上波谱数据与文献报道西洋参皂苷F

24(S)构型中C-24位的化学位移在77.0–78.2之间，而24(R)构型中，C-24位的化学位移在79.9–80.6之间，化合物中C-24位的化学位移为δ80.5，所以确定C-24位为R构型[LiM,Liu F,Jin YR,Wang XZ,Wu Q,Liu Y,Li XW.Five new triterpenoid saponins fromthe rhizomes of Panacis majoris and their antiplatelet aggregationactivity.Planta Med,2017,83,351-357]。C-20位的构型定为S构型，因为C-21位的化学位移为27.8，NOESY图谱中，H-17(δ4.62)与H

结合HSQC，HMBC，

表1毛蕊铁线莲新苷A的

综合以上分析，化合物结构鉴定为3β,12β,20(S),24(R),25-五羟基达玛-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，命名为毛蕊铁线莲新苷A，结构确认如下：

实施例2

本实施例对实施例1制备的毛蕊铁线莲新苷类化合物对豆蚜的杀虫活性进行实验：

按照人工饲料混药法，具体参考文献：Geyter ED,Smagghe G,Rahbe Y,GeelenD.Triterpene saponins of Quillaja saponaria show strong aphicidal anddeterrent activity against the pea aphid Acyrthosiphon pisum.Pest ManagSci2012；68:164–169，以豌豆蚜为供试害虫，测试了毛蕊铁线莲新苷A的胃毒和忌避活性。

结果显示，实施例1制备的化合物对豌豆蚜在72h的LC

实施例3

本实施例对实施例1制备的毛蕊铁线莲新苷类化合物对小菜蛾的杀虫活性进行实验：

按照叶碟法，具体参考文献：Tian X,Li Y,Hao N,Su X,Du J,Hu J,Tian X.Theantifeedant,insecticidal and insect growth inhibitory activities oftriterpenoid saponins from Clematis aethusifolia Turcz against Plutellaxylostella(L.).Pest Manag Sci 2021；77:455–463，以小菜蛾为供试害虫，测试了毛蕊铁线莲新苷的胃毒和拒食活性。

结果显示，实施例1制备的化合物在浓度为1mg/mL时，对小菜蛾24h的拒食率为70％～92％；浓度为2mg/mL时，72h对小菜蛾的校正死亡率为65％～87％。

可以看出，本发明的新化合物对鳞翅目害虫小菜蛾和半翅目害虫豌豆蚜表现出了良好的胃毒活性、忌避活性和拒食活性。